مقالة منهجية

تطبيق اضطرابات متناسقة تشبه التدليك على عجول الماوس ومراقبة التغيرات الناتجة عن الضغط العضلي العضلي

DOI:

10.3791/59475

⸱

سبتمبر 20, 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Rehabilitation for Motor Functions, National Rehabilitation Center for Persons with Disabilities, 2Graduate School of Sport Sciences, Waseda University, 3Faculty of Sport Sciences, Waseda University, 4Department of Orthopaedic Surgery, Graduate School of Medicine, The University of Tokyo, 5Frontier Research Institute for Interdisciplinary Sciences, Tohoku University, 6University of Cincinnati College of Medicine, 7Department of Assistive Technology, National Rehabilitation Center for Persons with Disabilities, 8Department of Clinical Research, National Rehabilitation Center for Persons with Disabilities

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا نقوم بوصف بروتوكولات لتطبيق الأحمال الميكانيكية المحددة على العجول الماوس ولرصد التغييرات الضغط العضلي المصاحبة. النظم التجريبية التي قمنا بتطويرها يمكن أن تكون مفيدة للتحقيق في الآلية وراء الآثار المفيدة لممارسة الرياضة البدنية والتدليك.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ومن المسلم به عموما أن التدليك مفيد لتخفيف الألم والالتهاب. على الرغم من أن الدراسات السابقة قد ذكرت الآثار المضادة للالتهابات من التدليك على عضلات الهيكل العظمي, الآليات الجزيئية وراء غير مفهومة جيدا. لقد قمنا مؤخرًا بتطوير جهاز بسيط لتطبيق الضغط الدوري المحلي (LCC)، والذي يمكن أن يولد موجات ضغط عضلي مع سعة متفاوتة. باستخدام هذا الجهاز، لقد أثبتنا أن LCC ينظم الاستجابات الالتهابية من الضامة في الموقع ويخفف من ضمور العضلات الناجم عن الجمود. هنا، ونحن نصف بروتوكولات لتحسين وتطبيق LCC كتدخل مثل التدليك ضد التهاب الناجمة عن تجميد وضمور العضلات الهيكلية من الأطراف الخلفية الماوس. البروتوكول الذي قمنا بتطويره يمكن أن تكون مفيدة للتحقيق في الآلية الكامنة وراء الآثار المفيدة لممارسة الرياضة البدنية والتدليك. يوفر نظامنا التجريبي نموذجًا أوليًا للنهج التحليلي لتوضيح التنظيم الميكانيكي لتوازن العضلات، على الرغم من ضرورة إجراء المزيد من التطوير لإجراء دراسات أكثر شمولاً.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ومن المسلم به عموما أن التدليك مفيد لكل من تخفيف الألم وتحسين الأداء البدني بين الرياضيين تنافسية وغير الرياضيين على حد سواء1،2. في الواقع، أظهرت الدراسات السابقة أن التدليك يقمع الالتهاب المحلي3 ويدفع الانتعاش من تلف العضلات بعد ممارسة4،5. الآليات الجزيئية الكامنة وراء الآثار المفيدة للتدليك لا تزال غير معروفة إلى حد كبير.

واحدة من الصعوبات مع التحقيق الميكانيكية على التدليك تتعلق استنساخ التقنيات التجريبية التي يتم اختبار التدخلات مثل التدليك. في الدراسات السابقة، الإجراءات التجريبية التي تحاكي التدليك تنطوي في الغالب على تطبيق التدخلات البدنية باستخدام أجزاء الجسم الممارسين، مثل النخيل والأصابع6،7،8. وهذا يجعل من الصعب على وجه التحديد إعادة إنتاج حجمها وتواترها ومدتها ووضعها.

وقد تم تطوير العديد من الأجهزة لتطبيق الأحمال الميكانيكية المحددة على الأنسجة المستهدفة. على سبيل المثال، قام Zeng وآخرون بتطوير نظام هوائي للتحميل الميكانيكي لطول الحكمة إلى الأطراف الخلفية للفئران9 ووانغ وآخرون قد وضعت جهاز الميكاترونيكس التي يمكن تطبيق الأحمال الميكانيكية مثل التدليك على الأطراف الخلفية من الفئران والأرانب مع في الوقت الحقيقي السيطرة على ردود الفعل10. بالمقارنة مع لهم، لدينا نظام الضغط الدوري المحلي (LCC) هو أبسط بكثير، مما يتطلب تكلفة أقل بكثير للبناء. ومع ذلك، يمكننا إعادة إنتاج تغيرات الضغط العضلي التي يتم إنشاؤها خلال تقلص العضلات خفيفة. باستخدام هذا الجهاز، أثبتنا بنجاح أن التدخلات الميكانيكية الشبيهة بالتدليك تعدل ديناميات السوائل الخلالية المحلية وتخفف من ضمور العضلات الناجم عن الجمود11.

هنا، ونحن نصف تفاصيل الجهاز والبروتوكول، والتي قد تساعد في استكشاف الآليات الجزيئية وراء الآثار الإيجابية للتمارين والتدليك. وترد مخططات البروتوكول بوصفها الشكل التكميلي 1.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وأجريت جميع التجارب الحيوانية بموافقة اللجنة المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها التابعة للمركز الوطني لإعادة تأهيل الأشخاص ذوي الإعاقة.

1. تعطيل الأطراف الخلفية الثنائية الماوس

ملاحظة: تم استخدام الفئران الذكور C57BL/6 للتجارب في سن 11-12 أسابيع بعد التأقلم لمدة 7 أيام على الأقل.

  1. تخدير الماوس بشكل كاف باستخدام البنتوباربيتال الصوديوم (50 ملغ /كغ i.p.). تأكد من أن الفئران لا تستجيب لقرصة اصبع القدم الخلفية.
    ملاحظة: إجراء إجراء التعطيل بين الساعة 00/10 والساعة 00/19 للتقليل إلى أدنى حد من الآثار المحتملة على نشاط تغذية الفئران.
  2. تطبيق الأشرطة الجراحية على الأطراف الخلفية الثنائية للماوس وضعت في موقف supine مع مفاصل الركبة الموسعة ومفاصل الكاحل الأخمصية المرنة.
  3. وضع سلك الألومنيوم (انظر جدول المواد)على الجذع على مستوى العمود الفقري L4-5 ولفائف السلك في تكوين حلزوني حول الأطراف الخلفية مع فجوات 5 ملم بين كل منعطف من الطبقة الحلزونية(الشكل 1A). تأكد من عدم لفائف السلك بإحكام جدا وتجنب إزعاج تدفق الدم المحلي.
  4. لتقليل إمكانية الهروب من الأسلاك، وتعطيل مفاصل الورك في موقف اختطاف 90 درجة عن طريق ضبط تكوين أسلاك الألومنيوم يدويا.
  5. أعد الفئران إلى أقفاصها الأصلية 3 ح في وقت لاحق، تأكد من أنها تتعافى من التخدير والحصول على الغذاء والماء كالمعتاد.
  6. منزل 3 -- 6 الفئران المعطلة في قفص كما كان من قبل تجميد.

2. قياس الضغط العضلي للعضلات الجهاز الهضمي الماوس

ملاحظة: تم اختبار عدة أوزان مختلفة من الوحدات الأسطوانية (36 غرام و66 غرام و200 غرام) في تجارب رصد الضغط جنبا إلى جنب مع LCC. وقد أجري هذا القياس بشكل منفصل عن التجارب لتحليل التهاب العضلات وضمورها (انظر الخطوة 3-5 لمزيد من التفاصيل) أي أن الفئران التي خضعت لقياس الضغط لم تستخدم في التحليلات النسيجية.

  1. لأن قياس الضغط ينطوي على إجراءات أكثر الغازية (على سبيل المثال، شق الجلد وإدخال إبرة) بالمقارنة مع الأسلاك الخلفية وLCC، واستخدام خليط من ثلاثة عوامل مخدرة (medetomidine 0.75 ملغ / كغ، ميدازولام 4.0 ملغ / كغ، وbutorphanol 5.0 ملغ / كغ، i.p.). تأكد من أن الفئران لا تستجيب لقرصة اصبع القدم الخلفية.
  2. وضع الماوس في موقف عرضة، وجعل شق 2 مم مع مشرط على العجل الخلفي بعد إزالة الشعر مع آلة صنع كهربائية وشبه تعقيم سطح الجلد مع 70٪ الإيثانول والكلورهيكسيدين غارقة القطن ماصة.
  3. أدخل إبرة مسكنة بـ 20 غ في عضلة المعدة والأمعاء بزاوية منفرجة (150 درجة - 170 درجة) على سطح الجلد.
  4. باستخدام غمد البلاستيك من الإبرة كدليل، ضع جهاز استشعار من جهاز قياس ضغط الدم (انظر جدول المواد)في منتصف البطن من العضلات المعدية، ومن ثم إزالة غمد من العضلات.
  5. بعد خياطة الجلد مع خياطة النايلون 4-0، وتطبيق LCC مع عدة أوزان مختلفة من وحدات أسطواني على العجل في الفئران (انظر الخطوة 3 لمزيد من التفاصيل)، ورصد الضغط العضلي باستخدام البرمجيات لتحليل إشارة البيولوجية (انظر جدول المواد).
  6. أعد الفئران إلى أقفاصها الأصلية 3 ح في وقت لاحق، تأكد من أنها تتعافى من التخدير / التسكين والحصول على الغذاء والماء كالمعتاد.

3. ضغط دوري محلي (LCC) على العجول الماوس

  1. باستثناء قياس الضغط العضلي والإعدام الرحيم (أي خلع عنق الرحم)، استخدم البنتوباربيتال الصوديوم (50 ملغم/كغم من الـ i.p.) للتخدير.
  2. فك ارتباط الماوس من الأسلاك الخلفية ووضعها في موقف عرضة مع مفاصل الركبة الموسعة ومفاصل الكاحل الأخمصية المرنة بحيث تواجه العجول صعودا. لا تقم بإصلاح الأطراف الخلفية الماوس على خشبة المسرح.
  3. تطبيق LCC على العجل عن طريق تحريك عموديا وحدة الوزن أسطواني(الشكل 1B)مغطاة وسادة وسادة(الشكل 1C)في 1 هرتز لمدة 30 دقيقة في اليوم الواحد، 7 أيام.
  4. بعد كل نوبة من LCC اليومية، إعادة سلك الأطراف الخلفية الماوس.

4. التحليل المناعي الكيميائي للمعزة الهضمية

  1. قتل الفأر عن طريق خلع عنق الرحم تحت التخدير /التسكين الكافي عن طريق الحقن داخل المجلس اء من خليط من ثلاثة عوامل مخدرة (ميديتموميدين 0.75 ملغ / كغ، ميدازولام 4.0 ملغ / كغ، وبوتيتول 5.0 ملغ / كغ).
  2. بعد إزالة الشعر السطحي الخلفي للعجل، قم بإجراء شق جلدي، وتشريح العضلات المعدية عن طريق الفصل عن العظام التيبيو-فيبولار باستخدام مقص جراحي وتجميدها بسرعة في حل مركب درجة حرارة القطع الأمثل.
  3. باستخدام cryostat، وإعداد عينات من قسم التبريد من العضلات المعدية على الشرائح الزجاجية. تخزين العينات في الفريزر -80 درجة مئوية حتى التحليل.
  4. إخراج عينات قسم التبريد gastrocnemius لتحليلها من الثلاجة وتجفيفها عن طريق تجفيف الهواء في درجة حرارة الغرفة.
  5. استخدم قلم حظر سائل لرسم منطقة تتضمن كافة المقاطع المبردة على الشريحة. سوف الدائرة منع الحلول من التدفق من الشريحة.
  6. تجنب تجفيف العينات عن طريق وضع الشرائح في صينية حيث يتم إنشاء بيئة رطبة مع القماش ورقة غارقة في الماء.
  7. تطبيق 100 ميكرولتر من العازلة حجب (الفوسفات المخزنة المالحة (PBS) التي تحتوي على 0.25٪ الكازين، والبروتين الناقل، و 0.015 M أزيد الصوديوم) لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  8. شطف الشرائح مرتين عن طريق الحضانة مع PBS-T (PBS تحتوي على 0.1٪ بولي أوكسي إيثيلين السوربيتان مونولوريت (انظر جدول المواد)لمدة 5 دقائق.
  9. تطبيق 100 درجة مئوية من الأجسام المضادة الأولية المخففة مع PBS على كل عينة، وتغطية صينية مع غطاء، وحضانة بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة.
  10. اغسل 3 مرات مع PBS-T (5 دقائق لكل غسل).
  11. تطبيق 100 درجة مئوية من الأجسام المضادة الثانوية المخففة مع PBS على كل عينة وحضانة لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
    ملاحظة: لمكافحة اللامينين تلطيخ، استخدم اليكسا فلور 568-المترافق الأجسام المضادة الثانوية. لمكافحة F4/80، المضادة للMCP-1، ومكافحة TNF-α، استخدم اليكسا فلور 568- أو 488-مترافق الأجسام المضادة الثانوية.
  12. اغسل 3 مرات مع PBS-T (5 دقائق لكل غسل).
  13. تطبيق 100 درجة مئوية من محلول DAPI المخفف مع PBS-T على كل عينة وحضانة لمدة 3 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  14. اغسل 3 مرات مع PBS-T (5 دقائق لكل منهما).
  15. جبل العينات مع تصاعد المتوسطة وتغطية لهم مع الأغطية.

5. التحليل الهيسترو مورفومتري من الجهاز الهضمي

  1. ضع الشرائح عينة على المجهر الفلوري (انظر جدول المواد)وعرض العينات باستخدام هدف 20 × مع مرشحات مناسبة (DAPI-B، 360/40 نانومتر للإثارة و 460/50 نانومتر للانبعاثات؛ GFP-B، 470/40 نانومتر للإثارة و 535/50 نانومتر للانبعاثات؛ FRITC، 540/25 نانومتر للإثارة و 605/55 نانومتر للانبعاثات.
  2. باستخدام البرنامج لتحليل الصور (انظر جدول المواد)،وقياس المنطقة المقطعية (CSA) من كل myofiber، وحساب عدد الخلايا F4/80-، MCP-1-، وTNF-α-إيجابية.
    ملاحظة: تحديد CSA من كل myofiber عن طريق تتبع الهامش الداخلي للغشاء الطابق السفلي تصور مع المضادة لللامينين-2 تلطيخ المناعة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تمشيا مع ملاحظاتنا السابقة12، وانخفضت إلى حد كبير CSA من myofibers gastrocnemius عن طريق تجميد الخلفية (الشكل 2A ، B). وعلاوة على ذلك، كشف تحليل تلطيخ الفلورة المناعية لدينا أن الخلايا التي تعبر MCP-1 و TNF-α، وكلاهما يلعب أدوارا رئيسية في تنظيم العمليات الالتهابية13،14، زادت بشكل ملحوظ في العضلات المعدية أنسجة الأطراف الخلفية المعطلة (MCP-1: الشكل 2C,F,H;...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لقد وصفنا طريقة لتطبيق التحفيز الميكانيكي ة مثل التدليك، والتي لها آثار مضادة للالتهابات. نظامنا لديه مزايا التالية حتى بالمقارنة مع تلك التي ذكرت سابقا. أولا، لم تحدد الدراسات السابقة كميا القوى الميكانيكية المطبقة2 أو تحديد أحجامها على أساس القياس على سطح الجسم، ولكن ليس داخل الأنسجة10. في المقابل، قمنا بقياس الضغط العضلي باستخدام جهاز قياس ضغط الدم. ثانيا، هيكل بسيط من جهازنا(الشكل 1B)يسمح لنا لبناء النظام مع الاتساق عالية واستنساخ

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويعلن المؤلفون أنه لا توجد مصالح متنافسة مرتبطة بالمخطوطة.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نشكر ك. ناكانيشي، ك. هاماموتو، ن. كومي، وك. تسورومي على دعمهم المستمر طوال المشروع. وقد تلقى هذا العمل دعما ً جزئياً من صندوق البحوث الداخلية التابع لوزارة الصحة والعمل والرعاية الاجتماعية اليابانية؛ المنح المقدمة للبحوث العلمية من الجمعية اليابانية لتعزيز العلم؛ برنامج معتمد من وزارة التربية والتعليم والثقافة والرياضة والعلوم والتكنولوجيا اليابانية (S1511017) بدعم من وزارة التعليم والثقافة والرياضة والعلوم والتكنولوجيا اليابانية (S1511017).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
أسلاك الألمنيومDAISO JAPANB028يتم استخدام سلك ألومنيوم لتجنب الهروب من القيود بواسطة السلك
مقياس ضغط الدمMillarSPR-671استخدام مقياس ضغط الدم لقياس الضغط العضلي.
DAPIThermo Fisher ScientificD1306DAPI هو مسبار فلوري يستخدم بشكل شائع لتلطيخ الحمض النووي للفحص المجهري الفلوري.
الماعز المضاد للأرانب Alexa Fluor 488 (نسبة التخفيف ، 1: 500)Invitrogen A11034للتلوين الكيميائي المناعي.
الماعز المضاد للفئران Alexa Fluor 568 (نسبة التخفيف ، 1: 500))Invitrogen A11077للتلوين الكيميائي المناعي.
ImageJNIHN / Aبرنامج تحليل للصورة
LabChart8ADInstrumens برنامج تحليل للحصول على الإشارات البيولوجية.
إطالة الذهبثيرمو فيشر العلميP36930إطالة الذهب لتركيب العينات الملطخة.
مصل بلوك البروتين الخاليمن داكوX090930-2لمنع تلطيخ الخلفية غير المحدد في الإجراءات الكيميائية المناعية.
المضاد أحادي النسيلة المضاد لللامينين -2 للفئران (نسبة التخفيف ، 1: 1000)المضاد Sigma AldrichL0663للتلوين الكيميائي المناعي.
المضاد أحادي النسيلة للفئران المضاد F4 / 80 (نسبة التخفيف ، 1: 500)المضاد Abcamab6640للتلوين الكيميائي المناعي.
الأرانب متعدد النسيلة المضادة ل MCP-1 (نسبة التخفيف ، 1: 1000)Abcamab25124الجسم المضاد للتلوين الكيميائي المناعي.
الأرانب متعدد النسيلة المضاد لعامل نخر الورم ألفا (نسبة التخفيف ، 1: 1000)Abcamab66579الجسم المضاد للتلوين الكيميائي المناعي.
يستخدم الشريط الجراحي3M Japan1530EP-0لتقييد حركة المفاصل.
يتم الجسم المضاد الجسم المضاد الجسم الجسم الجسم الجسم

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Furlan, A. D., Imamura, M., Dryden, T., Irvin, E. Massage for low back pain: an updated systematic review within the framework of the Cochrane Back Review Group. Spine. 34 (16), 1669-1684 (2009).
  2. Robertson, A., Watt, J. M., Galloway, S. D. R. Effects of leg massage on recovery from high intensity cycling exercise. British Journal of Sports Medicine. 38 (2), 173-176 (2004).
  3. Waters-Banker, C., Butterfield, T. A., Dupont-Versteegden, E. E. Immunomodulatory effects of massage on nonperturbed skeletal muscle in rats. Journal of Applied Physiology. 116 (2), 164-175 (2014).
  4. Haas, C., et al. Massage timing affects postexercise muscle recovery and inflammation in a rabbit model. Medicine & Science in Sports & Exercise. 45 (6), 1105-1112 (2013).
  5. Crane, J. D., et al. Massage therapy attenuates inflammatory signaling after exercise-induced muscle damage. Science Translational Medicine. 4 (119), 119ra113(2012).
  6. Bove, G. M., Harris, M. Y., Zhao, H., Barbe, M. F. Manual therapy as an effective treatment for fibrosis in a rat model of upper extremity overuse injury. Journal of the Neurological Sciences. 361, 168-180 (2016).
  7. Andrzejewski, W., et al. Increased skeletal muscle expression of VEGF induced by massage and exercise. Folia Histochemica et Cytobiologica. 53 (2), 145-151 (2015).
  8. Mantovani Junior, N., et al. Effects of massage as a recuperative technique on autonomic modulation of heart rate and cardiorespiratory parameters: a study protocol for a randomized clinical trial. Trials. 19 (1), 459(2018).
  9. Zeng, H., Butterfield, S., Agarwal, F., Haq, T., Zhao, Y. An engineering approach for quantitative analysis of the lengthwise strokes in massage therapies. Journal of Medical Devices. 2 (4), (2008).
  10. Wang, Q., et al. A mechatronic system for quantitative application and assessment of massage-like actions in small animals. Annals of Biomedical Engineering. 42 (1), 36-49 (2014).
  11. Saitou, K., et al. Local cyclical compression modulates macrophage function in situ and alleviates immobilization-induced muscle atrophy. Clinical Science. 132 (19), 2147-2161 (2018).
  12. Onda, A., et al. A New mouse model of skeletal muscle atrophy using spiral wire immobilization. Muscle Nerve. 54 (4), 788-791 (2016).
  13. Luster, A. D. Chemokines--chemotactic cytokines that mediate inflammation. The New England Journal of Medicine. 338, 436-445 (1998).
  14. Reid, M. B., Li, Y. P. Tumor necrosis factor-α and muscle wasting: a cellular perspective. Respiratory Research. 2 (5), 269-272 (2001).
  15. Baumann, J. U., Sutherland, M. D., Hangg, A. Intramuscular pressure during walking: An experimental study using the wick catheter technique. Clinical Orthopaedics Related Research. 145, 292-299 (1979).
  16. Lee, I., et al. Effect of physical inactivity on major non-communicable diseases worldwide: an analysis of burden of disease and life expectancy. Lancet. 380, 219-229 (2012).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Local Cyclical CompressionIntramuscular Pressure MonitoringMouse Hindlimb ImmobilizationGastrocnemius Muscle AnalysisHistomorphometric AnalysisImmunofluorescent StainingMacrophage AccumulationMuscle AttenuationMechanical RegulationBiological Signal Analysis

مقالات ذات صلة