مقالة منهجية

VirWaTest، طريقة نقطة الاستخدام للكشف عن الفيروسات في عينات المياه

DOI:

10.3791/59463

⸱

مايو 11, 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Viruses Contaminants of Water and Food (VIRCONT), Department of Genetics, Microbiology and Statistics, Section of Microbiology, Virology and Biotechnology, University of Barcelona, 2Grupo de Investigación Biodiversidad, Medio Ambiente y Salud (BIOMAS), Facultad de Ingenierías y Ciencias Agropecuarias (FICA), Ingeniería en Biotecnología, Universidad de las Américas, 3Municipal Laboratory - Waters of Mataró, 4GenIUL

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا نقدم VirWaTest، وهو طريقة بسيطة وبأسعار معقولة والمحمولة لتركيز وكشف الفيروسات من عينات المياه في نقطة الاستخدام.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد تلوث الفيروسات التي يفرزها البشر والحيوانات مصادر المياه وتشكل خطرا على صحة الإنسان عندما تستخدم هذه المياه للشرب والري الغذائي والغسيل وما إلى ذلك. مؤشر البكتيريا البرازية الكلاسيكية لا يتحقق دائما من وجود مسببات الأمراض الفيروسية وبالتالي فإن الكشف عن مسببات الأمراض الفيروسية والمؤشرات الفيروسية هو ذات الصلة من أجل اعتماد تدابير التخفيف من المخاطر، وخاصة في السيناريوهات الإنسانية وفي المناطق حيث الفاشيات الفيروسية المنقولة بالمياه متكررة.

وفي الوقت الحاضر، تتوفر عدة اختبارات تجارية تسمح بالقياس الكمي لبكتيريا مؤشرات البراز (FIB) للاختبار عند نقطة الاستخدام. غير أن هذه الاختبارات التجارية غير متاحة للكشف عن الفيروسات. يتطلب الكشف عن الفيروسات في عينات المياه البيئية تركيز عدة لترات في أحجام أصغر. وعلاوة على ذلك، فإن الكشف عن الفيروسات، بمجرد تمركزه، يعتمد على أساليب مثل استخراج الأحماض النووية والكشف الجزيئي (مثل تفاعل البوليميراز المتسلسل ( اختبار مضاد للفيروسات الكلى) للجينوم الفيروسي.

الطريقة الموصوفة هنا تسمح بتركيز الفيروسات من عينات المياه 10 L، فضلا عن استخراج الأحماض النووية الفيروسية في نقطة الاستخدام، مع معدات بسيطة ومحمولة. ويسمح ذلك باختبار عينات المياه عند نقطة الاستخدام لعدة فيروسات وهو مفيد في السيناريوهات الإنسانية، وكذلك في أي سياق لا يتوفر فيه مختبر مجهز. وبدلاً من ذلك، تسمح هذه الطريقة بتركيز الفيروسات الموجودة في عينات المياه وشحن المركز إلى مختبر في درجة حرارة الغرفة لمزيد من التحليل.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وخلال المراحل الأولى من أي حالة طوارئ إنسانية، فإن الحصول على إمدادات المياه النظيفة والمرافق الصحية والنظافة الصحية أمر بالغ الأهمية لبقاء المتضررين. ولذلك، فإن رصد نوعية المياه يمثل أولوية لمنع تفشي الأمراض المنقولة بالمياه. ومن المعروف جيدا أن المياه الملوثة هي في كثير من الأحيان أصل الأمراض، ولكن من الصعب في كثير من الأحيان تحديد مصادر الفاشيات الفيروسية مثل فيروس التهاب الكبد E (HEV)، حتى مع توافر الأساليب المختبرية التقليدية. ويستند التحكم في نوعية المياه على القياسالكمي لFIB 1،2،3،4. ومع ذلك، فقد تم توثيق على نطاق واسع أنه لا يوجد ارتباط بين عدم وجود FIB ووجود مسببات الأمراض الفيروسية المنقولة بالمياه مثل فيروس الروتا (RoV)، نوروفيروس (NoV)، أو HEV5،6. وبالتالي، فإن استخدام معايير نوعية المياه استناداً إلى FIB قد يؤدي إلى التقليل من تقدير المخاطر المرتبطة بوجود مسببات الأمراض الفيروسية المنقولة بالمياه. مراقبة فيروسات المؤشر، مثل الفيروسات الغدية البشرية (HAdV)، أو مسببات الأمراض المحددة ستكون مفيدة في تحديد التعرض للأمراض الفيروسية وتحديد المصدر المحتمل للعدوى البشرية7،8، 9و10 وفي التحقق من فعالية تدابير الصرف الصحي11.

وحتى الآن، كان الكشف عن الفيروسات في هذه السيناريوهات يعتمد على موظفين مهرة ولوجستيات معقدة. يهدف VirWaTest (virwatest.org) إلى تطوير طريقة بسيطة وميسورة التكلفة ومحمولة لتركيز الفيروسات من عينات المياه والكشف عنها لاحقاً عند نقطة الاستخدام.

ويستند تركيز الفيروس على مبدأ التذليل العضوي لعينات المياه 10 لتر، والتي يتم من خلالها استرداد الفيروسات في أحجام أصغر12،13. يتم جمع flocs وإضافتها إلى المخزن المؤقت الذي يتحلل الفيروسات ويمنع الأحماض النووية من التدهور عند تخزينها في درجة حرارة الغرفة لمدة لا تزيد عن 2 أسابيع.

ويستند أسلوب استخراج الأحماض النووية على استخدام الجسيمات المغناطيسية التي تحصل على الأحماض النووية الناضسة. ويمكن نقلها من مخزن للغسيل إلى آخر وأخيرا إلى المخزن المؤقت elution باستخدام ماصة المغناطيسية التي تعلق الجسيمات. يمكن شحن تعليق الأحماض النووية الفيروسية التي تم الحصول عليها إلى مختبر مرجعي حيث يمكن إجراء الكشف باستخدام الطرق الجزيئية على أساس PCR. لكل استخراج الحمض النووي، يتم اختبار اثنين من كميات مختلفة لاستبعاد تثبيط الأنزيمية التي نشأت من قبل العينة. وبدلاً من ذلك، مع الحد الأدنى من توافر المعدات، يمكن إجراء اختبارات PCR عند نقطة الاستخدام. تم تصميم العملية برمتها ليتم تنفيذها بشكلمستقل عن إمدادات الطاقة (الشكل 1).

وقد تم تكييف فحص كمية لـ PCR للكشف عن HAdV، الذي يفرزه البشر والموجود في عينات مياه الصرف الصحي بتركيزات عالية، ليتم تشغيله عند نقطة الاستخدام. يتم استخدام HAdV كمؤشرات فيروسية البراز البشري. كما تم تكييف PCR للقياس الكمي للبكتيريا MS2 منذ استخدام MS2 في VirWaTest كمراقبة العملية. يمكن تخصيص الأسلوب للكشف عن أي فيروس ذي أهمية.

وبعد التطوير، طبق المستعملون طريقة VirWaTest في مكانين مختلفين في جمهورية أفريقيا الوسطى وإكوادور، مما يوفر تغذية مرتدة بشأن تطبيق البروتوكول في حالات حقيقية.

على حد علمنا، هذا هو الإجراء الأول الذي يسمح بتركيز وكشف الفيروسات في نقطة الاستخدام، بغض النظر عن أي إمدادات الطاقة، والمعدات الكبيرة، وظروف التجميد / التبريد. من المستحسن جمع نسختين من كل عينة من عينات المياه من أجل الحصول على نتائج قوية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. إعداد والتعبئة والتغليف

ملاحظة: ترد في الجدول 1المواد/المعدات التي يتعين تعبئتها. استخدام القفازات للتعامل مع الكواشف اللازمة للسيطرة على العملية، والكواشف التركيز، الكواشف استخراج الحمض النووي والكواشف الكشف. ارتداء نظارات واقية للتعامل مع الكواشف اللازمة لاستخراج الحمض النووي.

  1. التحكم في العملية
    1. إعداد MS2 زراعة الأرصدة البكتريولوجية (مجموعة ثقافة النوع الأمريكي [ATCC] 15597-B1) التي تحتوي على 1 × 1010 PFU /mL في المختبر باتباع إجراء ISO 10705-1:199514.
    2. ثم، aliquot 10 ميكرولتر من التعليق لكل أنبوب يحتوي على 1 × 108 PFU في أنابيب 10 مل والسماح للمياه تتبخر في 37 درجة مئوية. استخدام أنبوب واحد لكل عينة المياه.
    3. بالإضافة إلى ذلك، إعداد أنبوب واحد يحتوي على 10 مل من المياه المقطر المعقمة لكل عينة تم جمعها.
  2. الكواشف التركيز
    1. لحل الحليب منزوع الدسم preflocculated (PSM)، استخدم الكميات التالية لتركيز خمس عينات من المياه سعة 10 لتر.
      1. إعداد أنبوب من البلاستيك يحتوي على 5 غرام من الحليب منزوع الدسم.
      2. إعداد كيس من البلاستيك سستة تحتوي على 16.66 غرام من أملاح البحر.
      3. إعداد زجاجة بلاستيكية تحتوي على 500 مل من الماء المقطر.
    2. إعداد الكواشف اللازمة لتعديل الرقم الهيدروجيني. استخدم الكميات التالية لضبط درجة الحموضة في PSM وخمس عينات مياه سعة 10 لتر.
      1. إضافة 5 غرام من حامض الستريك 1-هيدرات إلى أنبوب من البلاستيك 10 مل.
        تحذير: حمض الستريك يسبب تهيج خطير عندما يتعلق الأمر في اتصال مع العينين. إذا حدث ذلك، اشطف العين بحذر بالماء لعدة دقائق. إذا استمر التهيج، اطلب المشورة الطبية.
      2. وضع 2 غرام من هيدروكسيد الصوديوم في أنبوب من البلاستيك 10 مل.
        تحذير: يمكن أن يسبب هيدروكسيد الصوديوم حروق الجلد الشديدة وتلف العين. إذا ابتلع، شطف الفم. لا تحفز القيء. إذا كان يأتي في اتصال مع العينين، شطف بحذر مع الماء لعدة دقائق. ثم، اطلب المشورة الطبية.
      3. وضع 25 مل من الماء المقطر المعقمة في وعاء من البلاستيك.
      4. وضع 50 مل من الماء المقطر المعقمة في وعاء من البلاستيك.
    3. إعداد كيس تكييف العينة المستخدمة في التخثر، والحل الحافظة المستخدمة للحفاظ على الأحماض النووية، وكيس تحييد لتحييد المياه والمواد المهملة. استخدم الكميات التالية لكل عينة مياه سعة 10 لتر ليتم اختبارها.
      1. وضع 15 غرام من أملاح البحر و 8 غرام من حامض الستريك 1-هيدرات في كيس من البلاستيك سستة لكيس تكييف.
      2. إضافة 2 مل من العازلةlysis (جدول المواد) و 0.3 مل من حمض نووي عامل الحفاظ على (جدولالمواد)إلى أنبوب 5 مل.
        تحذير: يحتوي المخزن المؤقت للليسيس على غوانيدين ثيوسيانات وتريتون X-100. الاتصال مع حمض يحرر الغاز السام، وأنها ضارة إذا ابتلع، استنشاق، أو يأتي في اتصال مع الجلد. إذا ابتلع، شطف الفم. لا تحفز القيء. إذا كان يأتي في اتصال مع الجلد، وغسل مع الكثير من الماء. ثم، اطلب المشورة الطبية. حمض نووي الحفاظ على عامل يسبب تهيج الجلد والعين وضارة إذا ابتلع. إذا كان يأتي في اتصال مع الجلد أو العينين، شطف بالماء وفيرة لعدة دقائق. على أي حال، وخاصة إذا ابتلع والشعور بعدم الارتياح، وطلب المشورة الطبية.
      3. وضع 40 غرام من مسحوق المنظفات في أربعة أكياس بلاستيكية سستة.
        تحذير: مسحوق المنظفات يسبب تهيج العين. إذا كان يأتي في اتصال مع العينين، شطف بالماء وفيرة لعدة دقائق. إذا استمر التهيج أو إذا ابتلع، اطلب المشورة الطبية.
  3. الكواشف استخراج الحمض النووي
    1. وضع 50 درجة مئوية منالجسيمات المغناطيسية (جدول المواد) و 1 مل من الإيثانول 96٪ في أنبوب 5 مل التي تشكل العازلة ملزمة.
      تحذير: يحتوي المخزن المؤقت للجسيمات المغناطيسية على أزيد الصوديوم، الذي يشكل غازًا سامًا عندما يتعلق بملامسة الأحماض أو أيونات المعادن الثقيلة وهو سام إذا تم تناوله أو عندما يتعلق الأمر بملامسة الجلد. إذا تم تناولها أو في اتصال مع الجلد، شطف الفم أو الجلد بالماء الوفير والتماس المشورة الطبية. الإيثانول هو سائل قابل للاشتعال للغاية وبخار ويسبب تهيج العين خطيرة. الابتعاد عن الحرارة، والأسطح الساخنة، والشرر، وأي مصدر الإشعال الأخرى. إذا كان يأتي في اتصال مع الجلد أو العينين، شطف بالماء وفيرة. في حالة ابتلاع كميات كبيرة من الماء و / أو إذا استنشق، انتقل إلى الخارج في الهواء النقي. على أي حال، اطلب المشورة الطبية.
    2. إضافة 500 ميكرولتر، 600 ميكرولتر، و 200 ميكرولتر من مخازن الغسيل 1 و2 و3، على التوالي (جدولالمواد)،إلى ثلاثة أنابيب 2 مل.
      تحذير: تحتوي المخازن العازلة للغسيل على ثيوسيانات غوانيدينيوم وكلوريد غوانيدينيوم، وهي ضارة إذا استنشقأو ابتلع وتهيج الجلد والعينين. الاتصال مع الأحماض تطلق الغاز السام جدا. إذا كانت تأتي في اتصال مع الجلد أو العينين، شطف بالماء وفيرة. إذا ابتلع، شطف الفم بالماء الوفير. لا تحفز القيء. اطلب المشورة الطبية دائماً.
    3. إضافة 120 درجة مئوية منالعازلة elution (جدول المواد) إلى أنبوب 0.5 مل.
  4. الكواشف الكشف عن HAdV و MS2
    ملاحظة: يمكن تحليل اثنين من ردود الفعل استخراج حمض نووي مختلفة في وقت واحد في كل اختبار PCR إذا تم استخدام دراجة حرارية 8 جيدا. لجميع اختبارات PCR، وإعداد البيولوجيا الجزيئية المياه aliquoted في أنابيب 1.5 مل.
    1. الكشف عن HAdV
      1. إعداد مزيج يحتوي على 10 ميكرولتر من 22.5 ميكرومتر AdF التمهيدي إلى الأمام، 10 ميكرولتر من 22.5 μM AdRالتمهيدي العكسي، و 5 ميكرولتر من 11.25 ميكرومتر AdP التحقيق (الجدول 2).
      2. إضافة 2.5 درجة مئوية من المزيج إلى أنابيب 1 إلى 8 من شريط أنبوب. دعه يجف في درجة حرارة الغرفة، وإغلاق الأنابيب، والحفاظ عليها محمية من الضوء.
      3. قطع الشريط تقسيمه إلى شريطين: أنابيب 1-5 وأنابيب 6-8.
      4. إعداد تخفيف تسلسلي لتعليق الحمض النووي الذي يحتوي على تسلسل النيوكليوتيدات في منطقة HAdV المضخمة. الهواء الجاف 1 ميكرولتر من المعلقاتالتي تحتوي على 1 × 10 5، 1 × 107،و 1 × 109 GC / مل في أنابيب 6-8.
        ملاحظة: الحفاظ على الأنابيب التي تحتوي على التمهيديات، والتحقيق، وتعليق الهواء المجففة محمية من الضوء.
    2. الكشف عن MS2
      1. إعداد مزيج يحتوي على 10 ميكرولتر من 25 ميكرومتر بكسون-2F التمهيدي إلى الأمام، 10 ميكرولتر من 25 ميكرومتر بكسون-2R التمهيديالعكسي، و 2.5 ميكرولتر من 25 ميكرومتر PecP-2 التحقيق (الجدول 2).
      2. إضافة 2.25 درجة مئوية من المزيج إلى أنابيب 1 إلى 8 من شريط أنبوب. دعه يجف في درجة حرارة الغرفة، وإغلاق الأنابيب، والحفاظ عليها محمية من الضوء.
      3. قطع الشريط تقسيمه إلى شريطين: أنابيب 1-5 وأنابيب 6-8.
      4. انتقل كما هو الحال في الخطوة 1.4.1.4 ولكن استخدم تعليق قياسي مصمم لMS2 بدلاً من ذلك.

2. التركيز الفيروسي

ملاحظة: استخدم القفازات في جميع الأوقات أثناء جمع العينات، وإعداد الكاشف، وflocculation، وجمع flocs، وإجراءات التخلص من النفايات. ارتداء نظارات واقية أثناء إجراء إعداد الكاشف.

  1. جمع العينات
    1. جمع عينة المياه 10 لتر في دلو أسفل شقة مع غطاء. جمع ما لا يقل عن نسختين متماثلتين لكل عينة.
      ملاحظة: من المهم استخدام دلاء واضحة لتصور بيليه. إذا كانت عينة الماء تحتوي على مواد معلقة (على سبيل المثال، والمياه والطحالب)، والسماح لها الرواسب، وبعد ذلك، جمع supernatant المياه في دلو جديد.
    2. تسجيل حجم جمعها، فضلا عن الموقع وتاريخ جمع، لكل عينة من المياه.
    3. وضع النمام المغناطيسي متصلا بطارية تحت دعم دلو ووضع دلو يحتوي على عينة المياه على دعمها.
      ملاحظة: ابحث عن سطح مستو في مكان جديد والحفاظ على الدلاء التي تحتوي على عينات المياه من أشعة الشمس المباشرة.
  2. إعداد الكواشف
    1. الكواشف تعديل الرقم الهيدروجيني
      1. صب مسحوق حامض الستريك وكريات هيدروكسيد الصوديوم في الأواني التي تحتوي على 25 و 50 مل من الماء المقطر، على التوالي.
      2. مصافحة بلطف باليد حتى يذوب حمض الستريك وهيدروكسيد الصوديوم تماما.
        تحذير: لا تصب الماء فوق كريات هيدروكسيد الصوديوم. بدلا من ذلك، صب الكريات هيدروكسيد الصوديوم على الماء.
    2. حليب منزوع الدسم
      1. وضع حقيبة الوقوف على النمام المغناطيسي وصب 500 مل من الماء المقطر في ذلك. إسقاط المغناطيس التحريك داخل الحقيبة وبدوره على النمام المغناطيسي.
      2. صب محتويات كيس ملح البحر وأنبوب الحليب منزوع الدسم في كيس الوقوف ويحرك لمدة 5 دقائق في سرعة متوسطة لإذابتها.
      3. إضافة 3 مل من حامض الستريك إلى حل PSM باستخدام ماصة باستور للتأكد من أن الحموضة تقع بين 3.4 و 3.6. قياس الحموضة من الحل PSM باستخدام شرائط مؤشر الحموضة. إضافة كميات أصغر من حامض الستريك وهيدروكسيد الصوديوم كما يحصل على الحموضة أقرب إلى 3.5.
      4. إيقاف النمام المغناطيسي وتأكد من أن flocs مرئية. استخدام مصباح يدوي للمساعدة في تصور flocs.
  3. التجلط
    1. إسقاط المغناطيس التحريك في الماء، وتعيين النمام المغناطيسي في أقصى سرعة، وتشغيله. تأكد من أن المغناطيس التحريك يبدأ الغزل.
    2. إضافة 10 مل من الماء المقطر إلى أنبوب التحكم في العملية. عكس الأنبوب عدة مرات لإعادة ترطيب المخزون الفيروسي وصب الحل في الماء.
    3. صب محتويات كيس تكييف عينة واحدة في الماء ويحرك لمدة 5 دقائق.
    4. قياس درجة الحموضة من عينة المياه باستخدام شرائط مؤشر درجة الحموضة. إضافة بضع قطرات من حامض الستريك أو هيدروكسيد الصوديوم إلى عينة المياه للتأكد من أن درجة الحموضة تقع بين 3.4 و 3.6. إضافة كميات أصغر من حامض الستريك وهيدروكسيد الصوديوم كما يحصل على الحموضة أقرب إلى 3.5.
    5. إضافة 100 مل من حل PSM باستخدام حاوية 100 مل.
    6. ختم دلو مع الغطاء، وتعيين النمام المغناطيسي في الحد الأدنى من السرعة، وترك الماء التحريك لمدة 8 ساعة.
    7. إيقاف النمام المغناطيسي والسماح للمياه لا يزال لمدة 5 ساعة على الأقل للسماح flocs لتسوية.
  4. مجموعة فلوك
    1. بناء نظام siphoning تتألف من وحدة تحكم ماصة، واثنين من الماصات، وأنبوب من البلاستيك، لاستنشاق supernatant المياه لتفريغ المياه على flocs.
      1. إرفاق ماصة 10 مل نهاية الشريط إلى وحدة تحكم ماصة. ثم، إرفاق غيض من الماصة إلى أنبوب من البلاستيك.
      2. إزالة مرشح من 10 مل الماصة مفتوحة طرف باستخدام ملاقط وإرفاق ماصة إلى أنبوب من البلاستيك.
    2. ضع دلو فارغ على الأرض.
    3. تزج غيض من ماصة مفتوحة الطرف في الماء. تأكد من إبقائها قريبة من سطح الماء لتجنب إزعاج الفلوك. يستنشق الماء حتى يصل إلى ماصة الشريط نهاية.
    4. قرصة أنبوب من البلاستيك في نهاية تعلق على ماصة الشريط نهاية وفصلها من الماصة.
    5. ضع الأنبوب في دلو فارغ. الإفراج عن الضغط على أنبوب للسماح تدفق المياه في دلو فارغة.
    6. قرصة أنبوب من البلاستيك لوقف تدفق المياه عندما يكون مستوى المياه على وشك الوصول إلى المغناطيس التحريك ونقل ماصة بعيدا عن دلو.
    7. هز الدلو لإعادة تعليق الفلوك وصب لهم في كيس من البلاستيك 500 مل الوقوف متابعة. السماح لflocs لتسوية ل1 ساعة أكثر.
    8. يستنشق بعناية supernatant المياه باستخدام ماصة 50 مل ووحدة تحكم ماصة يدوية، وتجنب إزعاج flocs.
    9. يستنشق الفلوك باستخدام ماصة 100 مل ونقلها إلى أنبوب الطرد المركزي 50 مل تخرج. لاحظ أسفل الحجم النهائي من تركيز العينة ونقل 1 مل منه إلى أنبوب 5 مل يحتوي على الحل الحافظة، وذلك باستخدام ماصة باستور.
      ملاحظة: من المهم أن يتم إخراج أنبوب الطرد المركزي بحيث يمكن قياس الحجم النهائي للعينة المركزة بأكبر قدر ممكن من الدقة وتسجيلها.
    10. إجراء استخراج الحمض النووي في هذا المجال. بدلا ً من ذلك، قم بتخزين الحل الحافظة الذي يحتوي على الفيروسات عند درجة حرارة 20-30 درجة مئوية لمدة تصل إلى 15 يومًا أو شحنها إلى مختبر مرجعي لمزيد من التحليل.
  5. التخلص من النفايات وإعادة استخدام المواد
    1. إضافة محتويات كيس عامل تحييد إلى دلو يحتوي على المياه المهملة. اخلط الماء، ثم اتركه لا يزال لمدة 30 دقيقة.
    2. التخلص من المياه المعالجة كنفايات عامة.
    3. ضع الماصات والأنبوب البلاستيكي داخل الدلو. ملء دلو بالماء وتصب في محتويات كيس عامل تحييد واحد.
    4. اغسلها لمدة 30 دقيقة على الأقل لتعقيمها وشطفها بالماء النظيف الوفير لإزالة أي عامل تحييد المتبقية.

3. استخراج الحمض النووي

ملاحظة: استخدام القفازات وارتداء دائما نظارات واقية أثناء إجراء استخراج الحمض النووي.

  1. عملية الماصات المغناطيسية
    1. الحصول على التعرف على تشغيل الماصة المغناطيسية قبل إجراء استخراج.
  2. استخراج الحمض النووي
    1. ترتيب الأنابيب التي تحتوي على الكواشف المطلوبة للاستخراج في رف، من اليسار إلى اليمين: المخزن المؤقت ملزمة، المخازن المؤقتة الغسيل، والمخزن المؤقت elution. تعيين العدد المناسب من الأنابيب وفقا لعدد العينات أو النسخ المتماثلة التي يجري تحليلها.
    2. نقل 1 مل من التركيز عينة إلى أنبوب يحتوي على العازلة ملزمة، وذلك باستخدام ماصة باستور المتاح. عكس الأنبوب 8x إلى 10x لتجانس الحل.
    3. احتضان الحل في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق في حين خلط باستمرار، إما باستخدام مدار بالطاقة الشمسية أو يدويا.
    4. جمع الجسيمات المغناطيسية باستخدام الماصة المغناطيسية وطرف نظيفة، والتي يمكن إعادة استخدامها لمخازن الغسيل الثلاثة.
    5. الإفراج عن الجسيمات المغناطيسية في الأنبوب الذي يحتوي على 500 درجة مئوية من الغسيل العازلة 1. غسلها عن طريق هز بلطف الحل مع غيض لمدة 30 ق وجمعها.
    6. نقل الجسيمات المغناطيسية إلى أنبوب يحتوي على 600 درجة مئوية من الغسيل العازلة 2. غسلها عن طريق هز بلطف الحل مع غيض لمدة 30 ق وجمعها.
    7. نقل الجسيمات المغناطيسية إلى أنبوب يحتوي على 200 ميكرولتر من الغسيل العازلة 3. غسلها عن طريق هز بلطف الحل مع غيض لمدة 30 ق وجمعها.
    8. الإفراج عن الجسيمات المغناطيسية في الأنبوب الذي يحتوي على المخزن المؤقت elution وتجاهل غيض.
    9. احتضان الحل في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق في حين خلط باستمرار، وذلك باستخدام المدار بالطاقة الشمسية.
      ملاحظة: خلط الجسيمات المغناطيسية في المخزن المؤقت elution خطوة حاسمة. في حالة عدم وجود مدار، مزيج باستمرار باليد خلال وقت الحضانة.
    10. استبدال غيض على الماصة المغناطيسية من قبل واحد جديد وجمع الجسيمات المغناطيسية من المخزن المؤقت elution. تأكد من إزالة الجسيمات المغناطيسية بالكامل من المخزن المؤقت للإلوتيون لأنها يمكن أن تتداخل مع أساليب الكشف الجزيئي.
    11. تخلص من الطرف مع الجسيمات المرفقة به. تابع تحليل PCR، أو اشحن المخزن المؤقت للإلعاق إلى مختبر مرجعي، أو قم بتخزين المخزن المؤقت للإهليل في درجة حرارة 4 درجة مئوية لمزيد من التحليل.

4. الكشف الفيروسي مع بطارية تعمل ثمانية أنبوب في الوقت الحقيقي thermocycler

ملاحظة: استخدام القفازات وارتداء دائما نظارات واقية أثناء إجراء الكشف عن الحمض النووي. استبدال القفازات لأخرى جديدة عند إجراء تجربة PCR جديدة لتجنب التلوث المتبادل.

  1. HAdV PCR الكمية
    1. أضف 14 ميكرولتر من المياه الخالية من النوكل إلى الأنابيب 2 و4 و5.
    2. إضافة 4 ميكرولتر من مزيج PCR إلى أنابيب 1-5.
    3. إضافة 14 ميكرولتر من استخراج الحمض النووي من العينة A إلى أنبوب 1 و 14 ميكرولتر من العينة B إلى أنبوب 3.
    4. إضافة 2 ميكرولتر من الأحماض النووية المستخرجة من عينة A إلى أنبوب 2 و 2 ميكرولتر من العينة B إلى أنبوب 4. أغلق الشريط ذو الإنبوب الخمسة
    5. أضف 14 ميكرولتر من المياه الخالية من النوكل إلى الأنابيب 6 و7 و8.
    6. إضافة 4 ميكرولتر من هذا المزيج إلى أنابيب 6 و 7 و 8، وإغلاقها.
    7. وضع كلا الشريطين في دراجة حرارية وحددتشغيل المناسبة (الجدول 3).
    8. تخلص من أنبوب الماء وحافظ على حمض النوى المستخرج في الثلاجة، إن أمكن، أو، إن لم يكن كذلك، في مكان جديد محمي من الضوء في حالة الحاجة إلى إجراء اختبار ثان.
    9. تنظيف micropipettes، والرف، ومواد العمل، وجميع المواد بشكل صحيح مع منظف حمض نووي، وتجاهل كيس من البلاستيك التي تحتوي على طرف المستخدمة، والقفازات، والأنابيب.
      تحذير: مزيل الحمض النووي هو سائل قابل للاشتعال جدا والبخار. لا تتنفس في رذاذ رذاذ وتجنب أي اتصال من السائل مع العينين أو الجلد. خلاف ذلك، شطف على الفور بالماء وفيرة والتماس المشورة الطبية.
    10. جمع النتائج وتحليل البيانات التي تم الحصول عليها.
  2. MS2 PCR الكمية
    1. أضف 14 ميكرولتر من المياه الخالية من النوكل إلى الأنابيب 2 و4 و5.
    2. إضافة 4 ميكرولتر من مزيج PCR و 0.5 ميكرولتر من إنزيم النسخ العكسي إلى أنابيب 1-5.
    3. إضافة 14 ميكرولتر من استخراج الحمض النووي من العينة A إلى أنبوب 1 و 14 ميكرولتر من العينة B إلى أنبوب 3.
    4. إضافة 1 ميكرولتر من الأحماض النووية المستخرجة من عينة A إلى أنبوب 2 و 1 ميكرولتر من العينة B إلى أنبوب 4. أغلق الشريط ذو الإنبوب الخمسة
    5. إضافة 15.5 ميكرولتر من المياه الخالية من النوكل إلى الأنابيب 5 و 6 و 7 و 8، وإغلاقها.
    6. إضافة 4 ميكرولتر من مزيج PCR و 0.5 ميكرولتر من إنزيم النسخ العكسي إلى الأنابيب 6 و7 و8.
    7. وضع كلا الشريطين في دراجة حرارية وحددتشغيل المناسبة (الجدول 3).
    8. المضي قدما على النحو المبين في الخطوات 4-1-8 إلى 4-1-10.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تطوير الأسلوب

وقد تم تطوير هذا الإجراء في مختبر الفيروسات الملوثة من المياه والغذاء بالتعاون مع GenIUL وأوكسفام Intermón. وهو يتألف من ثلاث خطوات مختلفة. أول واحد، تركيز الجسيمات الفيروسية، هو التكيف مع طريقة حليب منزوع الدسم flocculation وصفها سابقا12،17،18. تم تعديل الطريقة الأصلية لتكون مستقلة عن إمدادات الطاقة، أبسط...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

طريقة VirWaTest تمكن من تركيز الفيروسات واستخراج الحمض النووي من عينات المياه في نقطة الاستخدام من قبل المستخدمين غير ذوي الخبرة. وهو بروتوكول بأسعار معقولة وسريعة وبسيطة. ويستند التركيز على مبدأ التفلح العضوي باستخدام الحليب منزوع الدسم، والتي من خلالها انخفاض درجة الحموضة وظروف الموصلية العالية جعل بروتينات الحليب منزوع الدسم تجميعها في flocs الفيروسات adsorb إلى. عندما الرواسب flocs، فمن السهل لجمعها، مما يجعل من الممكن التركيز 10 لتر من الماء، في حين أن ultracentrifugation التقليدية لا يمكن التعامل مع كميات كبيرة من ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

كان VirWaTest مشروع بحثي ممول من برنامج صناديق الابتكار الإنساني التابع لـ ELHRA (تعزيز التعلم والبحث من أجل المساعدة الإنسانية). ويعترف المؤلفون بأفرقة المياه والصرف الصحي والنظافة الصحية التي تكرمت بالتعاون في هذه الدراسة. ومولت تحليل العينات في إكوادور منظمة أوكسفام في إكوادور وإدارة بحوث جامعة الأمريكتين. BRT.17.01. S. Bofill-Mas هو زميل سيرا هنتر في جامعة برشلونة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
5x HOT FIREPol Probe qPCR Mix Plus (ROX)يتضمن Solis BioDyne08-14-00001 5xHOT FIREPol Probe qPCR Mix Plus من Solis Biodyne (qPCR Mix) ، 50 تفاعلا
8-Microtube Strips مع أغطيةdD Biolab840637المظهر الجانبي المنخفض ، والجدران الرقيقة ، والمكيفة لبطاريات PCR الكمية والنوعية
ومحولات الطاقة للنمام المغناطيسيGenIUL900011674يتضمن طاقة سيارة 12 فولت
محول دعم الجرافةGenIUL900011648دعم الألومنيوم
، 10 لترCater4You10LTRبولي بروبيلين ، مقاوم للعبث ،
أنبوب طرد مركزي بلون شفاف ، 50 ملLabBoxCTSP-E50-050بولي بروبيلين ، معقم ، متخرج ، مع تنورة
حامض الستريك 1-هيدرات ، 500 جرامPanReac AppliChem1410181211نقي ، فارما ، 1 كيلوغرام
زجاجة PET شفافةLabBoxFPET-500-088لون شفاف ، PET ، غطاء غير مدرج
Difco منزوع الدسم ، 500 جرامبيكتون ديكنسون232100
درع الحمض النووي / الحمض النووي الريبي المجفف ، 250 ملZymo ResearchR1100-250وسط الحفاظ على الحمض النووي / الحمض النووي الريبي ، 250 مل
Easy9 Pipeette ControllerLabBoxEAS9-001-0010.3 & مرشح m ، ماصات من 0.1 إلى 100 مل ، حامل ماصة سيليكون قابل للتعقيم
بالتعقيم أنبوب Eppendorf ، 0.5 ملEppendorf0030121023Polypropilene ،
أنبوب Eppendorf بقفل آمن ، 2 ملEppendorf0030120094Polypropilene ، أنبوب Eppendorf ذو القفل الآمن
، 5 ملdD Biolab999542البولي بروبيلين ، معقم ،
إيثانول متدرج 96٪ V / V ، 1 لترPanreac AppliChem361085-1611للأشعة فوق البنفسجية ، IR & nbsp ؛ و HPLC
مختبر الملقطLabBoxFORS-007-002رقيقة ، نهاية منحنية ، L = 120 مم
محرك مغناطيسيGenIUL900017000علامة تعمل بالبطارية
dD Biolab929203أسود ، طرف ناعم للغاية ، مقاوم للماء ، سريع الجفاف ، للبلاستيك والأواني الزجاجية
Micro Rota-Rack للأنابيب الدقيقةdD Biolab377824 وحدات ، الطول × العرض × الارتفاع = 208 × 100 × 100 مم
Mini8 في الوقت الحقيقي PCR CyclerCoyote Biosciences ، ChinaMini-8المحمولة ، تعمل مع إمدادات الطاقة 12 فولت أو البطاريات الخارجية ، قناتان ، سعة 8 أنابيب
NucliSens Lysis BufferBiomerieux200292الكواشف لما يصل إلى 48 عزلة ، تخزينها في درجة حرارة محيطة
ماصة مصلية مفتوحة الطرف ، 10 ملDeltalab900136Nمعقم ، ملفوف بشكل فردي (ورق / بلاستيك)
برغي PE PP28LabBoxTP28-004-020لزجاجات PET
شريط مؤشر الأس الهيدروجينيLabBoxWSPH-001-001نطاق الأس الهيدروجيني 2.8 إلى الرقم الهيدروجيني 4.4 ، 50 شريطا لكل عبوة
اختبار بلاستيكيQuimikals300913يشمل غطاء
البولي إيثيلين باستور ماصةLabBoxPIPP-003-500متخرج ، 7 مل الحجم الكلي ،
قارورة لولبية غير معقمة من مادة البولي بروبلين مع غطاء لولبي ، غطاء لولبي 409726 دلتالاب سعة 150مل ، معقم ، متدرج حتى 100 مل
قارورة لولبية من مادة البولي بروبلين مع غطاء لولبي ، غطاء لولبي 60 ملDeltalab409526G، معقم ، متدرج حتى 50 مل
مسحوق مسحوق المنظفات-صابون مسحوق عادي لغسل الملابس
كابلات الطاقة للنمام المغناطيسيGenIUL900011692التوصيل بين البطاريات وأدوات التقليب المغناطيسية
أداة QuickPick المغناطيسيةBioNobile24001أداة محمولة باليد للجزيئات المغناطيسية
نصائح QuickPick في صندوقBioNobile24296RNase خالية من التعقيم ، 96 وحدة
QuickPick XL gDNA الجسيمات المغناطيسيةBioNobile SN511003.2 مل
أملاح البحرSigma-AldrichS9883-500Gخليط ملح اصطناعي يشبه إلى حد كبير تركيبة الأملاح الذائبة لمياه المحيط
أنابيب سيليكونLabBoxSILT-006-005لفة 5 أمتار ، داخلية   ø x خارجية   ø ؛ = 6 × 10 مم
كريات هيدروكسيد الصوديوم ، 98.5 - 100.5٪كريات 28244295 كيماويات VWR، 1 كجم
منصة دوارة شمسيةSOL-EXPERT Group70020لوحة أكريليك ، 10 دورة في الدقيقة ، تدعم ما يصل إلى 300 جرام
SOLiCript 1-Step Probe KitSolis BioDyne08-57-00250يتضمن مزيج المسبار المكون من خطوة واحدة من Solis Biodyne 5x (qPCR Mix) و 40x مزيج SOLIScript ذو الخطوة الواحدة (إنزيم النسخ العكسي) ، 250 تفاعلا
SPEEDTOOLS طقم استخراج فيروسات الحمض النووي الريبيBioTools21.141-4197يتضمن المخزن المؤقت BAW من BioTools (Washing Buffer 1) و BAV3 Buffer (Washing Buffer 2 و 3) و BRE Buffer (Elution Buffer).
SpinBar مغناطيس التحريك ثماني السطوحdD Biolab045926الحلقة المحورية ، L x & nbsp ؛ ø ؛ = 38 × 8 مم ،
ماصة مصلية بنهاية الشريط الأزرق ، 10 ملDeltalabPN10E1معقمة ، ملفوفة بشكل فردي (ورق / بلاستيك)
ماصة مصلية بنهاية الشريط ، 50 ملDeltalab900043معقمة ، ملفوفة بشكل فردي (ورق / بلاستيك)
Termi-DNA-Tor - مزيلالحمض النوويBioTools22001-4291مزيل الأحماض النووية والبكتيريا والفطريات والميكوبلازما من المواد والأسطح ،
كاشف البيولوجيا الجزيئية المائية 450 مل ، 1 لترSigma-AldrichW4502-1Lخالي من النوياز والبروتياز ، 0.1 مو ؛ م كيس
دوامة باك مفلتر ، 540 ملدلتالاب200361حقيبة عادية بسحاب قاع ثابت
LabBoxBZIP-080-100بولي إيثيلين ، الطول × العرض = 120 × 80 مم
دلو حليب غطاء أنبوب

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. The Sphere Project. The Sphere Project: Humanitarian Charter and Minimum Standards in Humanitarian Response. , Practical Action Publishing. Rugby, UK. https://www.spherestandards.org/wp-content/uploads/2018/06/Sphere_Handbook_2011_English.pdf (2011).
  2. Bartram, J., et al. Water Safety Plan Manual:Step-by-step risk management for drinking-water suppliers. , WHO Press. Geneva, Switzerland. http://apps.who.int/iris/handle/10665/75141 (2009).
  3. World Health Organization. Guidelines for Drinking-water Quality. , WHO Press. Geneva, Switzerland. http://whqlibdoc.who.int/publications/2011/9789241548151_eng.pdf?ua=1 (2011).
  4. World Health Organization. 25 Years Progress on Sanitation and Drinking Water. , WHO Press. Geneva, Switzerland. http://apps.who.int/iris/bitstream/10665/177752/1/9789241509145_eng.pdf?ua=1 (2015).
  5. Girones, R., et al. Molecular detection of pathogens in water - The pros and cons of molecular techniques. Water Research. 44 (15), 4325-4339 (2010).
  6. Rodriguez-Manzano, J., et al. Standard and new fecal indicators and pathogens in sewage treatment plants, microbiological parameters for improving the control of reclaimed water. Water Science and Technology. 66 (12), 2517-2523 (2012).
  7. Puig, M., et al. Detection of adenoviruses and enteroviruses in polluted waters by nested PCR amplification. Applied and Environmental Microbiology. 60 (8), 2963-2970 (1994).
  8. Carter, M. J. Enterically infecting viruses: Pathogenicity, transmission and significance for food and waterborne infection. Journal of Applied Microbiology. 98 (6), 1354-1380 (2005).
  9. Bofill-Mas, S., Pina, S., Girones, R. Documenting the epidemiologic patterns of polyomaviruses in human populations by studying their presence in urban sewage. Applied and Environmental Microbiology. 66 (1), 238-245 (2000).
  10. Bofill-Mas, S., et al. Quantification and stability of human adenoviruses and polyomavirus JCPyV in wastewater matrices. Applied and Environmental Microbiology. 72 (12), 7894-7896 (2006).
  11. Rames, E., Roiko, A., Stratton, H., Macdonald, J. Technical aspects of using human adenovirus as a viral water quality indicator. Water Research. 96, 308-326 (2016).
  12. Calgua, B., et al. Development and application of a one-step low cost procedure to concentrate viruses from seawater samples. Journal of Virological Methods. 153 (2), 79-83 (2008).
  13. Bofill-Mas, S., et al. Cost-effective method for microbial source tracking using specific human and animal viruses. Journal of Visualized Experiments. 58, 5-9 (2011).
  14. International Organization for Standardization. ISO 10705-1:1995: Water quality - Detection and enumeration of bacteriophages - Part 1: Enumeration of F-specific RNA bacteriophages. , https://www.iso.org/standard/18794.html (1995).
  15. Hernroth, B. E., Conden-Hansson, A. C., Rehnstam-Holm, A. S., Girones, R., Allard, A. K. Environmental factors influencing human viral pathogens and their potential indicator organisms in the blue mussel, Mytilus edulis: the first Scandinavian report. Applied and Environmental Microbiology. 68 (9), 4523-4533 (2002).
  16. Pecson, B. M., Martin, L. V., Kohn, T. Quantitative PCR for determining the infectivity of bacteriophage MS2 upon inactivation by heat, UV-B radiation, and singlet oxygen: Advantages and limitations of an enzymatic treatment to reduce false-positive results. Applied and Environmental Microbiology. 75 (17), 5544-5554 (2009).
  17. Calgua, B., Barardi, C. R. M., Bofill-Mas, S., Rodriguez-Manzano, J., Girones, R. Detection and quantitation of infectious human adenoviruses and JC polyomaviruses in water by immunofluorescence assay. Journal of Virological Methods. 171 (1), 1-7 (2011).
  18. Bofill-Mas, S., et al. Cost-effective method for microbial source tracking using specific human and animal viruses. Journal of Visualized Experiments. (58), e2820(2011).
  19. Gonzales-Gustavson, E., et al. Characterization of the efficiency and uncertainty of skimmed milk flocculation for the simultaneous concentration and quantification of water-borne viruses, bacteria and protozoa. Journal of Microbiological Methods. 134, 46-53 (2017).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

VirWaTest PCR MS2

مقالات ذات صلة