يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

التعطيل الكيميائي للE3 يوبيكويتين Ligase سيريبلون من قبل Pomalidomide القائم على Homo-PROTACs

13.2K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/59472

⸱

مايو 15, 2019

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Internal Medicine III, University Hospital Ulm, 2Pharmaceutical Institute, Pharmaceutical Chemistry I, University of Bonn

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

يصف هذا العمل التوليف والتوصيف لـ pomalidomide القائم على، ثنائي ة وظيفية هومو-بروتك كنهج جديد للحث على كل مكان وتدهور E3 ubiquitin ligase cereblon (CRBN)، وهو الهدف من النظائر الثاليدوميد.

الملخص

الأدوية المناعية (IMiDs) الثاليدوميد ونظائرها، lenalidomide وpomalidomide، وافقت جميع ادارة الاغذية والعقاقير لعلاج الورم النقوي المتعدد، والحث على كل مكان وتدهور عوامل النسخ اللمفاوي ة Ikaros (IKZF1) وAiolos (IKZF3) عن طريق سيريبلون (CRBN) E3 يوبيكويتين الرباطي للتدهور البروتياسومال. وقد استخدمت مؤخرا IMiDs لتوليد التحلل البروتيوليسي ثنائي وظيفية التي تستهدف chimeras (PROTACs) لاستهداف البروتينات الأخرى للتدهور في كل مكان وبروتياسومال من قبل الرباط يَكِنْ ر. بنُ3. قمنا بتصميم وتوليف PROTACs المتجانسة القائمة على pomalidomide وحللت قدرتها على الحث على توجيه ذاتي في كل مكان وتدهور CRBN. هنا, CRBN بمثابة على حد سواء, وE3 في كل مكان ligase والهدف في نفس الوقت. مركب هومو-بروتك 8 يتحلل CRBN مع فعالية عالية مع الحد الأدنى فقط من الآثار المتبقية على IKZF1 و IKZF3. لم يكن للتعطيل CRBN بواسطة مركب 8 أي تأثير على صلاحية الخلية وانتشار خطوط الخلايا النقوية المتعددة المختلفة. هذا homo-PROTAC يلغي آثار IMiDs في خلايا الورم النقوي متعددة. ولذلك، قد تساعد مركباتنا المستندة إلى بوماليدوميد المتجانسة على تحديد الركائز الذاتية والوظائف الفسيولوجية لـ CRBN والتحقيق في الآلية الجزيئية للـ IMiDs.

المقدمة

الأدوية المناعية (IMiDs) الثاليدوميد ونظائرها، lenalidomide وpomalidomide، وكلها معتمدة لعلاج الورم النقوي المتعدد، وربط E3 يوبيكويتين ligase cereblon (CRBN)، محول الركيزة لcullin4A-RING E3 في يوبيكويتين ligase (CRL4CRBN)1،2،3. ربط IMiDs يعزز تقارب CRL4CRBN لعوامل النسخ اللمفاوي ة Ikaros (IKZF1) وAiolos (IKZF3)، مما يؤدي إلى كل مكان والتدهور (الشكل1)4،5، 6 , 7 , 8.منذ IKZF1 و IKZF3 ضرورية لخلايا الورم النقوي متعددة, نتائج تعطيلها في تثبيط النمو. تم العثور على SALL4 مؤخرا كالركيزة الجديدة التي يسببها IMiD من CRBN التي من المرجح أن تكون مسؤولة عن المسخ وما يسمى كارثة Contergan في 1950s الناجمة عن الثاليدوميد9،10. وعلى النقيض من ذلك، فإن الكازين كيناز 1α (CK1α) هو الركيزة الخاصة بالليناليدوميد من CRBN التي تورطت في التأثير العلاجي في متلازمة خلل التنسج النخاعي مع حذف كروموسوم 5q11.

إن قدرة الجزيئات الصغيرة على استهداف بروتين معين للتحلل هي دلالة مثيرة على تطوير الأدوية الحديثة. في حين تم اكتشاف آلية الثاليدوميد ونظائرها بعد استخدامها لأول مرة في البشر، ما يسمى Proteolysis Targeting Chimeras (PROTACs) وقد تم تصميمها لاستهداف على وجه التحديد بروتين من الفائدة (POI) (الشكل 2)12،13،14،15،16،17،18. PROTACs هي جزيئات heterobifunctional التي تتكون من ligand محددة لPOI متصلة عن طريق رابط إلى الرباط من الليغا سمعة E3 ubiquitin مثل CRBN أو فون هيبل لينداو (VHL)18,19,20, 21،22. PROTACs الحث على تشكيل مجمع ثلاثي عابر، وتوجيه POI إلى الليغا في كل مكان E3، مما أدى إلى وجود في كل مكان والتدهور البروتياسومال. المزايا الرئيسية لPROTACs على مثبطات التقليدية هو أن ملزمة لPOI كافية بدلا من تثبيط لها، وبالتالي PROTACs يمكن أن تستهدف مجموعة أوسع بكثير من البروتينات بما في ذلك تلك التي كانت تعتبر غير قابلة للمخدرات مثل [ ترجمفب 15] وبالإضافة إلى ذلك، تعمل جزيئات الشميرية بشكل حفاز، وبالتالي يكون لها قوة عالية. بعد نقل ubiquitin إلى POI، ينفصل المجمع الثلاثي وهو متاح لتشكيل مجمعات جديدة. وهكذا، تركيزات PROTAC منخفضة جدا كافية لتدهور البروتين المستهدف23.

هنا نقوم بوصف التوليف من pomalidomide-pomalidomide مترافق homo-PROTAC (مجمع 8) أن يجند CRBN لتدهور نفسها24. وE3 ubiquitin ligase CRBN بمثابة كل من المجند والهدف في نفس الوقت (الشكل3). للتحقق من صحة بياناتنا، قمنا أيضًا بتوليف عنصر تحكم سلبي ملزم (مركب 9). وتؤكد بياناتنا أن هومو-بروتك التوليف حديثا ً محدد لتدهور CRBN ولا له سوى آثار طفيفة على البروتينات الأخرى.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1. إعداد جزيئات بروتك

تنبيه: يرجى الرجوع إلى جميع أوراق بيانات سلامة المواد ذات الصلة (MSDS) قبل الاستخدام. العديد من المواد الكيميائية المستخدمة في هذه المرادفات سامة ومسرطنة. يرجى استخدام جميع ممارسات السلامة المناسبة ومعدات الحماية الشخصية.

  1. إعداد tert-butyl N-(2,6-ديوكسو-3-piperidyl) كارباميت (مركب 1)
    1. إضافة 1,1'-كاربونيلديميدازول (1.95 غرام، 12 مليمول) وكمية حفازة من 4-(ثنائي ميثيل أمينو)بيريدين (5 ملغ) إلى خليط من Boc-Gln-OH (2.46 غرام، 10 ملمول) في THF (50 مل) في 100 مل قارورة أسفل جولة مع شريط ضجة ومجهزة مكثف الجزر. يُسخّن المزيج في الجزر لمدّة 10 ساعة مع التحريك حتى يتمّ التوصل إلى حل واضح.
    2. إزالة المذيب تحت ضغط منخفض مع المبخر الدوارة، إضافة EtOAc (200 مل) ونقله إلى قمع فاصل. اغسل الطبقة العضوية بـ H2O (50 مل) ومحلول ملحي (50 مل) وجففها فوق Na2SO4.
    3. تصفية الحل من خلال لوحة قصيرة من هلام السيليكا (5 سم قطرها وارتفاع 5 سم) وeluate مع حجم إضافي (200 مل) من EtOAc.
    4. تتبخر المذيبات وتجف الصلبة التي تم الحصول عليها عديم اللون في vacuo.
  2. إعداد tert-butyl N-(1-ميثيل-2،6-ديوكسو-3-بيبيريديل) كارباميت (مركب 2)
    1. الجمع بين مركب 1 (2.28 غرام، 10 مليمول) مع كربونات البوتاسيوم المطحون (2.76 غرام، 20 مليمول) وDMF (25 مل) في قارورة أسفل جولة 100 مل. إضافة يودوميثان (1.42 غرام، 0.62 مل، 10 مل) قطرة الحكمة باستخدام حقنة وتجهيز قارورة مع الحاجز المطاطي المثقوب. وضع وعاء رد الفعل في حمام ultrasonication لمدة 2 ح.
    2. تمييع خليط التفاعل مع EtOAc (100 مل) ونقله إلى قمع فاصل. اغسل الطبقة العضوية بـ 1 N NaOH (2x 25 مل)، H2O (25 مل)، ومحلول ملحي (25 مل)، وجففها على Na2SO4.
    3. تصفية وتبخر المذيب. تنقية المنتج عن طريق الكروماتوغرافيا العمود على هلام السيليكا (6 سم قطر العمود وارتفاع 20 سم) باستخدام الأثير النفط / EtOAc (2:1).
  3. إعداد 2-(2,6-ديوكسوبيبريدين-3-yl)-4-فلوروإيزويندولين-1,3-ديون (مركب 3)
    1. الجمع بين 3-الفلوروفثاليك أنهيدريد (1.25 غرام، 7.5 مليمول)، غلوتاريميد 1 (1.14 غرام، 5 مليمول) وحل خلات الصوديوم (0.50 غرام، 6.0 مل) في حمض الخليك الجليدي (20 مل) في قارورة أسفل جولة 50 مل مع شريط ضجة ومجهزة مكثف الجزر. يُسخّن المزيج عند 120 درجة مئوية لمدّة 6 ساعة.
    2. بعد التبريد، صب الخليط الأرجواني على H2O (100 مل) ويحرك لمدة 10دقيقة.
  4. إعداد 4-فلورو-2-(1-ميثيل-2،6-ديوكسوبيبريدين-3-yl) إيزويندولين-1،3-ديون (مركب 4)
    1. الجمع بين 3-الفلوروفثاليك أنهيدريد (1.25 غرام، 7.5 مليمول)، غلوتاريميد 2 (1.21 غرام، 5 مليمول) وحل خلات الصوديوم (0.50 غرام، 6.0 مليمول) في حمض الخليك الجليدي (20 مل) في قارورة أسفل جولة 100 مل مع شريط تحريك ومجهزة مكثف الجزر. يُسخّن المزيج عند 120 درجة مئوية لمدّة 6 ساعة.
    2. بعد التبريد، صب الخليط الأرجواني على H2O (100 مل) ويحرك لمدة 10دقيقة.
  5. إعداد tert-butyl N-[2-2-[2-[[2-(2,6-dioxo-3-piperidyl)-1,3-dioxo-isoindolin-4-yl]amino]ethoxy]ethoxy]ethyl]carbamate (compound 7)
    1. شحن قارورة أسفل جولة 50 مل مع tert-butyl N-[2-2-(2-aminoethoxy)ethoxy]ethyl]carbamate (5, 0.41 g, 1.65 mmol), compound 3 (0.41 g, 1.50 mmol), DMF الجافة (10 مل) وDIPEA (0.39 غرام, 0.51 مل, 3.0 مل). تجهيز مع شريط تحريك ومكثف الجزر. الحرارة تحت الغلاف الجوي الأرجون في 90 درجة مئوية لمدة 10 ساعة.
    2. بعد التبريد إلى درجة حرارة الغرفة، صب الخليط الأخضر الداكن على H2O (100 مل) واستخراج مع EtOAc (3X 50 مل) في قمع فاصل. غسل الطبقات العضوية مجتمعة مع H2O (50 مل) ومحلول ملحي (50 مل)، والجافة على Na2SO4،مرشح، والتركيز في vacuo.
    3. تنقية المنتج الخام عن طريق الكروماتوغرافيا العمود على هلام السيليكا (3 سم قطر العمود وارتفاع 60 سم) باستخدام تدرج من الأثير النفط / EtOAc (1:1 إلى 1:2).
  6. إعداد هوموديمر (مركب 8)
    1. الجمع بين α،ω-ديامين linker 6 (0.22 غرام، 0.22 مل، 1.50 مل)، ديبا (1.05 مل، 6.00 مل مول) وحل 3 (0.83 غرام، 3.00 مل) في DMSO الجافة (20 مل) في قارورة أسفل جولة 50 مل مع شريط تحريك ومجهزة مكثف الجزر. الحرارة تحت الغلاف الجوي الأرجون في 90 درجة مئوية لمدة 18 ساعة.
    2. بعد التبريد إلى درجة حرارة الغرفة، صب الخليط الأخضر الداكن على H2O (100 مل) واستخراج مع EtOAc (3X 50 مل) في قمع فاصل. غسل الطبقات العضوية مجتمعة مع H2O (50 مل) ومحلول ملحي (50 مل)، والجافة على Na2SO4،وتصفية والتركيز في vacuo.
    3. تنقية المنتج الخام عن طريق الكروماتوغرافيا العمود على هلام السيليكا (3 سم قطر العمود وارتفاع 50 سم) باستخدام تدرج من الأثير النفط / EtOAc (1:2) إلى EtOAc.
  7. إعداد هيتروديمر (مركب 9)
    1. حل مركب 7 (0.83 غرام، 1.65 مليمول) في CH الجافة2كل2 (10 مل). يُضاف حمض ثلاثي فلورو سيتيك (10 مل) ويُحرّك المزيج الأصفر عند درجة حرارة 40 درجة مئوية لمدة 2 ساعة في قارورة سفلية مستديرة بمقدار 50 مل.
    2. إزالة المتطايرات وcoevaporate مع CH2Cl2 (4X 5 مل). تجفيف بقايا في vacuo لمدة 10 ساعة.
    3. إعادة إذابة المواد في DMF الجافة (20 مل). إضافة مركب 4 (0.44 غرام، 1.50 مليمول) وDIPEA (0.78 غرام، 1.05 مل، 6.00 مل) وتجهيز قارورة مع مكثف الجزر. الحرارة تحت الغلاف الجوي الأرجون في 90 درجة مئوية لمدة 10 ساعة.
    4. بعد التبريد إلى درجة حرارة الغرفة، صب الخليط الأخضر الداكن على H2O (100 مل) واستخراج مع EtOAc (3X 50 مل) في قمع فاصل. غسل الطبقات العضوية مجتمعة مع المشبعة NaHCO3 (50 مل)، H2O (50 مل)، 10٪ KHSO4 (50 مل)، H2O (50 مل)، ومحلول ملحي (50 مل)، والجافة على Na2SO4،فلتر والتركيز في vacuo.
    5. تنقية المنتج الخام عن طريق الكروماتوغرافيا العمود على هلام السيليكا (3 سم قطر العمود وارتفاع 50 سم) باستخدام تدرج من الأثير النفط / EtOAc (1:2) إلى EtOAc.
    6. توضيح هيكل الجزيء والتحقق منه (مركبالشكل 5A 8،مركب 5B 9)بواسطة 1H NMR و 13C NMR الأطياف في DMSO-d6 على الرنين المغناطيسي النووي (NMR) مطياف. تحقق من أن نقاء كلا المركبين أعلى من 97٪ عن طريق قياس الطيف الكتلي اللوني السائل (LC-MS)، وتطبيق الكشف عن صفيف الصمام الثنائي (DAD) في 220-500 نانومتر.

2. التحقق الوظيفي من جزيئات بروتك

  1. تحليل اللطخة الغربية لتدهور CRBN من قبل PROTACs
    ملاحظة: آثار مركب8ومجمع9على مستوى البروتين CRBN تم اختبارها من قبل تحليل وصمة عار الغربية. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن أيضا تأكيد التأثير على مستويات IKZF1 و IKZF3 (الشكل 6).
    1. إعداد العينات
      1. حل المركبات 8 و 9، lenalidomide (لين) ، pomalidomide (بوم) ، MG132 ، وMLN-4924 في DMSO بتركيز 10 MM ، aliquot وتخزينها في -80 درجة مئوية حتى مزيد من الاستخدام.
      2. البذور 1 × 106 خلايا MM1S في لوحة 6 جيدا مع وسائل الإعلام 2.5 مل وعلاج الخلايا مع 100 nM أو 1 مجمع ميكرومتر 8 أو 9 لمدة 24 ساعة.
      3. خلايا الحصاد بعد المعالجة والطرد المركزي في 700 × ز، 5 دقيقة، 4 درجة مئوية. غسل بيليه الخلية مع الباردة 1X PBS لإزالة الوسائط المتبقية، الطرد المركزي في 700 × ز، 5 دقيقة، 4 درجة مئوية، وتجاهل supernatant. كرر هذه الخطوة مرة واحدة.
      4. خلايا الليس في التحلل العازلة (25 mM تريس حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 7.4، 150 مل NaCl، 1٪ NP-40، 1 MM EDTA، 5٪ الجلسرين، 1X البروتياز وPhosphatase كوكتيل المانع) لمدة 10 دقائق على الجليد، الطرد المركزي في 320 × ز لمدة 10 دقائق، 4 درجة مئوية. حصاد supernatant وتحديد تركيز البروتين عن طريق اختبار بروتين حمض bicinchoninic (اختبار BCA) وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
      5. البروتينات تشوه (15-30 ميكروغرام / عينة) مع 1X LDS تحميل العازلة (5٪ 2-mercaptoethanol) ويغلي 10 دقيقة، 75 درجة مئوية.
    2. SDS-PAGE
      1. إصلاح ساندويتش هلام مع هلام فصل 10٪ [4 مل 3X هلام العازلة (3 M تريس / حمض الهيدروكلوريك، 0.3٪ (ث / الخامس) كبريتات دودسيل الصوديوم (SDS)، درجة الحموضة 8.45)، 4 مل أكريلاميد 30٪، 2.52 مل الجلسرين 50٪، 1.395 مل H2O، 75 ميكرولتر 11٪ كبريتات الأمونيوم (APS)، و 9.75 ميكرولتر TEMED] و هلام التراص 4٪ [1.992 مل 3X هلام العازلة، 0.792 مل 30٪ أكريلاميد، 3.168 مل H2O، 36 ميكرول 11٪ APS، و 6 درجة مئوية TEMED] في وحدة تجميع القطب الكهربائي. إزالة أمشاط، وآبار دافق مع العازلة الكاثود (100 MM تريس / حمض الهيدروكلوريك، 100 mM tricine، 0.1٪ (ث / الخامس) SDS)، وتحميل العينات.
      2. ملء المخزن المؤقت الأنود (100 mM Tris/HCl، الحموضة 8.9) في الخزان. تحميل عينة البروتين من الخطوة 2.1.1.4 وتشغيل SDS-PAGE في 70 V، 20 دقيقة، تليها 115 V، 150 دقيقة في الجهد المستمر.
    3. مناعة والكشف عن CRBN، IKZF1 و IKZF3
      1. تنشيط غشاء PVDF (0.45 ميكرومتر) في الميثانول 100٪ لمدة 1 دقيقة. غشاء Equilibrate وفصل هلام في 1X نقل العازلة [10X نقل العازلة (192 مل غليسين، 25 mM تريس قاعدة / حمض الهيدروكلوريك، 900 مل H2O)، 20٪ الميثانول، 0.1٪ SDS، pH 8.3].
      2. تجميع كاسيت النشاف وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. نقل هلام في 180 مأ لمدة 90 دقيقة.
      3. غسل غشاء 3X في 1X TBS-T (25 MT Tris / HCl، 150 مل NaCl، درجة الحموضة 7.6، 0.1٪ توين 20) لمدة 5-10 دقيقة لكل منهما في درجة حرارة الغرفة. كتلة غشاء في 5٪ الحليب المجفف غير الدهون (NFDM)، TBS-T لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة. غسل غشاء 3X في 1X TBS-T لمدة 5-10 دقيقة لكل منهما في درجة حرارة الغرفة.
      4. احتضان غشاء مع الأجسام المضادة الأولية لCRBN (1:500 في 5٪ BSA، TBS-T) مع هز لطيف في 4 درجة مئوية، بين عشية وضحاها.
      5. غسل غشاء 3X في 1X TBS-T لمدة 5-10 دقيقة لكل منهما في درجة حرارة الغرفة. الغشاء الحضانة مع المضادة للماوس (1:10.000 في 5٪ NFDM، TBS-T) أو المضادة للأرنب (1:5.000 في 5٪ NFDM، TBS-T) الأجسام المضادة الثانوية إلى جانب الفجل peroxidase HRP (1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.)
      6. غسل غشاء 2X في 1X TBS-T لمدة 5-10 دقيقة لكل منهما في درجة حرارة الغرفة. كرر هذه الخطوة مرتين مع TBS 1x.
      7. احتضان غشاء لمدة 2 دقيقة مع حل الركيزة HRP وفقا لبروتوكولات الشركة المصنعة والكشف عن chemiluminescence في جهاز الكشف عن chemiluminescence.
      8. غسل غشاء 1X في 1X TBS لمدة 5-10 دقيقة لكل منهما في درجة حرارة الغرفة. للإفراج عن الأجسام المضادة، غشاء الشريط في المخزن المؤقت تجريد المتاحة تجاريا لمدة 15 دقيقة.
      9. إعادة حظر الغشاء في 5٪ الحليب المجفف غير الدهون، TBS-T لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة. غسل غشاء 3X في 1X TBS-T لمدة 5-10 دقيقة لكل منهما في درجة حرارة الغرفة وإعادة التحقيق مع IKZF1، IKZF3 أو توبولين وفقا للخطوة 2.1.3.4.
  2. تجارب المنافسة مع MG132، MLN4942 أو pomalidomide
    ملاحظة: للتأكد من ما إذا كان CRBN المتدهورة عبر مسار ubiquitin-proteasome، قمنا بإجراء تجارب المنافسة مع مثبطات بروتياسوم MG132ومثبط تنشيط الإنزيم (NAE) MLN4942 (الشكل 7).
    1. البذور 1 × 106 MM1S الخلايا لكل بئر في لوحة 6 جيدا. خلايا الإنقراض مع 10 ميكرومتر MG132، 10 μM MLN4942، أو lenalidomide (100x)، وحضانة 1 ساعة في 37 درجة مئوية، 5٪ CO2.
    2. إضافة 100 nM مركب 8 لمدة 3 ساعة في 37 درجة مئوية، 5٪ CO2.
    3. خلايا الحصاد لللطخة الغربية وفقا للخطوة 2.1.1.
  3. اختبار صلاحية الخلايا في خطوط خلايا الورم النقوي المتعددة
    ملاحظة: يتم استخدام هذا الفحص لاختبار التأثير على قدرة الخلية على البقاء، بالإضافة إلى ذلك، تعادي تأثير IMiDs على خلايا الورم النقوي المتعددة عن طريق المعالجة المسبقة للخلايا مع المركب 8 (الشكل 8، الشكل 9A ، B).
    1. البذور 5 × 104 خلايا MM1S لكل بئر في لوحة 96 جيدا في triplicates البيولوجية للحصول على اختبار الصلاحية. لتحليل وصمة عار الغربية، البذور 1 × 106 خلايا MM1S في بئر في لوحة 6 جيدا في triplicates البيولوجية.
    2. علاج الخلايا مع DMSO أو 100 nM، 1 μM، أو 10 م مركب 8،مركب 9 أو pomalidomide وحضانة لمدة 24 ساعة، 48 ساعة، أو 96 ساعة في 37 درجة مئوية، 5٪ CO2. لتجارب الإنقاذ، علاج الخلايا مع 100 nM مركب 8 لمدة 3 ساعة، قبل أو بعد إضافة 1 μM pomalidomide وحضانة لمدة 96 ساعة.
    3. قياس الإنارة لوحة 96 جيدا مع اختبار صلاحية الخلية الإنارة، وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة على قارئ لوحة أو خلايا الحصاد من لوحة 6-جيدا لتحليل وصمة عار الغربية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

هنا وصفنا تصميم، والتوليف والتقييم البيولوجي لPROTAC المستندة إلى pomalidomide المتجانسة لتدهور CRBN. يتفاعل PROTAC لدينا في وقت واحد مع اثنين من جزيئات CRBN وتشكل المجمعات الثلاثية التي تحفز على التحلل الذاتي في كل مكان وتدهور البروتياسومال من CRBN مع الحد الأدنى فقط من الآثار المتبقية على الركائز الجديدة التي يسببها pomalidomide IKZF1 أو IKZF3.

من سلسلة من الجزيئات PROTAC pomalidomide التي نشرت سابقا24،...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

تصميم مثل هذه proTACs الإنسان كما هو موضح هنا لCRBN يعتمد على تقارب محددة من pomalidomide إلى CRBN، والتي تم استخدامها بنجاح في العديد من PROTACs heterobifunctional وأدى إلى تطوير PROTAC 8 باعتبارها عالية انتقائية CRBN المهينة. وقد تم بالفعل تأكيد خصوصية جزيء لدينا من قبل التحليلات البروتيومية24. بالنسبة بالضربة القاضية التي يتم التوسط فيها وراثياً، فإن الاستبعاد والتحقق من الآثار الجانبية أمر صعب ويستغرق وقتاً طويلاً. وبالإضافة إلى ذلك، فإن الضربة القاضية المستحثة كيميائيا ً يمكن...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ولا يعلن أصحاب البلاغ عن احتمال وجود تضارب مالي في المصالح.

شكر وتقدير

وقد دعم هذا العمل برنامج "برنامج إيمي- نوثير Kr-3886/2-1" وSFB-1074 إلى J.K.؛ FOR2372 إلى M.G.)

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
1،1 '-CarbonyldiimidazoleTCI الكيميائيةC0119
2،2 & prime ؛ - (إيثيلين ديوكسي) - مكرر (إيثيل أمين) مركبسيجما ألدريتش3855066
2-MercaptoethanolSigma-AldrichM6250
3-أنهيدريد الفلوروفثاليك ، 98Alfa AesarA12275
4-ثنائي ميثيل أمينوبيريدين ، 99٪أكروس148270250
أكريلاميدستامل السام & ouml; سونغ / بيساكريلاميد (30٪ / 0,8٪)كارل روث3029.1
Aiolos (D1C1E) خلية mABإشارات15103S
الجسم المضاد المضاد ل CRBN المنتج في الأرانبSigmaHPA045910
الأجسام المضادة المرتبطة ب IgG HRPللأرانب Sigma7074S
الأمونيوم بيرسولفاتروث9592.2
Boc-Gln-OHTCI الكيميائيةB1649
ألبومين مصل البقرSigma-AldrichA7906-100G
CellTiter-Glo Luminescent Cell Zaability AssayPromegaG7571
ChemiDoc XRS +Bio-Rad1708265
DMF ، لامائي ، 99.8Acros348435000Extra Dry Over Molecular Sieve
DMSO ، لا مائي ، 99.7٪Acros348445000الجفاف الإضافي فوق المنخل الجزيئي
جلايسينسيجما-ألدريتش15523-1L-R
الماعز المضاد للفأر (HRP مترافق)سانتا كروز للتكنولوجيا الحيويةsc-2005
وقف البروتياز & أمبير كوكتيل مثبط الفوسفاتيز للاستخدام الواحد (100X)Thermo Scientific1861280
Ikaros (D6N9Y) MabCell Signaling14859S
ImmobilonP Transfer Membrane (0،45 & micro; م)ميركIPVH000010
اليودوميثان ، 99٪سيجما ألدريتشI8507الميثانول شديد السمية
سيجما ألدريتش32213-2.5 لتر
Mg132SelleckchemS2619
خلية نقل كهربائية صغيرة عبر اللطخةBio-Rad1703930
خلية الرحلان الكهربائي العمودي Mini-PROTEAN TetraBio-Rad1658004
MLN4942biomol (كايمان)Cay15217-1
أحادي النسيلة المضاد لألفا توبولين المنتج في الفأر (B512)SigmaT5168
N-Ethyldiisopropylamine ، 99Alfa AesarA11801
مسحوق الحليب المجفف الخالي من الدسمPanReac AppliChemA0830،0500
Nunc F96 MicroWell White لوحة البوليسترينالحرارية العلمية136101
NuPAGE LDS عينة عازلة (4X)Thermo ScientificNP0008
Pierce BCA Protein Assay KitThermo Scientific23225
PomalidomideSelleckchemS1567
RestoreTM Western Blot Stripping BufferThermo Scientific46430
الصوديوم كبريتات دوديسيلكارل روث183.1
كلوريد الصوديومسيجما ألدريتشA9539-500g
TEMEDكارل روث2367.3
ثلاثي بوتيل N- [2- [2- (2-أمينويثوكسي) إيثوكسي] إيثيل] كارباماتسيجما ألدريتش89761مركب 5
تريسينكارل روث6977.4
قاعدة تريزماسيجما ألدريتشT1503-1kg
Tween-20Sigma-AldrichP7949-500ml
WesternBright ECL بخاخAdvanstaK-12049-D50
٪ المضادة ٪ ٪

المراجع

  1. Ito, T., et al. Identification of a primary target of thalidomide teratogenicity. Science. 327 (5971), 1345-1350 (2010).
  2. Lopez-Girona, A., et al. Cereblon is a direct protein target for immunomodulatory and antiproliferative activities of lenalidomide and pomalidomide. Leukemia. 26 (11), 2326-2335 (2012).
  3. Fischer, E. S., et al. Structure of the DDB1-CRBN E3 ubiquitin ligase in complex with thalidomide. Nature. 512 (7512), 49-53 (2014).
  4. Gandhi, A. K., et al. Immunomodulatory agents lenalidomide and pomalidomide co-stimulate T cells by inducing degradation of T cell repressors Ikaros and Aiolos via modulation of the E3 ubiquitin ligase complex CRL4(CRBN). British Journal of Haematology. 164 (6), 811-821 (2014).
  5. Kronke, J., Hurst, S. N., Ebert, B. L. Lenalidomide induces degradation of IKZF1 and IKZF3. Oncoimmunology. 3 (7), e941742(2014).
  6. Lu, G., et al. The myeloma drug lenalidomide promotes the cereblon-dependent destruction of Ikaros proteins. Science. 343 (6168), 305-309 (2014).
  7. Zhu, Y. X., Kortuem, K. M., Stewart, A. K. Molecular mechanism of action of immune-modulatory drugs thalidomide, lenalidomide and pomalidomide in multiple myeloma. Leukemia & Lymphona. 54 (4), 683-687 (2013).
  8. Chamberlain, P. P., et al. Structure of the human Cereblon-DDB1-lenalidomide complex reveals basis for responsiveness to thalidomide analogs. Nature Structural & Molecular Biology. 21 (9), 803-809 (2014).
  9. Donovan, K. A., et al. Thalidomide promotes degradation of SALL4, a transcription factor implicated in Duane Radial Ray syndrome. eLife. 7, (2018).
  10. Matyskiela, M. E., et al. SALL4 mediates teratogenicity as a thalidomide-dependent cereblon substrate. Nature Chemical Biology. 14 (10), 981-987 (2018).
  11. Kronke, J., et al. Lenalidomide induces ubiquitination and degradation of CK1alpha in del(5q) MDS. Nature. 523 (7559), 183-188 (2015).
  12. Sakamoto, K. M., et al. Protacs: chimeric molecules that target proteins to the Skp1-Cullin-F box complex for ubiquitination and degradation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (15), 8554-8559 (2001).
  13. Sakamoto, K. M., et al. Development of Protacs to target cancer-promoting proteins for ubiquitination and degradation. Molecular & Cellular Proteomics. 2 (12), 1350-1358 (2003).
  14. Schneekloth, J. S. Jr, et al. Chemical genetic control of protein levels: selective in vivo targeted degradation. Journal of the American Chemical Society. 126 (12), 3748-3754 (2004).
  15. Gu, S., Cui, D., Chen, X., Xiong, X., Zhao, Y. PROTACs: An Emerging Targeting Technique for Protein Degradation in Drug Discovery. Bioessays. 40 (4), e1700247(2018).
  16. Collins, I., Wang, H., Caldwell, J. J., Chopra, R. Chemical approaches to targeted protein degradation through modulation of the ubiquitin-proteasome pathway. Biochemical Journal. 474 (7), 1127-1147 (2017).
  17. Neklesa, T. K., Winkler, J. D., Crews, C. M. Targeted protein degradation by PROTACs. Pharmacology & Therapeutics. 174, 138-144 (2017).
  18. Winter, G. E., et al. Phthalimide conjugation as a strategy for in vivo target protein degradation. Science. 348 (6241), 1376-1381 (2015).
  19. Maniaci, C., et al. Homo-PROTACs: bivalent small-molecule dimerizers of the VHL E3 ubiquitin ligase to induce self-degradation. Nature Communications. 8 (1), 830(2017).
  20. Crew, A. P., et al. Identification and Characterization of Von Hippel-Lindau-Recruiting Proteolysis Targeting Chimeras (PROTACs) of TANK-Binding Kinase 1. Journal of Medicinal Chemistry. , (2017).
  21. Lu, J., et al. Hijacking the E3 Ubiquitin Ligase Cereblon to Efficiently Target BRD4. Chemistry & Biology. 22 (6), 755-763 (2015).
  22. Steinebach, C., et al. PROTAC-mediated crosstalk between E3 ligases. Chemical Communications. 55 (12), 1821-1824 (2019).
  23. Tinworth, C. P., Lithgow, H., Churcher, I. Small molecule-mediated protein knockdown as a new approach to drug discovery. Medchemcomm. 7 (12), 2206-2216 (2016).
  24. Steinebach, C., et al. Homo-PROTACs for the Chemical Knockdown of Cereblon. ACS Chemical Biology. 13 (9), 2771-2782 (2018).
  25. Ambrozak, A., et al. Synthesis and Antiangiogenic Properties of Tetrafluorophthalimido and Tetrafluorobenzamido Barbituric Acids. ChemMedChem. 11 (23), 2621-2629 (2016).
  26. Zhou, B., et al. Discovery of a Small-Molecule Degrader of Bromodomain and Extra-Terminal (BET) Proteins with Picomolar Cellular Potencies and Capable of Achieving Tumor Regression. Journal of Medicinal Chemistry. , (2017).
  27. Zhang, C., et al. Proteolysis Targeting Chimeras (PROTACs) of Anaplastic Lymphoma Kinase (ALK). European Journal of Medicinal Chemistry. 151, 304-314 (2018).
  28. Runcie, A. C., Chan, K. H., Zengerle, M., Ciulli, A. Chemical genetics approaches for selective intervention in epigenetics. Current Opinion in Chemical Biology. 33, 186-194 (2016).
  29. Kronke, J., et al. Lenalidomide causes selective degradation of IKZF1 and IKZF3 in multiple myeloma cells. Science. 343 (6168), 301-305 (2014).
  30. Eichner, R., et al. Immunomodulatory drugs disrupt the cereblon-CD147-MCT1 axis to exert antitumor activity and teratogenicity. Nature Medicine. 22 (7), 735-743 (2016).
  31. Zhu, Y. X., et al. Cereblon expression is required for the antimyeloma activity of lenalidomide and pomalidomide. Blood. 118 (18), 4771-4779 (2011).
  32. Kortum, K. M., et al. Targeted sequencing of refractory myeloma reveals a high incidence of mutations in CRBN and Ras pathway genes. Blood. 128 (9), 1226-1233 (2016).
  33. Gil, M., et al. Cereblon deficiency confers resistance against polymicrobial sepsis by the activation of AMP activated protein kinase and heme-oxygenase-1. Biochemical and Biophysical Research Communications. 495 (1), 976-981 (2018).
  34. Kim, H. K., et al. Cereblon in health and disease. Pflügers Archiv: European Journal of Physiology. 468 (8), 1299-1309 (2016).
  35. Lee, K. M., et al. Disruption of the cereblon gene enhances hepatic AMPK activity and prevents high-fat diet-induced obesity and insulin resistance in mice. Diabetes. 62 (6), 1855-1864 (2013).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

تفكيك سيربلونبروتاكات القائمة على بوماليدوميدمركب Homo-PROTAC 8تثبيط CRBNتحليل لطخة ويسترنمقايسة حيوية الخليةخلايا الورم النخاعي المتعددتفكيك IKZF1 وIKZF3تثبيط البروتيازومتأكيد البنية بواسطة الرنين المغناطيسي النووي
التعطيل الكيميائي للE3 يوبيكويتين Ligase سيريبلون من قبل Pomalidomide القائم على Homo-PROTACs
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.