Method Article

العزلوالتقييم الكمي لخلايا الفرشاة من القصبة الهوائية للفأر

DOI:

10.3791/59496

⸱

June 12th, 2019

 ,  ,  , 
1Division of Rheumatology, Allergy and Immunology, Brigham and Women's Hospital, Harvard Medical School

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

خلايا الفرشاة هي خلايا ظهارية حساسة كيميائية نادرة موجودة في القصبة الهوائية للفأر السذاجة. نظرا لأعدادهم المحدودة، وتقييم من الجسم الحي من دورهم الوظيفي في حصانة مجرى الهواء وإعادة عرض تحديا. نحن نصف طريقة لعزل خلايا فرشاة القصبة الهوائية عن طريق قياس التدفق.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

خلايا فرشاة القصبة الهوائية هي خلايا الظهارية الحسية الكيميائية الكولينية تستعد لنقل الإشارات من تجويف مجرى الهواء إلى الجهاز المناعي والعصبي. وهي جزء من عائلة من الخلايا الظهارية الحسية الكيميائية التي تشمل خلايا خصلة في الغشاء المخاطي المعوي، وخلايا الفرشاة في القصبة الهوائية، والخلايا الحسية الكيميائية الانفرادية والخلايا الدقيقة في الغشاء المخاطي للأنفية. تشترك الخلايا الحسية الكيميائية في المقصورات الظهارية المختلفة في علامات رئيسية داخل الخلايا وتوقيع النسخ الأساسي، ولكنها تظهر أيضًا تباينًا نسخيًا كبيرًا، مما يعكس على الأرجح بيئة الأنسجة المحلية. مطلوب عزل خلايا فرشاة القصبة الهوائية من تعليق خلية واحدة لتحديد وظيفة هذه الخلايا الظهارية النادرة بالتفصيل، ولكن عزلتها صعبة، وربما يرجع ذلك إلى التفاعل الوثيق بين خلايا فرشاة القصبة الهوائية والنهايات العصبية أو بسبب تكوين مجرى الهواء محددة من تقاطعات ضيقة وadherens. هنا، ونحن نصف إجراء لعزل خلايا الفرشاة من ظهارة القصبة الهوائية الماوس. ويستند الأسلوب على فصل أولي من ظهارة القصبة الهوائية من الغشاء المخاطي تحت المخاطية، مما يسمح لحضانة أقصر لاحقة من ورقة الظهارية مع الباباين. يوفر هذا الإجراء حلاً سريعاً ومريحاً لفرز التدفق السيتومتري والتحليل الوظيفي لخلايا فرشاة القصبة الهوائية القابلة للحياة.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

خلايا الفرشاة تنتمي إلى فئة من الخلايا الظهارية الكيميائية الحسية التي تتميز بالتعبير عن مستقبلات الذوق المر وطعم مستقبلات آلات تحويل وجدت في خلايا برعم الذوق. على عكس خلايا برعم الذوق، تنتشر الخلايا الظهارية الحسية الكيميائية في الأسطح الظهارية ويشار إليها باسم الخلايا الحسية الكيميائية الانفرادية (SCCs) والخلايا الدقيقة في ظهارة الأنف1،2، خلايا الفرشاة في القصبة الهوائية 3،4، وخلايا خصلة في الأمعاء5،6. كما توجد الخلايا الظهارية التي تعبر عن مستقبلات الطعم المر وآلات تحويل الطعم المر في مجرى البول7و8 والأنبوب السمعي9. خلايا فرشاة مجرى الهواء لها وظائف فريدة من نوعها في استجابات مجرى الهواء العصبي والمناعي. فهي الخلايا الحسية الكيميائية المنتجة لأستيل التي تثير ردود الفعل التنفسية الواقية عند التنشيط مع المركبات المريرة والأيض البكتيرية مثل المواد استشعار النصاب10. خلايا فرشاة مجرى الهواء هي أيضا المصدر الظهاري الرئيسي للمجرى الهوائي IL-25، الذيينظم التهاب النوع 2 من نوع 2 في المسالك الهوائية 3.

تم تحديد توصيف النسخ الكامل لخلايا فرشاة مجرى الهواء السفلي واستجابتها للمحفزات البيئية بانخفاض أعدادها في ظهارة القصبة الهوائية وأعداد محدودة جدا ً تتجاوز الشعب الهوائية الكبيرة10. التقنيات المستخدمة لعزل الخلايا الحسية الكيميائية من ظهارة الأمعاء لم تسفر عن أعداد عالية نسبيا من القصبة الهوائية، وربما بسبب الاتصالات الحميمة من خلايا فرشاة القصبة الهوائية مع النهايات العصبية10 أو غيرها العوامل الخاصة بالأنسجة في الغشاء المخاطي للجهاز التنفسي مثل تكوين الالتصاق والبروتينات تقاطع ضيق. التقارير الأخيرة عن العزلة الناجحة لخلايا فرشاة القصبة الهوائية بأعداد أعلى لتحليل تسلسل الحمض النووي الريبي خلية واحدة تستخدم إما حضانة 2 ح مع الباباين أو حضانة 18 ح مع pronase11,12. منذ أطول الحضانة مع الإنزيمات الهضمية يمكن أن تقلل من قدرة الخلية على البقاء وتغيير الملف الشخصي النسخي للخلايا من الأنسجة المهضومة13، وهذا يمكن أن التحيز التحليل المقارن مع غيرها من السكان الظهارية الحسية الكيميائية.

هنا، ونحن الإبلاغ عن طريقة لعزل خلايا فرشاة القصبة الهوائية لتسلسل RNA3. علاج القصبة الهوائية مع ديسباس جرعة عالية يفصل ظهارة من تحت المخاطية. الهضم اللاحق للورقة الظهارية مع الباباين يسمح لاسترداد ممتاز من هذه الخلية الهيكلية.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

قبل إجراء التجارب التالية، تأكد من أن جميع استخدام الرعاية الحيوانية والبروتوكولات تتم الموافقة عليها من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها (IACUC) وتنفيذها وفقا ً لدليل "مجلس البحوث الوطني لرعاية واستخدام الحيوانات". مختبر الحيوانات" (الطبعة8، 2011) والمبادئ التوجيهية وصول. وقد استعرضت اللجنة المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها في مستشفى بريغام ومستشفى النساء جميع الإجراءات المبينة أدناه ووافقت عليها.

1. إعداد الكواشف

  1. إعداد حل الهضم ديسباسي، وهو حل PBS تحتوي على 16 U / مل ديسباسي و 20 ميكروغرام / مل DNase I. تأكد من أن يتم حل مسحوق ديسباسي تماما قبل تسخين الحل في حمام مائي في 37 درجة مئوية.
  2. أضف 5% مصل البقر الجنيني المعطلة حرارياً (FBS) إلى Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) لجعل حل التوقف.
  3. إعداد Tyrode I العازلة: إضافة 26 U / مل بابين (20 درجة مئوية / مل من 48 U / ملغ حل البابين) و 10 ميكرول / مل L-سيستين إلى العازلة HEPES-Tyrode دون الكالسيوم.
  4. إعداد Tyrode الثاني العازلة: إضافة 2 ميكرولتر / مل ليوبيبين (5 ملغ / مل) إلى العازلة HEPES-Tyrode مع الكالسيوم.
  5. إعداد FACS العازلة: استخدام حل الملح المتوازن هانكس (HBSS) دون الكالسيوم والمغنيسيوم والفينول الأحمر، وتستكمل مع 2 M حمض الإيثيلين ديامينتيتراسيتيك (EDTA) وإضافة 2٪ FBS.

2. تشريح القصبة الهوائية الماوس

ملاحظة: الفئران المستخدمة في هذا البروتوكول هي ChAT(BAC)-eGFP (B6. Cg-Tg (RP23- 268L19-EGFP)2Mik/J)، 3-6 أشهر من العمر لكلا الجنسين. تقليل تعرض الأنسجة للضوء المباشر للحد من ابيضاض الضوء من eGFP.

  1. قتل الفأر مع 100 ملغ / كغ البنتوباربيتال القتل الرحيم الحل حقن داخل الصفاق أو باستخدام البروتوكولات القياسية التي وافقت عليها IACUC.
  2. إصلاح الماوس على لوحة جراحية في موقف supine مع الإبر G 21 مع الأطراف العليا والسفلى الموسعة. رش الفراء مع EtOH 70٪ لتطهير المنطقة.
  3. باستخدام ملقط مستقيم، ورفع الجلد والفراء من البطن وجعل شق في المركز مع مقص تشريح (مقص مستقيم، 3 سم). باستخدام المقص، فصل الجلد من الأنسجة تحت الجلد من البطن إلى المنديبولا. أثناء حمل الأنسجة تحت الجلد مع الملقط، قم بعمل شق صغير مع المقص في وسط جدار البطن.
  4. افتح البابرق بشق على شكل حرف V. باستخدام الملقط، نقل بلطف الأمعاء الدقيقة إلى الجانب، وتحديد موقع الشريان الأبهر البطني والوريد كافا وإجراء شق مع مقص تشريح للسماح للexsanguination السريع.
  5. حدد موقع الحجاب الحاجز. باستخدام إبرة 18 G، وجعل فتحة في الحجاب الحاجز أسفل القص مباشرة لتحلل الرئتين. فصل الحجاب الحاجز بعناية من القفص الصدري باستخدام حاد وأشار مقص تشريح مستقيم لقطع على طول قاعدة الأضلاع.
  6. باستخدام الملقط، رفع الطرف المكشوف من القص وقطع القص طوليا من قاعدة القفص الصدري إلى الرقبة. قم بعمل شق عنق الرحم المركزي مع مقص مستقيم قصير (2 سم) وفصل فصوص الغدة تحت الفك السفلي.
  7. قم بإزالة النسيج الضام المحيط والغدة الصعترية المحيطة بعناية فوق الكارينا مع زوج من الملقط عالي الدقة.
  8. تشريح القصبة الهوائية الحرة أولا عن طريق فصل نهاية القريبة على مستوى epiglottis ومن ثم عن طريق تشريح نهاية القاصي على مستوى الانقسام من القصبة الهوائية.
  9. تحديد موقع epiglottis وقطع القصبة الهوائية طوليا من epiglottis إلى كارينا.

3. القصبة الهوائية الهضم الظهاري

  1. ضع القصبة الهوائية في أنبوب 1.5 مل يحتوي على 750 ميكرولتر من محلول الهضم المُدفأ مسبقاً (إلى 37 درجة مئوية). احتضان على شاكر في 200 دورة في الدقيقة لمدة 40 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. تغطية الأنبوب مع رقائق الألومنيوم للحد من التعرض للضوء المباشر.
  2. إضافة 750 درجة مئوية من DMEM الباردة مع FBS 5٪ لوقف رد الفعل. ضعها على الجليد.
  3. نقل القصبة الهوائية إلى طبق بيتري (100 مم × 15 مم) ووضعها تحت المجهر تشريح. توجيه القصبة الهوائية مع الجانب الظهاري ة تواجه. الرغامى تشريح طوليا له شكل شبه أسطواني الحفاظ عليها من قبل الحلقات الغضروفية. الظهارة على سطح مقعر.
  4. ربط منطقة epiglottis من القصبة الهوائية مع ملقط مستقيم إلى طبق بيتري واستخدام حجم 22 مشرط المتاح، كشط ظهارة قبالة القصبة الهوائية. وتفصل الطبقة الظهارية كورقة شفافة.
  5. يُفرم الظهارة مع المشرط. نقل الطبقة الظهارية إلى أنبوب 2 مل.
  6. شطف طبق بيتري مع 750 درجة مئوية من Tyrode I العازلة ونقل إلى أنبوب 2 مل التي تحتوي على طبقة الظهارية.
  7. احتضان الطبقة الظهارية القصبة الهوائية في Tyrode I العازلة لمدة 30 دقيقة في 37 درجة مئوية على شاكر في 200 دورة في الدقيقة. تغطية الأنبوب مع رقائق الألومنيوم للحد من التعرض للضوء المباشر.
  8. إضافة 750 درجة مئوية من المخزن المؤقت Tyrode الثاني الباردة. دوامة الأنسجة المهضومة بقوة لمدة 20-30 s. Triturate التجانس مع حقنة تعلق على إبرة 18 G 10 مرات.  التبديل إلى إبرة قياس 21 G وtriturate 10-20 مرات أخرى.
  9. تصفية الخلايا من خلال مصفاة 100 ميكرومتر في أنبوب مخروطي 50 مل. إضافة 30:1 المجلد/المجلد من المخزن المؤقت FACS الباردة.
  10. تدور في 350 × ز لمدة 10 دقيقة في 4 درجة مئوية وتجاهل supernatant. إعادة تعليق بيليه في العازلة FACS الباردة ونقل التعليق إلى أنبوب البوليسترين 12 مم × 75 ملم (5 مل). تدور مرة أخرى في 350 × ز لمدة 10 دقيقة في 4 درجة مئوية وتجاهل supernatant.
  11. إعادة تعليق بيليه في 100 درجة مئوية من المخزن المؤقت FACS.
  12. إضافة 1 μL من CD16/32 المضادة للماوس حجب لمنع غير محددة ملزمة وحضانة لمدة 15 دقيقة على الجليد. لا تغسل.
  13. إضافة الأجسام المضادة التالية وعناصر التحكم ذات النمط isotype ذات الصلة: الأزرق المحيط الهادئ المضادة للماوس CD45 أو الفئران IgG2a، ك (0.25 ميكروغرام /106 خلايا في حجم 100 ميكرولتر) وallophycocyanin (APC) المضادة للماوس EpCAM أو الفئران IgG2b، ك (0.5 ميكروغرام / 106 خلايا في حجم 100 ميكرولتر) الأجسام المضادة أحادية النسيلة. حضانة لمدة 45 دقيقة على الجليد محمية من الضوء المباشر. إضافة 4.5 مل من المخزن المؤقت FACS الباردة، مزيج وتدور في 350 × ز لمدة 10 دقيقة في 4 درجة مئوية. تجاهل المخزن المؤقت FACS وإعادة تعليق بيليه في 300 μL من المخزن المؤقت FACS الباردة.
  14. إضافة يوديد بروبيديوم (PI) (5 ميكروغرام / مل) مباشرة قبل فرز التدفق السيتومتري.
    ملاحظة: خلايا الفرشاة لها شكل غير منتظم مع العديد من العمليات التي يمكن أن تزيد من التزامها بالمرشحات (الشكل3C). قارنا 30 مم إلى 70 مم و 100 مم مرشحات ووجدت أن مرشحات المسام أكبر ضمان عوائد أفضل. وبالإضافة إلى ذلك، فإن التشعب الشامل لتعليق الخلية بعد هضم البابين يحسن بشكل كبير من غلة خلية الفرشاة. نوصي باستخدام إبرة 18G لثلاثية الأولية تليها تتحمل أصغر (21 أو 23 G إبرة) لانفصال أدق من الخلايا.

4. تدفق قياس السيتومتري ة استراتيجية التجمع

  1. تحديد الخلايا من الحطام من زاوية التشتت الأمامي والجانبي. استبعاد doublets باستخدام ارتفاع مبعثر إلى الأمام والعرض والجانب مبعثر الارتفاع والعرض. تكون doublets الخلايا التي تحتوي على قيم عالية العرض.
  2. داخل الخلايا المفردة، حدد الخلايا الحية كمجموعة سالبة PI.
  3. داخل الخلايا المفردة المباشرة، حدد الخلايا CD45 المنخفضة إلى السالبة استناداً إلى عنصر تحكم isotype.
  4. داخل الخلايا CD45 منخفضة/سالبة، تحديد الخلايا الإيجابية EpCAM التي هي أيضا eGFP إيجابية (في قناة FITC). هذا هو عدد خلايا الفرشاة (الشكل2A).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم تنفيذ هذا الإجراء بنجاح لعزل خلايا فرشاة القصبة الهوائية لتسلسل RNA3. بعد عزل القصبة الهوائية وهضم الأنسجة مع بروتوكولمن خطوتين (الشكل 1)، تم جمع الخلايا وملطخة CD45 وEpCAM المسمى بفلورسنت بعد استبعاد الخلايا الميتة مع PI. بعد gating خارج doublets على أساس خصائص مبعثر إلى الأمام والجانب، حددنا خلايا الفرشاة بأنها منخفضة / سلبية لCD45، إيجابية لEpCAM وإيجابية لeGFP (الشكل2A). تمثل خلايا الفرشاة ~ 0.16-0.42٪ من خلايا CD4...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وجدنا أن مزيج من العلاج بجرعة عالية ديسباس لمدة 40 دقيقة تليها علاج البابين قصيرة (30 دقيقة) يوفر بروتوكول الأمثل لهضم القصبة الهوائية وعزل خلايا الفرشاة. هذا المزيج على حد سواء يتجنب الهضم واسعة النطاق وتنتج أعلى عائد من خلايا الفرشاة، مقارنة مع بروتوكولات بديلة.

في حين أن هضم الرئة لاستخراج الخلايا المكونة للدم قد اعتمد بشكل كلاسيكي على الإنزيمات الهضمية خفيفة مثل collagenase IV15، فإن عزل الخلايا الظهارية يتطلب بروتوكولات أكثر تعقيدا. تعليق خلية واحدة من الخلايا الظه...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نشكر آدم تشيكوين في بريغام ومركز المناعة البشرية للمرأة تدفق الأساسية لمساعدته في فرز التدفق الخلوي. وقد دعم هذا العمل المعاهد الوطنية للمنح الصحية R01 HL120952 (N.A.B.), R01 AI134989 (N.A.B), U19 AI095219 (N.A.B., L.G.B)، وK08 AI132723 (L.G.B)، والأكاديمية الأمريكية للحساسية والربو والمناعة (AAAAI)/ حساسية الرئة الأمريكية جائزة أمراض الجهاز التنفسي ،من قبل مؤسسة AAAAI جائزة تطوير أعضاء هيئة التدريس (L.G.B.)، من قبل ستيفن وجودي كاي جائزة المبتكرين الشباب (N.A.B.)، من قبل صندوق جويسلين C. أوستن للتطوير الوظيفي للعلماء الطبيبات (L.G.B.)، و تبرع سخي من قبل عائلة فيك (L.G.B.).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
<قوي >أجسام مضادة < / قوي >
مضاد ل GFP (الماعز متعدد النسيلة Ig) Abcamcat # ab5450
APC مضاد للفأر CD326 (EpCAM)   ؛ (G8.8)Biolegendcat # 118214
APC Rat IgG2a ، k التحكم في النمط المتشافيBiolegendcat # 400511
DAPIBiolegendcat # 422801
الحمار المضاد للماعز IgG (H + L) الجسم المضاد الثانوي عالي الامتصاص ، Alexa Fluor 488Life Technologies / المجسات الجزيئيةcat # A-11055
Normal Goat IgGR & D Systemscat # AB-108-C
Pacific Blue المضاد للفأر CD45 (30F-11) Biolegendcat # 103126
Blue Rat IgG2b ، k التحكم في النمط المتشاويBiolegendcat # 400627
TruStain FcX (مضاد للفأر CD16 / 32) الأجسام المضادةBiolegendcat # 101320
المواد الكيميائية والببتيدات والبروتينات المؤتلفة
متباينةقطةجيبكو # 17105041 
DNase ISigma قطة # 10104159001
هيبس تيرود s عازلة بدون كالسيوم (10 ملي مولار هيبلس ، 135 ملي كلوريد الصوديوم ، 2.8 ملي كلوريد كلوريد ، 1 ملي مللي كلوريد < >2< / فرعي > ، 12 ملي مولار هيدروكلوريد الصوديوم < الفرعي >3< / فرعي > ، 0.4 ملي هيدروكلوريد الصوديوم < الفرعي >2 < / فرعي > PO < sub > 4 < / sub > ، 0.25٪ BSA ، 5.5 ملي مولار جلوكوز. محضرة في ماء 18.2 ميغا أوم وتصفيت من خلال 0.22 & ميكرو ؛ م مرشحبوسطن BioProductsالقط # PY-912
Tyrode ' s محلول (HEPES-Buffered) 140 ملي كلوريد الصوديوم ، 5 ملي كلوريد الصوديوم ، 25 ملي مولار هيبس ، 2 ملي كاستيريوم < فرعي >2< / فرعي > ، 2 ملي مولار كلوريد الملغنيد كلوريد < >2 < / فرعي > و 10 ملي مولار جلوكوز. محضرة في ماء 18.2 ميغا أوم وتصفيت من خلال 0.22 & ميكرو ؛ مرشح م. قطةبوسطن للمنتجاتالحيوية # BSS-355
L-CysteineSigmacat # C7352
Leupeptin ملح ثلاثي فلورو أسيتاتSigmacat # L2023
غراء من البابايا اللاتكسSigmacat # P3125
يوديد البروبيديوم   ؛القط السيجما# P4170
<قوي>النماذج التجريبية: الكائنات الحية / السلالات < / قوية >
ChATBAC< / sup>-eGFP (B6. CG-Tg (RP23-268L19-EGFP) 2Mik/J)مختبر جاكسون7902
<قوي>المعدات
LSM 800 مع نظام Airyscan متحد البؤر   على a  Zeiss Axio Observer Z1 مجهر مقلوبZeiss
LSRFortessaBD647465
<قوي > معدات يمكن التخلص منها< / قوي>
1.5 مل أنابيب معقمةتوماس سيانتيفك1157C86
5 مل أنبوب Poysterene دائري القاع ، 12 مم × 75 ممنمط Falcon14-959-1A
50 مل أنبوب مخروطي من مادة البولي بروبلين ، 30 مم × 115 ممفالكون352098
ريش يمكن التخلص منه رقم 12NC9999403 فيشر
العلمي ، 100 مم × 15 ممالصقر
، 100 مو ؛ مقطة فيشربراند# 22363549
Pacific مشرط طبق بتري مصفاة خلية معقمة 351029

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Tizzano, M., et al. Nasal chemosensory cells use bitter taste signaling to detect irritants and bacterial signals. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (7), 3210-3215 (2010).
  2. Genovese, F., Tizzano, M. Microvillous cells in the olfactory epithelium express elements of the solitary chemosensory cell transduction signaling cascade. PLoS One. 13 (9), 0202754(2018).
  3. Bankova, L. G., et al. The cysteinyl leukotriene 3 receptor regulates expansion of IL-25-producing airway brush cells leading to type 2 inflammation. Science Immunology. 3 (28), (2018).
  4. Krasteva, G., Canning, B. J., Papadakis, T., Kummer, W. Cholinergic brush cells in the trachea mediate respiratory responses to quorum sensing molecules. Life Sciences. 91 (21-22), 992-996 (2012).
  5. Nadjsombati, M. S., et al. Detection of Succinate by Intestinal Tuft Cells Triggers a Type 2 Innate Immune Circuit. Immunity. 49 (1), 33-41 (2018).
  6. von Moltke, J., Ji, M., Liang, H. E., Locksley, R. M. Tuft-cell-derived IL-25 regulates an intestinal ILC2-epithelial response circuit. Nature. 529 (7585), 221-225 (2016).
  7. Deckmann, K., et al. Bitter triggers acetylcholine release from polymodal urethral chemosensory cells and bladder reflexes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (22), 8287-8292 (2014).
  8. Liu, S., et al. Members of Bitter Taste Receptor Cluster Tas2r143/Tas2r135/Tas2r126 Are Expressed in the Epithelium of Murine Airways and Other Non-gustatory Tissues. Frontiers in Physiology. 8, 849(2017).
  9. Krasteva, G., et al. Cholinergic chemosensory cells in the auditory tube. Histochemistry and Cell Biology. 137 (4), 483-497 (2012).
  10. Krasteva, G., et al. Cholinergic chemosensory cells in the trachea regulate breathing. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (23), 9478-9483 (2011).
  11. Montoro, D. T., et al. A revised airway epithelial hierarchy includes CFTR-expressing ionocytes. Nature. 560 (7718), 319-324 (2018).
  12. Plasschaert, L. W., et al. A single-cell atlas of the airway epithelium reveals the CFTR-rich pulmonary ionocyte. Nature. 560 (7718), 377-381 (2018).
  13. Dwyer, D. F., Barrett, N. A., Austen, K. F. Immunological Genome Project, C. Expression profiling of constitutive mast cells reveals a unique identity within the immune system. Nature Immunology. 17 (7), 878-887 (2016).
  14. Howitt, M. R., et al. Tuft cells, taste-chemosensory cells, orchestrate parasite type 2 immunity in the gut. Science. 351 (6279), 1329-1333 (2016).
  15. Bankova, L. G., Dwyer, D. F., Liu, A. Y., Austen, K. F., Gurish, M. F. Maturation of mast cell progenitors to mucosal mast cells during allergic pulmonary inflammation in mice. Mucosal Immunology. 8 (3), 596-606 (2015).
  16. Rock, J. R., et al. Basal cells as stem cells of the mouse trachea and human airway epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (31), 12771-12775 (2009).
  17. Rock, J. R., et al. Multiple stromal populations contribute to pulmonary fibrosis without evidence for epithelial to mesenchymal transition. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (52), 1475-1483 (2011).
  18. Gerbe, F., et al. Intestinal epithelial tuft cells initiate type 2 mucosal immunity to helminth parasites. Nature. 529 (7585), 226-230 (2016).
  19. Rock, J. R., et al. Transmembrane protein 16A (TMEM16A) is a Ca2+-regulated Cl- secretory channel in mouse airways. Journal of Biological Chemistry. 284 (22), 14875-14880 (2009).
  20. Olsen, J. V., Ong, S. E., Mann, M. Trypsin cleaves exclusively C-terminal to arginine and lysine residues. Molecular and Cellular Proteomics. 3 (6), 608-614 (2004).
  21. Verma, S., Dixit, R., Pandey, K. C. Cysteine Proteases: Modes of Activation and Future Prospects as Pharmacological Targets. Frontiers in Pharmacology. 7, 107(2016).
  22. Huettner, J. E., Baughman, R. W. Primary culture of identified neurons from the visual cortex of postnatal rats. Journal of Neuroscience. 6 (10), 3044-3060 (1986).
  23. Kaiser, O., et al. Dissociated neurons and glial cells derived from rat inferior colliculi after digestion with papain. PLoS One. 8 (12), 80490(2013).
  24. Aoyagi, T., Takeuchi, T., Matsuzaki, A., Kawamura, K., Kondo, S. Leupeptins, new protease inhibitors from Actinomycetes. Journal of Antibiotics (Tokyo). 22 (6), 283-286 (1969).
  25. Kohanski, M. A., et al. Solitary chemosensory cells are a primary epithelial source of IL-25 in patients with chronic rhinosinusitis with nasal polyps. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 142 (2), 460-469 (2018).
  26. Patel, N. N., et al. Solitary chemosensory cells producing interleukin-25 and group-2 innate lymphoid cells are enriched in chronic rhinosinusitis with nasal polyps. International Forum of Allergy & Rhinology. , (2018).
  27. Kouzaki, H., O'Grady, S. M., Lawrence, C. B., Kita, H. Proteases induce production of thymic stromal lymphopoietin by airway epithelial cells through protease-activated receptor-2. The Journal of Immunology. 183 (2), 1427-1434 (2009).
  28. Cambier, J. C., Vitetta, E. S., Kettman, J. R., Wetzel, G. M., Uhr, J. W. B-cell tolerance. III. Effect of papain-mediated cleavage of cell surface IgD on tolerance susceptibility of murine B cells. The Journal of Experimental Medicine. 146 (1), 107-117 (1977).
  29. Nishikado, H., et al. Cysteine protease antigens cleave CD123, the alpha subunit of murine IL-3 receptor, on basophils and suppress IL-3-mediated basophil expansion. Biochemical and Biophysical Research Communications. 460 (2), 261-266 (2015).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Tracheal Brush CellsEpithelial IsolationPapain DigestionFlow Cytometric SortingDispase TreatmentCell ViabilityChAT eGFP ReporterFACS BufferPropidium IodideEpCAM Positive

Related Articles