خلايا الفرشاة هي خلايا ظهارية حساسة كيميائية نادرة موجودة في القصبة الهوائية للفأر السذاجة. نظرا لأعدادهم المحدودة، وتقييم من الجسم الحي من دورهم الوظيفي في حصانة مجرى الهواء وإعادة عرض تحديا. نحن نصف طريقة لعزل خلايا فرشاة القصبة الهوائية عن طريق قياس التدفق.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
العزلوالتقييم الكمي لخلايا الفرشاة من القصبة الهوائية للفأر
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
خلايا فرشاة القصبة الهوائية هي خلايا الظهارية الحسية الكيميائية الكولينية تستعد لنقل الإشارات من تجويف مجرى الهواء إلى الجهاز المناعي والعصبي. وهي جزء من عائلة من الخلايا الظهارية الحسية الكيميائية التي تشمل خلايا خصلة في الغشاء المخاطي المعوي، وخلايا الفرشاة في القصبة الهوائية، والخلايا الحسية الكيميائية الانفرادية والخلايا الدقيقة في الغشاء المخاطي للأنفية. تشترك الخلايا الحسية الكيميائية في المقصورات الظهارية المختلفة في علامات رئيسية داخل الخلايا وتوقيع النسخ الأساسي، ولكنها تظهر أيضًا تباينًا نسخيًا كبيرًا، مما يعكس على الأرجح بيئة الأنسجة المحلية. مطلوب عزل خلايا فرشاة القصبة الهوائية من تعليق خلية واحدة لتحديد وظيفة هذه الخلايا الظهارية النادرة بالتفصيل، ولكن عزلتها صعبة، وربما يرجع ذلك إلى التفاعل الوثيق بين خلايا فرشاة القصبة الهوائية والنهايات العصبية أو بسبب تكوين مجرى الهواء محددة من تقاطعات ضيقة وadherens. هنا، ونحن نصف إجراء لعزل خلايا الفرشاة من ظهارة القصبة الهوائية الماوس. ويستند الأسلوب على فصل أولي من ظهارة القصبة الهوائية من الغشاء المخاطي تحت المخاطية، مما يسمح لحضانة أقصر لاحقة من ورقة الظهارية مع الباباين. يوفر هذا الإجراء حلاً سريعاً ومريحاً لفرز التدفق السيتومتري والتحليل الوظيفي لخلايا فرشاة القصبة الهوائية القابلة للحياة.
المقدمة
خلايا الفرشاة تنتمي إلى فئة من الخلايا الظهارية الكيميائية الحسية التي تتميز بالتعبير عن مستقبلات الذوق المر وطعم مستقبلات آلات تحويل وجدت في خلايا برعم الذوق. على عكس خلايا برعم الذوق، تنتشر الخلايا الظهارية الحسية الكيميائية في الأسطح الظهارية ويشار إليها باسم الخلايا الحسية الكيميائية الانفرادية (SCCs) والخلايا الدقيقة في ظهارة الأنف1،2، خلايا الفرشاة في القصبة الهوائية 3،4، وخلايا خصلة في الأمعاء5،6. كما توجد الخلايا الظهارية التي تعبر عن مستقبلات الطعم المر وآلات تحويل الطعم المر في مجرى ا....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
قبل إجراء التجارب التالية، تأكد من أن جميع استخدام الرعاية الحيوانية والبروتوكولات تتم الموافقة عليها من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها (IACUC) وتنفيذها وفقا ً لدليل "مجلس البحوث الوطني لرعاية واستخدام الحيوانات". مختبر الحيوانات" (الطبعة8، 2011) والمبادئ التوجيهية وصول. وقد استعرضت اللجنة المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها في مستشفى بريغام ومستشفى النساء جميع الإجراءات المبينة أدناه ووافقت عليها.
1. إعداد الكواشف
- إعداد حل الهضم ديسباسي، وهو حل PBS تحتوي على 16 U / مل ديسباسي و 20 ميكروغرام / مل DNase I. تأكد من أن يتم حل مسحوق ديسباسي تماما قبل تسخين الحل في حمام مائي في 37 درجة مئوية....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
تم تنفيذ هذا الإجراء بنجاح لعزل خلايا فرشاة القصبة الهوائية لتسلسل RNA3. بعد عزل القصبة الهوائية وهضم الأنسجة مع بروتوكولمن خطوتين (الشكل 1)، تم جمع الخلايا وملطخة CD45 وEpCAM المسمى بفلورسنت بعد استبعاد الخلايا الميتة مع PI. بعد gating خارج doublets على أساس خصائص مبعثر إلى الأمام والجانب، حددنا خلايا الفرشاة بأنها منخفضة / سلبية لCD45، إيجابية لEpCAM وإيجابية لeGFP (الشكل2A). تمثل خلايا الفرشاة ~ 0.16-0.42٪ من خلايا CD4.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
وجدنا أن مزيج من العلاج بجرعة عالية ديسباس لمدة 40 دقيقة تليها علاج البابين قصيرة (30 دقيقة) يوفر بروتوكول الأمثل لهضم القصبة الهوائية وعزل خلايا الفرشاة. هذا المزيج على حد سواء يتجنب الهضم واسعة النطاق وتنتج أعلى عائد من خلايا الفرشاة، مقارنة مع بروتوكولات بديلة.
في حين أن هضم الرئة لاستخراج الخلايا المكونة للدم قد اعتمد بشكل كلاسيكي على الإنزيمات الهضمية خفيفة مثل collagenase IV15، فإن عزل الخلايا الظهارية يتطلب بروتوكولات أكثر تعقيدا. تعليق خلية واحدة من الخلايا الظه.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.
شكر وتقدير
نشكر آدم تشيكوين في بريغام ومركز المناعة البشرية للمرأة تدفق الأساسية لمساعدته في فرز التدفق الخلوي. وقد دعم هذا العمل المعاهد الوطنية للمنح الصحية R01 HL120952 (N.A.B.), R01 AI134989 (N.A.B), U19 AI095219 (N.A.B., L.G.B)، وK08 AI132723 (L.G.B)، والأكاديمية الأمريكية للحساسية والربو والمناعة (AAAAI)/ حساسية الرئة الأمريكية جائزة أمراض الجهاز التنفسي ،من قبل مؤسسة AAAAI جائزة تطوير أعضاء هيئة التدريس (L.G.B.)، من قبل ستيفن وجودي كاي جائزة المبتكرين الشباب (N.A.B.)، من قبل صندوق جويسلين C. أوستن للتطوير الوظيفي للعلماء الطبيبات (L.G.B.)، و تبرع سخي من قبل عائلة فيك (L.G.B.).
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| <قوي >أجسام مضادة < / قوي > | |||
| مضاد ل GFP (الماعز متعدد النسيلة Ig) Abcam | cat # ab5450 | ||
| APC مضاد للفأر CD326 (EpCAM) ؛ (G8.8) | Biolegend | cat # 118214 | |
| APC Rat IgG2a ، k التحكم في النمط المتشافي | Biolegend | cat # 400511 | |
| DAPI | Biolegend | cat # 422801 | |
| الحمار المضاد للماعز IgG (H + L) الجسم المضاد الثانوي عالي الامتصاص ، Alexa Fluor 488 | Life Technologies / المجسات الجزيئية | cat # A-11055 | |
| Normal Goat IgG | R & D Systems | cat # AB-108-C | |
| Pacific Blue المضاد للفأر CD45 (30F-11) Biolegend | cat # 103126 | ||
| Blue Rat IgG2b ، k التحكم في النمط المتشاوي | Biolegend | cat # 400627 | |
| TruStain FcX (مضاد للفأر CD16 / 32) الأجسام المضادة | Biolegend | cat # 101320 | |
| المواد الكيميائية والببتيدات والبروتينات المؤتلفة | |||
| متباينة | قطة | جيبكو # 17105041 | |
| DNase I | Sigma | قطة # 10104159001 | |
| هيبس تيرود s عازلة بدون كالسيوم (10 ملي مولار هيبلس ، 135 ملي كلوريد الصوديوم ، 2.8 ملي كلوريد كلوريد ، 1 ملي مللي كلوريد < >2< / فرعي > ، 12 ملي مولار هيدروكلوريد الصوديوم < الفرعي >3< / فرعي > ، 0.4 ملي هيدروكلوريد الصوديوم < الفرعي >2 < / فرعي > PO < sub > 4 < / sub > ، 0.25٪ BSA ، 5.5 ملي مولار جلوكوز. محضرة في ماء 18.2 ميغا أوم وتصفيت من خلال 0.22 & ميكرو ؛ م مرشح | بوسطن BioProducts | القط # PY-912 | |
| Tyrode ' s محلول (HEPES-Buffered) 140 ملي كلوريد الصوديوم ، 5 ملي كلوريد الصوديوم ، 25 ملي مولار هيبس ، 2 ملي كاستيريوم < فرعي >2< / فرعي > ، 2 ملي مولار كلوريد الملغنيد كلوريد < >2 < / فرعي > و 10 ملي مولار جلوكوز. محضرة في ماء 18.2 ميغا أوم وتصفيت من خلال 0.22 & ميكرو ؛ مرشح م. قطة | بوسطن للمنتجات | الحيوية # BSS-355 | |
| L-Cysteine | Sigma | cat # C7352 | |
| Leupeptin ملح ثلاثي فلورو أسيتات | Sigma | cat # L2023 | |
| غراء من البابايا اللاتكس | Sigma | cat # P3125 | |
| يوديد البروبيديوم ؛ | القط السيجما | # P4170 | |
| <قوي>النماذج التجريبية: الكائنات الحية / السلالات < / قوية > | |||
| ChATBAC< / sup>-eGFP (B6. CG-Tg (RP23-268L19-EGFP) 2Mik/J) | مختبر جاكسون | 7902 | |
| <قوي>المعدات | |||
| LSM 800 مع نظام Airyscan متحد البؤر على a Zeiss Axio Observer Z1 مجهر مقلوب | Zeiss | ||
| LSRFortessa | BD | 647465 | |
| <قوي > معدات يمكن التخلص منها< / قوي> | |||
| 1.5 مل أنابيب معقمة | توماس سيانتيفك | 1157C86 | |
| 5 مل أنبوب Poysterene دائري القاع ، 12 مم × 75 مم | نمط Falcon | 14-959-1A | |
| 50 مل أنبوب مخروطي من مادة البولي بروبلين ، 30 مم × 115 مم | فالكون | 352098 | |
| ريش يمكن التخلص منه رقم 12 | NC9999403 فيشر | ||
| العلمي ، 100 مم × 15 مم | الصقر | ||
| ، 100 مو ؛ م | قطة فيشربراند | # 22363549 |
المراجع
- Tizzano, M., et al. Nasal chemosensory cells use bitter taste signaling to detect irritants and bacterial signals. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (7), 3210-3215 (2010).
- Genovese, F., Tizzano, M.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
