يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

نموذج Murine متقدم للتهاب الكبد غير الكحولية بالتعاون مع مرض السكري من النوع 2

6.7K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/59470

⸱

أبريل 26, 2019

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Endocrinology & Metabolism Charité - Universitätsmedizin Berlin, corporate member of Freie Universität Berlin, Humboldt-Universität zu Berlin, 2Berlin Institute of Health (BIH), 3Berlin-Brandenburg Center for Regenerative Therapies (BCRT), Charité - Universitätsmedizin Berlin, corporate member of Freie Universität Berlin, Humboldt-Universität zu Berlin, 4DZHK (German Centre for Cardiovascular Research), 5Institute of Medical Immunology, Charité - Universitätsmedizin Berlin, corporate member of Freie Universität Berlin, Humboldt-Universität zu Berlin, 6Julius Wolff Institute (JWI) and Center for Musculoskeletal Surgery, Charité - Universitätsmedizin Berlin, Berlin, Germany, corporate member of Freie Universität Berlin, Humboldt-Universität zu Berlin

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

ويوصف نموذج الحيوانية القوارض التي يسببها النظام الغذائي بسيطه وموثوق بها للتهاب الكبد غير الكحولية (ناش) ، يتحقق من خلال الإسكان غير SPF من الماشية وأداره نظام غذائي محدد عاليه الدسم. ونحن نوضح تحديد الخلايا المناعية الكبدية والدهنية لتلخيص الظروف المناعية البشرية من خلال تعريض الفئران للجراثيم البيئية.

الملخص

ترتبط السمنة بالتهابات المزمنة منخفضه الدرجة ومقاومه الانسولين ، مما يساهم في زيادة انتشار الامراض الايضيه المزمنة ، مثل مرض السكري من النوع 2 والتهاب الكبد غير الكحولي (ناش). وقد إنشات الأبحاث الاخيره ان الخلايا المناعية الموالية للالتهابات التسلل السمنة المفرطة الانسجه الدهنية والكبد. النظر إلى الاهميه الناشئة للخلايا المناعية في سياق التوازن الأيضي ، هناك حاجه ماسه لقياس وتوصيف تعديلاتها اثناء تطور مرض السكري من النوع 2 و ناش. ومع ذلك ، النماذج الحيوانية التي تحفز الميزات الفسيولوجية نموذجيه من ناش الإنسان متناثرة.

في هذه المقالة ، ونحن نقدم بروتوكولا مفصلا لتحديد مجموعات الخلايا المناعية المعزولة من الكبد والانسجه الدهنية في نموذج الماوس موثوق بها من ناش ، التي انشاتها السكن حمية عاليه الدسم (HFD) الفئران تحت ظروف غير محدده خاليه من العوامل الممرضة (SPF) دون حاجز لمده سبعه أسابيع علي الأقل. ونحن نظهر التعامل مع الفئران في ظروف غير SPF ، والهضم من الانسجه وتحديد الضامة ، القاتل الطبيعي (NK) الخلايا ، الخلايا الجذعية ، B و T الخلايا الفرعية من خلال تدفق الخلوية. يتم توفير مخططات التدفق الخلوي التمثيلي من الفئران SPF HFD والفئران غير SPF. للحصول علي بيانات موثوقه والتفسيره ، فان استخدام الأجسام المضادة ، والطرق الدقيقة والدقيقة لهضم الانسجه والنابضة السليمة في تجارب قياس التدفق الخلوي هي عناصر حاسمه.

التدخل لاستعاده التعرض مستضد الفسيولوجية في الفئران عن طريق السكن لهم في ظروف غير SPF والتعرض غير محدده للمستضدات الميكروبية يمكن ان توفر أداه ذات صله للتحقيق في الصلة بين التعديلات المناعية ، التي يسببها النظام الغذائي السمنة والمضاعفات ذات الصلة علي المدى الطويل.

المقدمة

السمنة هي اضطراب متعدد العوامل وعامل خطر رئيسي للاصابه بامراض القلب ، والسكتة الدماغية ، والتهاب الكبد غير الكحولي (ناش) ، ومرض السكري من النوع 2 (T2D) وبعض أنواع السرطان. ويتزايد انتشار السمنة بسرعة علي الصعيد العالمي. واليوم ، 2,100,000,000 شخصا-اي ما يقارب 30% من سكان العالم-يعانون من السمنة المفرطة أو الوزن الزائد1. يمكن ان تؤدي مقاومه الانسولين المرتبطة بالسمنة إلى T2D ، عندما تفشل خلايا بيتا البنكرياس المستنفدة لتعويض الحاجة المتزايدة للانسولين للحفاظ علي التوازن الجلوكوز2.

تتكون الانسجه الدهنية من أنواع مختلفه من الخلايا بما في ذلك الخلايا الشحمية والبطانات الليفية والخلايا المناعية. اثناء تطور السمنة ، يمكن ان تؤدي التغيرات في عدد ونشاط الخلايا المناعية إلى التهاب منخفض الدرجة من الانسجه الدهنية التضخمية3،4. علي وجه التحديد, وقد وجد ان الإفراط في استهلاك الطاقة, يرافقه مستويات مرتفعه بشكل مزمن من الجلوكوز في الدم, الدهون الثلاثية والأحماض الدهنية الحرة, يؤدي إلى نقص الأكسجين الشحمي, الإجهاد الشبكي إندوبلازمي, ضعف وظيفة الميتوكوندريا إفراز السايسيسيني المعزز ، مما يؤدي إلى تنشيط الخلايا المناعية الدهنية الموالية للالتهابات5،6. ركزت الأبحاث السابقة أساسا علي المناعة الفطرية ، ولكن الخلايا المناعية المتكيفة مؤخرا (خلايا T و B) برزت كمنظمين مهمين لتوازن الجلوكوز. انها تمتلك التهابات ( بما في ذلك خلايا CD8 + t ، Th1 ، والخلايا B) أو الوظائف التنظيمية في المقام الأول (بما في ذلك الخلايا t (treg) التنظيمية ، Th2 الخلايا) ويمكن ان تؤدي إلى تفاقم أو حماية ضد مقاومه الانسولين7،8 , 9-الآن

وعلاوة علي ذلك ، اقترحت عده أليات لشرح كيفيه زيادة السمنة التهاب الكبد ، بما في ذلك زيادة إنتاج السايتوكينات بالانسجه الدهنية10. ناش ، الشكل التقدمي لمرض الكبد الدهني غير الكحولية والعبء الصحي الرئيسي في البلدان المتقدمة ، ويتميز نسيجيا بخلايا الكبد المتضخمة ، وتراكم الدهون ، والتليف والتهاب بيريسيلولار وقد تقدم تليف الكبد ، والمرحلة الاخيره من مرض كبدي أو سرطان الخلايا الكبدية. نظام العديد من (علي سبيل المثال ميثيونين والكولين نقص النظام الغذائي11) ومن المعروف للحث علي الامراض الكبدية مثل ناش في نماذج الحيوانية غير البشرية, ولكن معظم هذه النهج لا تلخص الظروف البشرية ناش والايضيه لها العواقب لأنها اما تتطلب محدده الجينات الضربة القاضية, التلاعب الغذائية غير الفسيولوجية أو عدم وجود مقاومه الانسولين نموذجيه من ناش الإنسان. وعلاوة علي ذلك ، فان فهمنا للأليات الاساسيه للامراض الايضيه يقوم حاليا علي التجارب التي أجريت مع فئران المختبرات الموجودة تحت ظروف المرض الخاصة الخالية من العوامل الممرضة (SPF). ان عائقه تسهيلات بشكل غير طبيعي صحية ولا يعتبر التنوع جرثوميه أناس سوفت تلاقيت, اي يمكن سببت صعوبات في الترجمة عمليه من دراسات حيوانيه إلى مقاربه سريريه12,13 , أربعه عشر

للتحقيق في مختلف الخلايا المناعية الفرعية في الانسجه الدهنية والكبد خلال تطوير مقاومه الانسولين و ناش في نموذج الماوس المتقدمة استنساخ الظروف المناعية البشرية ، وكانت الفئران التي تقع في أقفاص الفردية في شبه معقمه ظروف دون حاجز. الفئران التي تقع تحت مستضد الظروف المعرضة وضعت ناش مثل علم الامراض الكبد بالفعل بعد 15 أسابيع من الحمية الغذائية عاليه الدسم (HFD) التغذية13. بالمقارنة مع الفئران المتطابقة مع العمر SPF انها وضعت steatosis فوق الترقوة ، تسلل الكبد وتنشيط الخلايا المناعية.

تصف هذه المخطوطة تحليلا قويا لقياس التدفق الخلوي لتحديد وحساب مجموعات الخلايا المناعية من الانسجه الدهنية للماوس والكبد في نموذج من ناش. تحليل تدفق الخلوي يسمح الكشف عن المعلمات متعددة من الخلايا الفردية في وقت واحد علي النقيض من RT-PCR أو مناعي النهج.

وباختصار ، تقدم دراستنا نموذج الماوس لفتره قصيرة HFD للتحقيق في تطور مقاومه الانسولين و ناش واليات الكامنة التي تظهر أيضا الإخلاص للحالة البشرية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

وقد أجريت هذه الدراسة وفقا لدليل رعاية واستخدام المختبرات التابعة للمعاهد الوطنية للصحة وقانون رعاية الماشية تحت اشراف لجنتنا المؤسسية للعناية بالماشية واستخدامها. وأجريت بروتوكولات الحيوانية وفقا للمبادئ التوجيهية الاخلاقيه المؤسسية لل Charité برلين ، ألمانيا ، وتمت الموافقة عليها من قبل يمين für Gesundheit und Soziales والامتثال للمبادئ التوجيهية للوصول.

1. نموذج الحيوانية التي يسببها النظام الغذائي من التهاب الكبد Steatohepatitis

  1. نقل الفئران (C57Bl/6J ، الذكور) إلى السكن غير SPF في سن 4 أسابيع وتعريضهم بشكل مستمر لمجموعه واسعه من مسببات الامراض البيئية/المستضدات. ضمان التعرض عن طريق المناولة اليومية للحيوانات المختبرية كما يتم توزيع المستضدات عن طريق المرور الجوي بهذه الطريقة.
  2. الحفاظ علي الفئران (C57Bl/6J ، الذكور ، 12 أسابيع من العمر) في نظم الشيخوخة المفتوحة مع الفلاتر التقليدية علي 12 h:12 ح الضوء/دوره الظلام في درجه حرارة 22 درجه مئوية. لا تشع أو الاوتوكلاف النظام الغذائي التجريبي والفراش. الوصول إلى مرفق السكن الحيواني دون قناع أو hairnet. فتح الأبواب بين الغرف الحيوانية. لا تستخدم الدش الهوائي.
  3. ضمان المناولة اليومية للحيوانات المختبرية وتبديل الغرف علي أساس منتظم بحيث يتم توزيع المستضدات عن طريق المرور الجوي. تكمله المساكن القذرة مع التعرض الميكروبية اليومية غير محدده للمستضدات من الفراش من الثدييات الحيوانية مختبر التي تقع في غرف بجوار فئران المختبر.
  4. قياس نسب الذاكرةCD44-CD62L- العاكس وخلايا CD8 + T في الدم والطحال باستخدام قياس التدفق الخلوي (كما هو موضح في refefence13).
    ملاحظه: وفي هذا الصدد ، قمنا بتعريف زيادة قدرها 20 ٪ من خلايا الذاكرة CD8 + t من خلايا CD8 + t كدليل علي التعرض الميكروبي الكافي.
  5. بدء hfd (60 kj ٪ من الدهون ، و 19 كج ٪ من البروتينات و 21 كج ٪ من الكربوهيدرات واستهلاك الإعلان حسب من الماء مع محتوي السكروز 6 ٪ مع الفئران الذكور C57Bl/6j القديمة لمده خمسه أسابيع ل7-15 الأسبوع. يجب ان تحتوي علي HFD 60 ٪ kJ من الدهون (كما هو موضح أعلاه) من أجل الحث علي تطوير مقاومه الانسولين طوال التجربة.
    ملاحظه: وينبغي ان يؤدي تلطيخ الهيماتولين والخصائص النسيجية والبالونات الكبدية ، والهيئات مالوري denk ، وتسلل الخلايا المناعية و تنكس دهني فوق الترقوة يجب العثور عليها لإثبات مرض الكبد مثل ناش (كما هو مبين في المرجع 13).

2. اعداد الكواشف والحلول

  1. اعداد 70 ٪ الايثانول ، الفوسفات مخزنه المالحة (تلفزيوني ، دون الكالسيوم والمغنيسيوم) تستكمل مع 0.5 ٪ بوسنيا وACK (الأمونيوم كلوريد البوتاسيوم) تحلل العازلة.
  2. تلطيخ العازلة
    1. حل 10 مل من مصل الساق الجنينية (FCS) في 500 mL من تلفزيوني للحصول علي 2 ٪ FCS تلفزيوني. مكان تلطيخ العازلة علي الجليد قبل الاستخدام.
    2. تخزين الحل في زجاجه بلاستيكية في 4 درجه مئوية.
  3. محلول كولاجيناز لهضم الانسجه الدهنية
    1. ذوبت 2.5 [غ] من بقري مصل زلال ([بوسني]) في 500 [مل] من [ببس] ان ينال 0.5% [بوسني]/[ببس].
    2. حل 74.5 غرام من CaCl2 في 10 مل من 0.5 ٪ بوسني/تلفزيوني للحصول علي حل 10 مم cacl2 .
    3. أضافه 1 ملغ من نوع كولاجيناز الثاني (انظر جدول المواد) إلى كل مل من 0.5 ٪ بوسنيا مع 10 مم cacl2 تلفزيوني.
    4. اعداد 3 مل من محلول هضم كولاجيناز لكل غرام من عينه الانسجه الدهنية. اعداد حل كولاجيناز الطازجة لكل عزله.
  4. محلول كولاجيناز لهضم انسجه الكبد
    1. ذوب 2.5 غرام من الجيش الصربي البوسني في 500 مل من محلول الملح المتوازن هانك (HBSS) للحصول علي 0.5 ٪ من الجيش البوسني الصربي HBSS.
    2. أضافه 10 مل من FCS في 500 مل من 0.5 ٪ من الجيش الصربي البوسني/HBSS للحصول علي 2 ٪ FCS 0.5 ٪ جيش صرب الجمهورية/HBSS.
    3. أضافه 0.5 ملغ من نوع كولاجيناز IV (انظر جدول المواد) إلى كل مل من 2 ٪ FCS 0.5 ٪ بوسني/hbss.
    4. أضافه 0.02 ملغ من DNase لكل مل من 2 ٪ FCS 0.5 ٪ جيش صرب الجمهورية/HBSS محلول كولاجيناز.
    5. اعداد 13 مل من محلول هضم كولاجيناز لكل عينه من انسجه الكبد.
    6. اعداد حل كولاجيناز الطازجة لكل عزله.

3. جيل من المعلقات خليه واحده

  1. هضم الانسجه الدهنية
    1. موت ببطء الفئران عن طريق التخدير الايزوفلواني تليها خلع عنق الرحم. رش الصدر مع 70 ٪ الايثانول. بعناية اجراء شق مركزي 5-6 سم من خلال الجدار البطني والبطن علي طول طول القفص الصدري لفضح التجويف الجنبي والقلب.
      ملاحظه: لا تضر الاجهزه الاساسيه والحفاظ علي نصائح مقص.
    2. حقن ما لا يقل عن 10 مل من محلول ملحي 0.9 ٪ في قمة البطين الأيسر باستخدام ابره 26 G.
      ملاحظه: ويلاحظ التروية الناجحة بالابيضاض من الكبد.
    3. فتح التجويف البريتوني مع مقص وقطع منصات الدهون بيريجونادال علي كل جانب مع مقص منحني غرامه. تشريح انسجه الغدد التناسلية مع مقص منحني غرامه وتزن الانسجه الدهنية.
    4. أداء التفكك الميكانيكية باستخدام مقص وقطع الانسجه الدهنية إلى قطع دقيقه في طبق بيتري في 4 درجه مئوية. نقل الانسجه الدهنية إلى 50 mL أنابيب الطرد المركزي المخروطية وشطف طبق بيتري مع 1 مل من 0.5 ٪ بوسني/تلفزيوني.
    5. أضافه 3 مل من محلول هضم الانسجه الدهنية (كما هو معد في الخطوة 2.3) لكل غرام من الانسجه الدهنية. احتضان محلول الانسجه الدهنية في 37 درجه مئوية لمده 20 دقيقه تحت اهتزاز لطيف (200 دوره في الدقيقة).
    6. أضافه 5 مل من 0.5 ٪ بوسني/تلفزيوني لكل غرام من الانسجه الدهنية ومكان علي الجليد. تريلوريتي الحل مرات عديده مع ماصه المصلية 10 مل وتمريرها من خلال مصفاه (100 μm) مع المعونة من الغطاس.
    7. جهاز الطرد المركزي في 500 x g ل 10 دقيقه في 4 °c.
    8. أزاله جزء الخلايا الشحمية العائمة عن طريق السحب. أعاده تعليق الخلية بيليه (كسر الاوعيه الدموية اللحمية) في 1 مل من ACK تحلل العازلة (انظر جدول المواد). أضافه 10 مل من 2 ٪ FCS تلفزيوني.
    9. جهاز الطرد المركزي في 500 x g ل 10 دقيقه في 4 °c.
    10. Decant ماده طافي وأعاده التعليق بيليه الخلية في 250 μl من 2 ٪ FCS تلفزيوني.
    11. احسب عدد الخلايا القابلة للحياة علي مقياس الكريات الدموية باستخدام الاستبعاد الأزرق الترلون.
  2. هضم انسجه الكبد
    1. تخزين الكبد في أنبوب الطرد المركزي المخروطي مليئه بالفيديو والنقل علي الجليد.
    2. أداء التفكك الميكانيكية باستخدام الطوابع حقنه في طبق بيتري في 4 درجه مئوية. وضع تشريح انسجه الكبد في أنبوب الطرد المركزي المخروطية 50 mL التي تحتوي علي 10 مل من محلول هضم الكبد الدافئ. شطف طبق بيتري مع 3 مل من محلول هضم الكبد.
    3. احتضان محلول انسجه الكبد عند 37 درجه مئوية لمده 20 دقيقه تحت الاهتزاز اللطيف (200 دوره في الدقيقة).
    4. أضافه 20 مل من HBSS. تريلوريتي الحل مرات عديده مع ماصه المصلية 10 مل وتمريرها من خلال مصفاه (100 μm) مع المعونة من الغطاس.
    5. جهاز الطرد المركزي في 500 x g ل 10 دقيقه في 4 °c. Decant الفائقة وأعاده تعليق بيليه الخلية في 20 مل من HBSS.
    6. الطرد المركزي في 30 × ز لمده 1 دقيقه في درجه حرارة الغرفة لأزاله مصفوفة الخلايا الكبدية. تجاهل الخلية بيليه.
    7. الطرد المركزي ماده طافي في 500 x g ل 10 دقيقه في 4 ° c. أعاده تعليق بيليه في 10 مل من 33 ٪ انخفاض كثافة اللزوجة منخفضه الانحدار الحل المتوسط (انظر جدول المواد) في hbss تليها طرد (800 x g؛ 30 دقيقه ؛ درجه حرارة الغرفة ؛ لا الفرامل).
    8. أعاده تعليق بيليه في 1 مل من ACK تحلل العازلة واحتضان لمده 4 دقائق في درجه حرارة الغرفة. ثم أضافه 10 مل من HBSS.
      ملاحظه: للتخلص من ماده طافي يستنشق ماده طافي مع بيني (الخلايا الكبدية) بعناية فائقه مع ماصه نقل (قدر الإمكان دون أخذ بيليه مع الخلايا المناعية والكريات الحمراء).
    9. تمرير الخلايا من خلال مصفاه 30 μm في أنبوب الطرد المركزي المخروطية 15 مل والطرد المركزي في 500 x g لمده 10 دقيقه في 4 ° c. Decant ماده طافي وأعاده التعليق بيليه الخلية في 250 μl من 2 ٪ FCS تلفزيوني.
    10. احسب عدد الخلايا القابلة للحياة علي مقياس الكريات الدموية باستخدام الاستبعاد الأزرق الترلون.

4. تلطيخ السطح

  1. اعداد مزيج الأجسام المضادة للخلايا الفرعية T (اللوحة 1) والخلايا المناعية الفطرية (الفريق 2) علي النحو المبين في الجدول 1 والجدول 2. يتم تحسين وحدات التخزين لعينه واحده (100 μL) فيما يتعلق بتركيزات الأجسام المضادة.
    ملاحظه: اللمفاويات والخلايا المناعية الفطرية تقدم الاختلافات في الفلورية وينبغي تحليلها بشكل منفصل.
  2. استخدام ما يصل إلى 3 × 106 خلايا في 100 μl في أنبوب البوليسترين facs لتلطيخ السطح. لمنع مستقبلات Fc أضافه 10 μL من مكافحه CD16/CD32 الأجسام المضادة (المخفف 1:100) واحتضان لمده 10 دقيقه علي الجليد. استخدم نموذج عنصر تحكم سلبي غير ملون لضبط التشتت الجانبي (SSC) والمبعثر الامامي (FSC) لتحديد موقع محتوي الخلية السالبة.
  3. دوامه وأضافه الحجم المناسب من خليط الأجسام المضادة للفريق 1 والفريق 2. أضافه 1 μL من صبغ القدرة علي البقاء لكل عينه للسماح للتمييز الخلية الحية والميتة. احتضان لمده 20 دقيقه في 4 درجه مئوية ومحمية من الضوء.
  4. غسل مرتين مع 2 مل من 2 ٪ FCS تلفزيوني وأجهزه الطرد المركزي في 300 x g لمده 5 دقائق في 4 ° c.
  5. أعاده التعليق علي بيليه الخلية في 300 μL من 2 ٪ FCS تلفزيوني وتخزين في 4 درجه مئوية حتى تحليل FACS.
    ملاحظه: قبل البدء في قياس خلايا المرور من خلال مصفاه الخلية 30 μm في أنبوب البوليسترين FACS ودوامه. تم تنفيذ التدفق الخلوي مع الخلايا المسمية المخزنة في 2% FCS في الاذاعه التلفزيونية في 4 درجه مئوية ل 1-3 h. يجب تحليل الخلايا في أقرب وقت ممكن للحصول علي نتائج محسنه.

5. التدفق الخلوي التعويض ، والاستحواذ ، والصب

  1. تشغيل عينه التحكم السلبية غير الملون لتعيين FSC و SSC وضبط الفولتية لتدفق المضخم للكشف عن السكان البويضات والتمييز بين الحطام وخلايا قابله للحياة. استبعاد الحطام والخلايا الميتة.
    ملاحظه: قابليه تعليق الخلية من الكبد قد تكون اقل من القدرة علي البقاء من تعليق الخلية من الانسجه الدهنية بيريجونادال بسبب خطوه فصل كثافة اضافيه.
  2. تشغيل عينات التحكم الملون واحد لتعويض متعدد ألوان.
    ملاحظه: ويمكن أيضا استخدام حبات التقاط الأجسام المضادة للتكيف مع التداخل الطيفي إذا كان عدد خلايا الخلية التي يهمها الأمر منخفضا جدا للتعويض عن استخدام الخلايا. للكشف عن الإشارات الفلورية المحتملة من الخلايا مضان ناقص واحد (FMO) الضوابط لكل الأجسام المضادة ويوصي ولكن لم يتم تطبيقها في هذا البروتوكول.
  3. بدء القياس ، وجمع عدد مناسب من الاحداث (علي الأقل 50,000 الاحداث) وتسجيل البيانات التجريبية.
  4. تصدير ملفات البيانات FCS للتحليل وتعيين استراتيجية النابضة. بوابه عليCD45 + البويضات لتحديد السكان الخلايا اللاحقة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

البروتوكول الموصوف يسمح بتوصيف علامات السطح للخلايا المناعية الفطرية والمتكيفة المعزولة عن الانسجه الدهنية بيريجونادال الmurine والكبد في نموذج من ناش الناجم عن النظام الغذائي. في هذا النموذج, وقد حفزت ناش من قبل أداره HFD بالاضافه إلى السكروز (6 ٪) في مياه الشرب لمده 7 إلى 15 أسبوعا في الفئران C57Bl/6J ، كما ذكر سابقا13. والاهم من ذلك ، تم إيواء الفئران في ظروف شبه معقمه ، التالي تعرضت للمستضدات البيئية طوال التجربة. الفئران التغذية HFD الموجودة في ظروف SPF والفئران الحمية تشاو الموجودة تحت SPF و...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

التهاب الكبد الدهني له علاقة قويه مع تشوات الأيض مثل السمنة ، ومقاومه الانسولين وعسر الدهون15. تشير الدراسات المتعددة إلى ان التهاب الانسجه الدهنية يمكن ان يدفع التسبب في مرض السكري من النوع 2 ، بما في ذلك مستويات الخلايا المتغيرة لكل من الجهاز المناعي الفطري والمتكيف4،5،16،17 . الاضافه إلى ذلك ، فقد وجد ان السمنة ينظم تفعيل المسارات المناعية ، والتي يمكن ان تؤدي إلى مضا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

وليس لدي المؤلفين ما يفصحون عنه.

شكر وتقدير

نشكر Anke جوريتش ، ديانا Woellner ، الدكتور Kathrin ويت و كورنيليا هيكمان للحصول علي المساعدة في الإجراءات التجريبية وبنيامين تيكاتزي من Biolegend للحصول علي تعليقات مفيده علي استراتيجية النابضة. تم دعم J.S. من قبل المنحة هيلهولتز (ICEMED). وقد دعمت هذه الدراسة بمنح من وحده البحوث الاكلينيكيه التابعة لمعهد برلين للصحة ، و "منحه BCRT" التي قدمتها وزاره التعليم والبحوث الاتحادية المانيه ومؤسسه اينشتاين. K.S.-B. و D.V. مموله من قبل FOR2165.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
100 وميكرو ؛ مصافي الخلايا المية Falcon352340
1 مل حقنة BD   309659
26 جم × 5/8 إبر BD 305115
أطباق بتري 35 ملم  فالكون353001
40 & ميكرو; مصافي الخلايا المية Falcon352340
ACK تحلل عازلة جيبكوA1049201
أليكسا فلور 700 المضاد للفأر CD45Biolegend 103127AB_493714 (BioLegend Cat. رقم 103127)
برنامج التحليل FlowJo 10.0.8
APC المضاد للفأر CD11c الأجسام المضادةBiolegend  117309AB_313778 (BioLegend Cat. رقم 117309)
APC المضاد للفأر KLRG1 (MAFA) الأجسام المضادةBiolegend   ؛138411AB_10645509 (BioLegend Cat. رقم 138411)
BV421 المضاد للفأر CD127 الأجسام المضادةBiolegend   ؛135023AB_10897948 (BioLegend Cat. رقم 135023)
BV421 المضاد للفأر F4 / 80 الأجسام المضادةBiolegend   ؛123131AB_10901171 (BioLegend Cat. رقم 123131)
BV605 المضاد للفأر CD279 (PD-1) الأجسام المضادةBiolegend   ؛135219AB_11125371 (BioLegend Cat. رقم 135219)
BV605 المضاد للفأر NK-1.1 الأجسام المضادةBiolegend   ؛108739AB_2562273 (BioLegend Cat. رقم 108739)
BV650 المضاد للفأر / الأجسام المضادة البشرية CD11bBiolegend   ؛101239AB_11125575 (BioLegend Cat. رقم 101239)
BV711 المضاد للفأر / الإنسان B220 الأجسام المضادةBiolegend   ؛103255AB_2563491 (BioLegend Cat. رقم 103255)
BV785 المضاد للفأر CD8a الأجسام المضادةBiolegend   ؛100749AB_11218801 (BioLegend Cat. رقم 100749)
C57Bl / 6J فئران ، ذكر ، 5 أسابيع من العمر   ؛Forschungseinrichtungen fü r experimentelle Medizin (FEM)
CaCl2 Charité - Universitä tsmedizin BerlinA119.1 
Collagenase NB 4G أثبتت الصف  SERVA 11427513
Collagenase Typ I ورثينجتون LS004197
أنبوب الطرد المركزي المخروطي 15 مل & nbsp ؛Falcon352096
أنبوب الطرد المركزي المخروطي 50 mL & nbsp ؛فالكون352070
DNAse   سيجما ألدريتش 4716728001
مصل الأبقار الجنينية BiochromS0115
30 & micro ؛ m Celltrics 400422316
FITC المضادة للفأر CD3 الأجسام المضادةBiolegend  100203AB_312660 (BioLegend Cat. رقم 100203)
قياس التدفق الخلوي BD-LSR Fortessa 
ملقط سيجما ألدريتش F4142-1EA
HBSS التحليل الحيوي GmBH 085021-0500 
نظام غذائي غني بالدهون SSNIFE15741 &ndash ؛ 34 60 كيلو جول٪ من الدهون ، 19 & thinsp ؛ كيلو جول٪ من البروتينات ، و 21 & thinsp ؛ kJ٪ من مقص تشريح الكربوهيدرات
الدقيقة سيجما ألدريتش S3146المستخدمة لأغراض التشريح  
PE المضادة للفأر CD25 الأجسام المضادةBiolegend  101903AB_312846 (BioLegend Cat. رقم 101903)
PE / Cy7 المضاد للفأر CD62L الأجسام المضادةBiolegend   ؛104417AB_313102 (BioLegend Cat. رقم 104417)
PE / Cy7 المضاد للفأر I-A / I-E (MHCII) الأجسام المضادةBiolegend   ؛107629AB_2290801 (BioLegend Cat. رقم 107629)
PE / Dazzle 594 الأجسام المضادة CD4 المضادة للفأرBiolegend   ؛100565AB_2563684 (BioLegend Cat. رقم 100565)
Percoll solution BiochromL6115
PerCP / Cy5.5 الأجسام المضادة CD44 المضادة للفأرBiolegend   ؛103031AB_2076206 (BioLegend Cat. رقم 103031)
PerCP / Cy5.5 المضاد للفأر Gr-1 الأجسام المضادةBiolegend   ؛108427AB_893561 (BioLegend Cat. رقم 108427)
محلول ملحي مخزن بالفوسفات   ؛جيبكو12559069
أنابيب مستديرة القاع مع غطاء مصفاة الخليةSTEMCELL Technologies  38030
TruStain fcX مضاد للفأر CD16 / 32Biolegend   ؛101301AB_312800 (BioLegend Cat. رقم 101301)
Trypan Blue سيجما ألدريتش T6146
Zombie NIR Fixable Viability KitBiolegend  423105وصمة عار viablity 
برنامج مرشح

المراجع

  1. Guh, D. P., et al. The incidence of co-morbidities related to obesity and overweight: A systematic review and meta-analysis. BMC Public Health. 9, 88(2009).
  2. Prentki, M. Islet β cell failure in type. J Clin Invest. 116 (7), 1802-1812 (2006).
  3. Shoelson, S. E., Lee, J., Goldfine, A. B. Inflammation and insulin resistance. Journal of Clinical Investigation. 116 (7), 1793-1801 (2006).
  4. Kahn, S. E., Hull, R. L., Utzschneider, K. M. Mechanisms linking obesity to insulin resistance and type 2 diabetes. Nature. 444, 840(2006).
  5. Exley, M. A., Hand, L., O'Shea, D., Lynch, L. Interplay between the immune system and adipose tissue in obesity. Journal of Endocrinology. 223 (2), R41-R48 (2014).
  6. Ferrante, A. W. Macrophages, fat, and the emergence of immunometabolism. Journal of Clinical Investigation. 123 (12), 4992-4993 (2013).
  7. Winer, D. A., et al. B cells promote insulin resistance through modulation of T cells and production of pathogenic IgG antibodies. Nature Medicine. 17, 610(2011).
  8. Onodera, T., et al. Adipose tissue macrophages induce PPARγ-high FOXP3(+) regulatory T cells. Scientific Reports. 5, (2015).
  9. Lackey, D. E., Olefsky, J. M. Regulation of metabolism by the innate immune system. Nature Reviews Endocrinology. 12, 15(2015).
  10. Calle, E. E., Kaaks, R. Overweight, obesity and cancer: epidemiological evidence and proposed mechanisms. Nature Reviews Cancer. 4, 579(2004).
  11. Ibrahim, S. H., Hirsova, P., Malhi, H., Gores, G. J. Animal Models of Nonalcoholic Steatohepatitis: Eat, Delete, and Inflame. Digestive Diseases and Sciences. 61 (5), 1325-1336 (2016).
  12. Beura, L. K., et al. Recapitulating adult human immune traits in laboratory mice by normalizing environment. Nature. 532 (7600), 512-516 (2016).
  13. Sbierski-Kind, J., et al. Distinct Housing Conditions Reveal a Major Impact of Adaptive Immunity on the Course of Obesity-Induced Type 2 Diabetes. Frontiers in Immunology. 9 (1069), (2018).
  14. Japp, A. S., et al. Wild immunology assessed by multidimensional mass cytometry. Cytometry Part A. 91 (1), 85-95 (2017).
  15. Benedict, M., Zhang, X. Non-alcoholic fatty liver disease: An expanded review. World Journal of Hepatology. 9 (16), 715-732 (2017).
  16. McNelis, J. C., Olefsky, J. M. Macrophages, Immunity, and Metabolic Disease. Immunity. 41 (1), 36-48 (2014).
  17. Ferrante, A. W. The Immune Cells in Adipose Tissue. Diabetes, Obesity & Metabolism. 15, 34-38 (2013).
  18. Bertola, A., et al. Hepatic expression patterns of inflammatory and immune response genes associated with obesity and NASH in morbidly obese patients. PloS One. 5 (10), e13577(2010).
  19. Turnbaugh, P. J., Bäckhed, F., Fulton, L., Gordon, J. I. Diet-Induced Obesity Is Linked to Marked but Reversible Alterations in the Mouse Distal Gut Microbiome. Cell Host & Microbe. 3 (4), 213-223 (2008).
  20. Singh, R. K., et al. Influence of diet on the gut microbiome and implications for human health. Journal of Translational Medicine. 15 (1), 73(2017).
  21. Müller, V. M., et al. Gut barrier impairment by high-fat diet in mice depends on housing conditions. Molecular Nutrition & Food Research. 60 (4), 897-908 (2016).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

فئران تتغذى على نظام غذائي عالي الدهونظروف غير خالية من مسببات الأمراض النوعيةالجزء الوعائي السدويتحليل قياس التدفق الخلويبروتوكول هضم الأنسجةعزل الخلايا المناعيةالنسيج الدهني الكبدياستراتيجية تحديد البوابات
نموذج Murine متقدم للتهاب الكبد غير الكحولية بالتعاون مع مرض السكري من النوع 2
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.