Method Article

الطيفية الامتصاص الذري لقياس برك الزنك داخل خلايا الثدييات

DOI:

10.3791/59519

⸱

May 16th, 2019

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biochemistry and Molecular Pharmacology, University of Massachusetts Medical School, 2Department of Chemistry, Skidmore College, 3Candiac MR Center, Beth Israel Deaconess Medical Center, 4Facultad de Ciencias Químico Biológicas, Universidad Autónoma de Guerrero

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويشيع استخدام خطوط الخلايا الاساسيه أو القائمة المستزرعة لمعالجه المسائل البيولوجية والميكانيكية الاساسيه كنهج اولي قبل استخدام النماذج الحيوانية. يصف هذا البروتوكول كيفيه اعداد مقتطفات الخلايا الكاملة والكسور تحت الخلوية لدراسات الزنك (Zn) والعناصر النزره الأخرى مع الطيفية الامتصاص الذري.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المعادن الانتقالية هي المغذيات الصغرى الاساسيه للكائنات الحية ولكن يمكن ان تكون سامه للخلايا بتركيزات عاليه من خلال التنافس مع المعادن الفسيولوجية في البروتينات وتوليد إجهاد الاكسده. الحالات المرضية التي تؤدي إلى استنزاف المعادن أو تراكم هي العوامل السببية لمختلف الامراض البشرية. وتشمل بعض الامثله فقر الدم ، والتهاب الجلدي المعوي ، وامراض ويلسون والمنكز. ولذلك من المهم ان تكون قادره علي قياس مستويات ونقل المعادن الانتقالية في العينات البيولوجية مع حساسية عاليه ودقه من أجل تسهيل البحوث استكشاف كيفيه مساهمه هذه العناصر في الوظائف الفسيولوجية العادية السميه. الزنك (Zn) ، علي سبيل المثال ، هو عامل مساعد في العديد من البروتينات الثدييات ، ويشارك في الاحداث الإشارات ، وهو رسول الثانوية في الخلايا. في الزائدة ، الزنك السامة ويمكن ان تمنع امتصاص المعادن الأخرى ، في حين ان في العجز ، فانه يمكن ان يؤدي إلى مجموعه متنوعة من الظروف المميتة المحتملة.

الجرافيت فرن الامتصاص الذري الطيفي (GF-العاص) يوفر طريقه حساسة للغاية وفعاله لتحديد الزنك وغيرها من تركيزات المعادن الانتقالية في العينات البيولوجية المختلفة. الانحلال الكهربي عن طريق GF-العاص ثبت قيمه المعادن عن طريق تفتيت كميات صغيره من العينات لتحليل الامتصاص الانتقائي اللاحق باستخدام الطول الموجي لأثاره عنصر الفائدة. في حدود الخطية من قانون البيره لامبرت ، وامتصاص الضوء من قبل المعدن يتناسب مباشره مع تركيز التحاليل. بالمقارنة مع الطرق الأخرى لتحديد محتوي الزنك ، GF-العاص يكتشف كل من الزنك الحرة والمعقدة في البروتينات وربما في جزيئات صغيره داخل الخلايا مع حساسية عاليه في وحدات التخزين عينه صغيره. وعلاوة علي ذلك ، فان GF-العاص هو أيضا أكثر سهوله في الوصول اليه من قياس الطيف الكتلي المقترن بشكل محفز أو الاشعه السينية المستندة إلى synchrotron. في هذا الأسلوب ، يتم وصف اعداد عينه منتظمة من مختلف خطوط الخلايا المستزرعة للتحليلات في GF-العاص. تمت مقارنه الاختلافات في هذا العنصر النزره في كل من الخلايا الكاملة والكسور تحت الخلوية من تكاثر والخلايا المتمايزة كدليل علي المبدا.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتم العثور علي الانتقال والمعادن الثقيلة ، مثل الزنك والنحاس والمنغنيز والحديد ، بشكل طبيعي في البيئة في كل من المواد الغذائية والملوثات. وتتطلب جميع الكائنات الحية كميات مختلفه من هذه المغذيات الصغرى ؛ ومع ذلك ، فان التعرض للمستويات العالية يضر بالكائنات الحية. الحصول علي المعادن هو أساسا من خلال النظام الغذائي ، ولكن يمكن أيضا استنشاق المعادن أو امتصاصها من خلال الجلد1،2،3،4،5. ومن المهم ملاحظه ان وجود الفلزات في جزيئات الغلاف الجوي أخذ في الازدياد وارتبط إلى حد كبير بالمخاطر الصحية. وبسبب الانشطه البشرية....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1-ثقافة خلايا الثدييات

  1. اعتبارات عامه
    1. اتبع تقنيات العقيم لثقافة خلايا الثدييات التي تم مراجعتها سابقا38.
    2. الحفاظ علي جميع خطوط الخلية في مرطب 5 ٪ CO2 حاضنه في 37 درجه مئوية. تختلف شروط ثقافة الخلية لكل نوع من أنواع الخلايا. من المهم الحفاظ علي الظروف الثقافية المناسبة لكل خط الخلية المستخدمة ، والاختلافات من هذه الإجراءات سوف تؤدي إلى الظواهر الشاذة وفشل ثقافة الخلية.
    3. تاكد من التعارف مع خط الخلية من الفائدة ، واتبع البروتوكولات المنصوص عليها لكل نوع الخلية المحددة لتجارب معينه (انظر بعض الامثله أدناه).
  2. الإجراءات العامة للترطنه ومرور الخلايا الملتصق....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

اختبرنا قدره GF-العاص للكشف عن مستويات دقيقه من الزنك في خلايا الثدييات (الشكل 1). وهكذا ، فاننا مثقف الاساسيه التي تستمد من خلايا الأقمار الصناعية الماوس ، وخطوط الخلايا القائمة N2A (الورم الارومي العصبي المشتقة) ، 3T3 L1 (الخلايا الشحمية) ، MCF10A (ظهاره الثدي) ، وخلايا MDCK (الكلبة ظهاره الكلي). أولا ، عزلنا الخلية الكاملة ، السيتووليك ، والكسور النووية لجميع أنواع الخلايا هذه وقيموا نقاء الكسور بواسطة لطخه الغربية (الشكل 2). .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

القياس الطيفي لامتصاص الذرية هو طريقه حساسة للغاية لتحديد كميه الزنك في العينات البيولوجية الصغيرة الحجم/الكتلة. الأمثل الموصوفة من قياس الزنك يجعل تطبيق هذه الطريقة بسيطه ويضمن الظروف التحليلية المثالية. هنا ، باستخدام GF-العاص ، حددنا تركيز الزنك في خلايا كامله ، وفي الكسور الخلوية والنووية ، من خطوط الخلايا المختلفة. وتبين النتائج ان هذه التقنية تجعل مماثله لتلك التي حصلت عليها المسبارات الفلورية وبرنامج المقارنات الكترونيه-MS. علي سبيل المثال ، أظهرت عده تحقيقات فلورية مستويات الزنك الميتوكوندريا العطوب في نطاق 0.1 إ.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وليس لدي المؤلفين ما يفصحون عنه.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وكان هذا العمل مدعوما بجائزه علماء التنوع في الكلية من كليه الطب بجامعه ماساتشوستس إلى T.P.. N.N.. ويدعم من قبل SEP-CONACYT ، منحه 279879. وتدعم المؤسسة الوطنية للعلوم منحه DBI 0959476. ويعرب أصحاب البلاغ عن امتنانهم للدكتور داريل ا. بوسكو لتزويده بخط الخلية N2A ولدانييل تسوسسو لدعمها التقني.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
3-isobutyl-1-methylxanthineSigma AldrichI5879
حمض الخليكSigma Aldrich1005706
الأجسام المضادة Brg1 (G7)سانتا كروز للتقنيات الحيويةsc-17796
الأجسام المضادة للتوبولين المضادة (BT7R)Thermo ScientificMA5-16308
برادفوردبيوراد5000205
ديكساميثازونسيجما ألدريتشD4902
النسر المعدلة من دولبيكو (DMEM)ThermoFischer-Gibco11965092
Dulbecco's Modified Eagle's Media / Nutrient Mix (DMEM / F12)ThermoFischer-Gibco11320033
Dulbecco's Fossil Buffered Salt (DPBS)ThermoFischer-Gibco14190144
عامل النمو البشراني (EGF)سيجما ألدريتشE9644
مصل الأبقار الجنينية (FBS)ThermoFischer-Gibco16000044
النمو الليفي الأساسي (FGF) (AA 10-155)ThermoFischer-GibcoPHG0024
مصل الحصانThermoFischer-Gibco16050122
هيدروكورتيزونسيجما ألدريتشH0888
بيروكسيد الهيدروجين (H2O2)سيجما ألدريتش95321
الأنسولينسيجما ألدريتش91077C
الأنسولين - ترانسفيرين - السيلينيوم - أثيرموفيشر51300044
حمض النيتريك (HNO3)سيجما ألدريتش438073
نونيديت P-40 (NP-40)Thermo Scientific85125
OptiMEM (وسائط مصل مخفضة)ThermoFischer-Gibco31985070
البنسلين الستربتومايسينThermoFischer-Gibco15140148
PureCol (الكولاجين) AdvancedBioMatrix5005
Retionic AcidSigma AldrichPHR1187
TroglitazoneSigma Aldrich648469-M
Trypsin-EDTA (0.25٪) ، أحمرالفينولThermoFischer-Gibco25200056
الزنك (Zn) معيار أحادي العنصر النقي ، 1,000 وميكرو ؛ جم / مل ، 2٪ HNO3Perkin ElmerN9300168
<خطوط الخلايا الراسخة القوية > الراسخة< / قوية>
3T3-L1مجموعة ثقافة النوع الأمريكيCL-173
MCDKثقافة النوع الأمريكيCCL-34
MCF10Aثقافة النوع الأمريكيCRL-10317
N2Aأمريكي نوع مجموعة الثقافةCCL-131
Equipment< / strong>
الطيف الضوئي للامتصاص الذريPerkinElmerAanalyst 800
BioruptorDiagnodeUCD-200
وسائط عامل مجموعة مجموعة مقياس

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Sharma, B., Singh, S., Siddiqi, N. J. Biomedical implications of heavy metals induced imbalances in redox systems. Biomed Research International. 640754, (2014).
  2. Jaishankar, M., Tseten, T., Anbalagan, N., Mathew, B. B., Beeregowda, K. N. Toxicity, ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Atomic Absorption SpectroscopyZinc AnalysisIntracellular ZincCell FractionationSubcellular FractionsWestern Blot ValidationNitric Acid DigestionGraphite FurnaceTrace Metal DetectionCell Culture Preparation

Related Articles