تصور البروتين كيناز نشاط في الفئران يتصرف الرأس ثابتة باستخدام في فيفو اثنين من الفوتون الفلورة التصوير مدى الحياة المجهرية

التشكيل العصبي، والمعروف أيضا باسم انتقال متشابك بطيء، يفرض سيطرة قوية على وظيفة الدماغ خلال الحالات السلوكية المختلفة، مثل الإجهاد، والإثارة، والاهتمام، والحركة^{1،2،3، 4.}على الرغم من أهميتها، ودراسة متى وأين تجري الأحداث neuromodulatory لا تزال في مهدها. Neuromodulators, بما في ذلك أستيل, الدوبامين, نورادرينالين, السيروتونين, والعديد من الببتيدات العصبية, تنشيط مستقبلات G البروتين المقترنة (GPCRs), التي بدورها تؤدي داخل الخلايا مسارات رسول الثاني مع نافذة واسعة من الجداول الزمنية تتراوح من ثانية إلى ساعات. في حين أن كل neuromodulator مشغلات مجموعة متميزة من الأحداث إشارة، وcAMP / البروتين كيناز A (PKA) المسار هو مسار المصب المشتركة لكثير من neuromodulators^1،5. مسار CAMP / PKA ينظم الإثارة العصبية، انتقال متشابك،واللدونة 6،^7،8،9،وبالتالي، الإيقاعات ديناميات شبكة الخلايا العصبية. لأن الخلايا العصبية المختلفة أو أنواع الخلايا العصبية التعبير عن أنواع مختلفة أو مستويات مستقبلات neuromodulator¹⁰، قد تكون الآثار داخل الخلايا من نفس neuromodulator خارج الخلية غير متجانسة عبر الخلايا العصبية المختلفة ، وبالتالي ، يجب أن يكون درس مع القرار الخلوية. حتى الآن, لا يزال من الصعب رصد الأحداث neuromodulatory في الخلايا العصبية الفردية في الجسم الحي أثناء السلوك.

لدراسة الديناميات الصدغية للتشكيل العصبي، يلزم إجراء تسجيل مناسب. يتم استخدام غسيل الكلى الدقيق والقياس الفولتامتري الدوري يُفحص بسرعة لدراسة إطلاق النيونوموتورات، ولكنها تفتقر إلى الدقة المكانية لرصد الأحداث الخلوية^11،12. مماثلة لديناميات الكالسيوم المستخدمة كوكيل للنشاط الكهربائي العصبي في التصوير السكاني¹³، يمكن استخدام التصوير PKA لقراءة الأحداث neuromodulatory عبر السكان الخلايا في القرار الخلوي. يصف هذا البروتوكول استخدام مراسل نشاط A-kinase محسن (AKAR) لرصد أنشطة PKA في الجسم الحي أثناء السلوك الحيواني. الطريقة الموصوفة هنا يسمح للتصوير المتزامن للسكان الخلايا العصبية في القرار دون الخلوي مع قرار زمني الذي يتتبع الأحداث العصبية الفسيولوجية.

وتتكون AKARs من متبرع وبروتينات فلورية مقبولة مرتبطة ببتيد الركيزة الفسفور PKA والمجال المرتبط بشوكة الرأس (FHA) الذي يربط serine الفوسفوري أو ثروينين الركيزة^14،15. عند تفعيل مسار PKA، يتم الفوسفورية الببتيد الركيزة من AKAR. ونتيجة لذلك، يرتبط مجال FHA بببتيد الركيزة الفوسفوري، وبالتالي جلب الفلوروفورين اثنين على مقربة من بعضها البعض، ويشار إليها باسم حالة AKAR المغلقة. ينتج ال ينفضّ دولة من [سكر] [فوسفوريلت] في يزاد [فرستر] رنة طاقة إنتقال ([فريت]) بين المانحة ومقبولة [فلوروفورس]. وبما أن نسبة الأكور الفوسفورية ترتبط بمستوى نشاط PKA^16،يمكن استخدام كمية قوات الاتحاد الثوري في عينة بيولوجية لتحديد مستوى نشاط PKA^{16،17،18، 19،20}.

تم تصميم الإصدارات المبكرة من AKARs في المقام الأول للتصوير قياس اللونين^14. عند التصوير أعمق في أنسجة الدماغ، وطريقة قياس النسب يعاني من تشويه الإشارة بسبب تشتت الضوء تعتمد على الطول الموجي^17،18،21. كما هو موضح أدناه، الفلورة التصوير المجهري مدى الحياة (FLIM) يزيل هذه المشكلة لأن FLIM يقيس فقط الفوتونات المنبعثة من الفلوروفور المانح^18،21. ونتيجة لذلك، لا يتأثر التحديد الكمي للFLIM من FRET بعمق الأنسجة¹⁷. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدام متغير "داكن" (أي انخفاض غلة الكم [QY]) من الفلوروفور المقبول. هذا يحرر قناة ملونة لتسهيل القياس المتعدد من خصائص الخلايا العصبية المتعامدة عن طريق التصوير المتزامن للمستشعر الثاني أو علامة مورفولوجية^17،19،20.

التصوير FLIM يحدد الوقت الذي يقضيه الفلوروفور في حالة متحمس، أي عمر الفلورة¹⁸. عودة فلوروفور إلى حالة الأرض، وبالتالي نهاية الدولة متحمس، وغالبا ما تصاحب انبعاث فوتون. على الرغم من أن انبعاث الفوتون لجزيء متحمس الفردية هو الاستوكاستك، في السكان متوسط عمر الفلورة هو سمة من سمات ذلك الفلوروفور خاصة. عندما يكون السكان النقيمن الفلوروفور متحمسون في وقت واحد، فإن الفلورة الناتجة سوف تتبع تسوس أسي واحد. ثابت الوقت من هذا الاضمحلال الأسي يتوافق مع متوسط عمر الفلورة، والتي تتراوح عادة من واحد إلى أربعة نانو ثانية للبروتينات الفلورية. كما يمكن أن تحدث عودة الفلوروفور المتحمس للمانحين إلى الحالة الأرضية من قبل الاتحاد من أجل إعادة التأثر. في وجود فريت، يتم تقليل عمر الفلوروفور المانح. وAAKARs غير الفوسفورية تظهر عمر الفلورة المانحة أطول نسبيا. وعند الفسفور من قبل PKA، يعرض جهاز الاستشعار عمراً أقصر لأن المتبرع والمانح الفلوروفوريس يقتربان من بعضهما البعض وتزداد الـ FRET. وبالتالي فإن التحديد الكمي لعمر الفلورة في عدد السكان من الـ AKARs يمثل مستوى نشاط مرافق الحماية من الكلمنها.

لم يتم استخدام الإصدارات المبكرة من AKARs بنجاح في التصوير في الجسم الحي بدقة خلية واحدة. ويرجع ذلك أساسا إلى انخفاض سعة إشارة أجهزة الاستشعار عكار إلى التنشيط الفسيولوجي¹⁷. في الآونة الأخيرة، من خلال المقارنة المنهجية أجهزة الاستشعار AKAR المتاحة لاثنين من الفوتون الفلورة التصوير المجهري مدى الحياة (2PFLIM)، تم العثور على جهاز استشعار يسمى FLIM-AKAR لتفوق أجهزة الاستشعار البديلة. وعلاوة على ذلك، تم تطوير سلسلة من المتغيرات FLIM-AKAR تسمى AKARs المستهدفة (tAKARs) لتصور نشاط PKA في مواقع محددة دون الخلوية: microtubules (tAKARα)، سيتوسول (tAKARβ)، أكتين (tAKARδ)، الأكتين خيوطي (tAKARי)، غشاء (tAKARγ)، والكثافة الرصاقة (tAKARי). ومن بين التاكارس، زاد التاكارا من سعة الإشارة التي أثارها إفراز بمقدار 2.7 أضعاف. وهذا يتفق مع المعرفة بأن غالبية PKA في الخلايا العصبية راسية على microtubules في حالة يستريح^22،23. وكان tAKARα أفضل أداء بين AKARs القائمة ل2pFLIM. وعلاوة على ذلك، اكتشف tAKARα نشاط PKA ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية التي أثارها المغيرات العصبية متعددة، والتعبير عن tAKARα لم يغير وظائف الخلايا العصبية¹⁷.

في الآونة الأخيرة، تم استخدام tAKARα بنجاح لتصور أنشطة PKA في الفئران يتصرف الرأس ثابتة¹⁷. وقد تبين أن الحركة القسرية أدت إلى نشاط PKA في سوما من الخلايا العصبية الطبقة السطحية (الطبقة 1 إلى 3، تصل إلى عمق ~ 300 ميكرومتر من بيا) في المحرك، برميل، والقشرية البصرية. وكان نشاط PKA التي تسببها الحركة تعتمد جزئيا على الإشارة عن طريق مستقبلات β-adrenergic ومستقبلات الدوبامين D1, ولكن لم يتأثر بخصم مستقبلات الدوبامين D2. يوضح هذا العمل قدرة tAKARs على تتبع أحداث التشكيل العصبي في الجسم الحي باستخدام 2pFLIM.

في البروتوكول الحالي، يتم وصف الطريقة الكاملة لتصوير نشاط PKA في الفئران مستيقظا ثابتالرأس أثناء نموذج الحركة القسري في ست خطوات. أولا، إضافة قدرات 2pFLIM إلى المجهر التقليدية اثنينفوتون (الشكل 1). ثانيا، بناء جهاز المشيالآلية (الشكل 2). ثالثا، التعبير عن جهاز استشعار tAKARα في قشرة الماوس عن طريق في الكهربائي الرحم (IUE) من بلازميدات الحمض النووي، أو حقن مجسمة من الفيروس المرتبط بأدينو (AAV). وقد نشرت سابقا بروتوكولات ممتازة للعمليات الجراحية لIUE^24،25 وحقن stereotaxic من الجسيمات الفيروسية^26. ويرد أدناه وصف للبارامترات الرئيسية التي استخدمناها. وإلى الأمام، تركيب نافذة الجمجمة. وقد نشرت بروتوكولات ممتازة سابقا لجراحة نافذة الجمجمة^27,28. يتم وصف العديد من الخطوات التي تم تعديلها من البروتوكولات القياسية. الخامس، أداء في الجسم الحي 2pFLIM. سادساً، تحليلات صور 2pFLIM (الشكل3 والشكل 4). وينبغي أن يكون هذا النهج قابلاً للتطبيق بسهولة على العديد من النماذج السلوكية الأخرى الثابتة الرأس ومناطق الدماغ.

تمت الموافقة على جميع الطرق الموضحة هنا من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها (IACUC) من جامعة أوريغون للصحة والعلوم.

1. 2pFLIM المجهر الإعداد 2.

1. قم بتثبيت وحدة عد توقيت الفوتون (PTCM، جدولالمواد) والاتصال بالكمبيوتر (الشكل 1) وفقا لدليل الشركة المصنعة.
   ملاحظة: وPTCM هو عادة لوحة الكمبيوتر التي تتلقى إدخال "المزامنة" لتوقيت نبض الليزر ومدخلات فوتون من أنبوب المضاعف الضوئي (PMT). كما يتلقى توقيت الساعة للبيكسلات والخطوط والإطارات، من برنامج التحكم في التصوير باثنين من الفوتونات. يستخدم PTCM إشارات الساعة لفصل الفوتونات الفردية إلى بيكسلات وإطارات مختلفة.
2. أضف صمام ضوئي مع عرض نطاق ترددي 200 ميجاهرتز لقياس توقيت الليزر. وضع غطاء زجاجي قياسي في مسار الضوء ليعكس جزء صغير من ضوء الليزر في الصمام الضوئي وضععمودي على مسار الضوء (الشكل 1). قم بتوصيل إخراج الصمام الضوئي بإدخال "المزامنة" لـ PTCM.
   ملاحظة: العديد من الليزر الحديثة أيضا إخراج توقيت الليزر. لهذه الليزر، الصمام الضوئي ليس ضروريا، ويمكن للمرء أن يربط مباشرة إخراج توقيت الليزر إلى إدخال المزامنة من PTCM.
3. تبادل PMT، في حالة tAKARα، وقناة خضراء PMT، مع انخفاض مستوى الضجيج، سريع GaAsP PMT (الشكل1). قم بتوصيل إخراج PMT بإدخال إشارة PTCM.
   1. أضف مقسم إشارة اختياري(الشكل 1) إذا كان الحصول المتزامن على الكثافة من خلال قناة التصوير التقليدية ذات الفوتونين مرغوبًا فيه. قم بتوصيل إخراج PMT بمقسم الإشارة وقم بتوصيل خرج الخائن بـ PTCM ووحدة التصوير التقليدية ذات الفوتونين.
      ملاحظة: تعطي PMTs GaAsP إشارات فوتون واحدة أسرع من PMTs ثنائي ة الكالي التقليدية وتسمح بتحديد أكثر دقة لتوقيت الفوتون. يمكن تبريد نماذج معينة من PMTs GaAsP إلى 10-35 درجة مئوية تحت درجة الحرارة المحيطة، مما يسمح بقمع العد اتّصال الظلام إلى مستوى أقل من بضع مئات في الثانية (عادة ≤ 200 التهم/ثانية). هذا المستوى المنخفض من الضوضاء مهم للقياس الدقيق لعمر الفلورة لأن عدد الفوتون الضوضاء لا يمكن تمييزه بسهولة أو طرحه من منحنى عمر الفلورة.
4. إضافة مرشح انبعاثات الفلورة تمرير النطاق الذي يقلل من التلوث الطيفي، إن وجد، من الفلوروفور المقبول. على سبيل المثال، بالنسبة لtAKARα، يتم استخدام 500 نانومتر ± 20 نانومتر مرشح حاجز للقناة الخضراء للحد من التلوث من sREACh مقبول، وهو الظلام (QY ~ 0.07) بروتين الفلورسنت الأصفر (YFP)^29،30. قم بتوصيل إشارات التوقيت، مثل الساعات لبيكسلات الصور الفردية والخطوط والإطارات، بما يتناسب مع برنامج التحكم والموضحفي دليل المستخدم PTCM. قم بتثبيت برنامج التحكم في البيانات والاكتساب المناسب.
   ملاحظة: بعض الشركات المصنعة PTCM (جدولالمواد)توفير برامجها للتصوير 2pFLIM. هنا، يتم استخدام البرمجيات المخصصة تسمى FLIMimage، والتي تم تطويرها من قبل مختبر ياسودا (ماكس بلانك فلوريدا، عن طريق الاتصالات الشخصية). يعمل هذا البرنامج كوظيفة مستخدم إضافية لبعض برامج اكتساب الفوتون (جدولالمواد). فإنه يتحكم ويتصل مع PTCM في الوقت المناسب أثناء التصوير اثنين من الفوتون للحصول على صور 2pFLIM.

2. بناء جهاز المشي الآلية

ملاحظة: يظهر تصميم جهاز المشي الآلي المخصص في الشكل2.

1. قطع الأسطوانة رغوة (Ø = 200 مم) إلى 150 ملم في الطول مع منشارا غرامة. بدلا من ذلك، الغراء نصفين من الكرة رغوة معا ووضع الشريط على التماس. اختياريا، الغراء حصيرة المطاط مع الملف الشخصي على الأسطوانة لزيادة الجر على الأسطوانة.
2. حفر حفرة قطرها 1/4 بوصة من خلال مركز الأسطوانة في الجانب المسطح من الأسطوانة أو حفر حفرة قطرها 1/4 بوصة من خلال منتصف كل نصف الكرة إذا تم استخدام الكرة رغوة.
3. قم بتثبيت محور فولاذي قطره بوصة من خلال الثقب. الغراء الأسطوانة رغوة / الكرة إلى المحور باستخدام رغوة متوافقة الغراء. اختياريا، تعديل اثنين من وصلات رمح مرنة (1/4 بوصة القطر الداخلي) لتعزيز اقتران المحور إلى الأسطوانة رغوة / الكرة.
   ملاحظة: يرجى ملاحظة أن العديد من الغراء المشتركة قد تذوب رغوة.
   1. لكل اقتران رمح، ضع اقتران رمح على جانبها المسطح وفي وسط لوحة معدنية مستطيل (0.7 مم × 15 مم × 76 مم). لحام لوحة لاقتران رمح. حفر حفرة 1/4 بوصة في وسط لوحة للسماح لتركيب اقتران رمح المعدلة على المحور واثنين من الثقوب المسمار في اللوحة المعدنية الجانبية من المركز.
   2. تثبيت اقتران رمح على المحور ضد الأسطوانة رغوة / الكرة. إذا كنت تستخدم هذا الأخير، وثني قليلا لوحة لتناسب انحناء الكرة. وضع مسامير في الثقوب الجانبية لإصلاح الأسطوانة / الكرة على المحور.
4. حفر والاستفادة من 3/8-32 الموضوع في وسط لوحة قفص وتثبيت التشفير الدوارة. حفر ثقب المسمار في قاعدة قوس المحرك الزاوية اليمنى للسماح مرفق المحرك على حامل آخر. إرفاق كل من التشفير الدوارة والمحرك إلى نهاية المحور باستخدام اقتران رمح مرنة.
5. تثبيت المطحنة تجميعها على لوحة الخبز الألومنيوم باستخداموظائف للمحرك والتشفير الدوارة (الشكل 2). قم بتوصيل مدخلات المحرك بوحدة تحكم السرعة، وإخراج التشفير الدوار إلى إدخال تناظري للوحة الحصول على بيانات الكمبيوتر (DAQ).
   ملاحظة: يتم ترميز سرعة الزاوي دوران بواسطة التشفير الدوارة كما الجهد ويتم رقمنة باستخدام برامج مخصصة تسمى AnimalTracker مكتوبة في MATLAB.
6. قم بتثبيت الحامل المتوافق مع اللوحة الأمامية على قوس الزاوية اليمنى. تثبيت وظيفة صلبة على لوحة الخبز أمام المطحنة وتثبيت حامل لوحة الرأس تجميعها معقوس الزاوية اليمنى على آخر (الشكل 2). تأكد من محاذاة قضبان حامل اللوحة مع المحور بحيث يمكن للماوس اعتماد موقف المشي كافية ومريحة على المطحنة (الشكل2C).

3. التعبير عن جهاز استشعار tAKARα في قشرة الماوس

1. في الكهرباء الرحمية
   1. إعداد محلول الحمض النووي لـ IUE بإضافة تركيز نهائي بنسبة 0.2% من الصبغة الخضراء السريعة (للتصور أثناء الحقن) إلى الحمض النووي البلازميد (3−4 ميكروغرام/ميكرولتر؛ وبنيات المستشعر التي تحتوي على محرك كاج promotor، وتسلسل الاستشعار، وفيروس التهاب الكبد woodchuck عنصر الاستجابة ما بعد النسخ [WPRE] محسن الترجمة) حل / مخفف ة في الماء أو Tris-EDTA.
   2. إعداد فأرة حامل موقوتة (على سبيل المثال، C57BL/6) لIUE في E16²⁴. التخدير الماوس مع isoflurane (4٪ للحث و 1.5٪ للصيانة، على 95٪O2 مع 5٪ CO 2) وتطبيق الحقن تحت الجلد من المسكنات المحيطة بالجراحة التي تحتوي على 5 ملغ / كغ ميلوكسيكام و 4 ملغ / كغ بوباكاين. قطع فتح تجويف البطن مع مشرط وزوج من مقص وفضح بعناية قرون الرحم.
   3. حقن 1 ميكرولتر من محلول الحمض النووي لكل جنين في البطين الجانبي لنصف الكرة الأرضية، كما سبق وصفه²⁴.
   4. أداء IUE^{العادية 24} للخلايا العصبية القشرية عن طريق وضع القدم نهاية القطب الإيجابي في القشرة واستخدام خمسة 100 مللي ثانية البقول مربع (38 V) في 1 هرتز مع الكهربائي.
      ملاحظة: يمكن استهداف مناطق القشرية المختلفة للكهرباء عن طريق تغيير موضع القدم نهاية القطب بالنسبة إلى البطين الجانبي.
2. حقن مجسم
   1. إعداد الماوس في يوم ما بعد الولادة 30 لجراحة مجسمة²⁶. التخدير الماوس كما هو موضح في الخطوة 3.1.2.، وتطبيق الحقن تحت الجلد من المسكنات المحيطة بالجراحة التي تحتوي على 5 ملغ /كغ كاربروفين.
   2. تمييع AAV serotype 2/1 (AAV2/1) معبراً عن hSyn-tAKARα-WPRE إلى titer محدد تجريبياً (~ 1 × 10⁹−1 × 10¹⁰ جينوم/ميكرولتر) في المحاقن المصفاة (0.2 ميكرومتر غشاء خلات السليلوز) المملح ة المخزنة بالفوسفات.
   3. حفر حفرة قطرها حوالي 500 ميكرومتر باستخدام حفر المحمولة تحت مجهر مجسم في الإحداثيات التالية لقشرة المحرك: 0.5 مم الأمامي إلى بريغا، 1.2 مم الجانبية إلى خط الوسط.
   4. قم بتركيب محقن (على سبيل المثال، متلاعب هيدروليكي زيتي، مع حامل ماصة/مغطس زجاجي مصنوع حسب الطلب) إلى متلاعب آلي. ضع إبرة الحقن بزاوية 15 درجة بالنسبة إلى الطائرة بريجما لامدا. برنامج حركة قطري عبر محاور x و z ما يعادل تقدم 700 ميكرومتر و 200 ميكرومتر على طول المحاور الأمامية الخلفية والظهرية البطنية، على التوالي.
      ملاحظة: لتجنب تلف الأنسجة مباشرة فوق حقل التصوير المقصود، يتم حقن جزيئات AAV في زاوية بالنسبة إلى الطائرة بريجما لامدا.
   5. وضع غيض من إبرة الحقن في بيا في وسط ثقب الحفر وتنفيذ ببطء الحركة قطري (~ 25 درجة مئوية / ثانية) المذكورة أعلاه. هذا الإجراء سوف يضع مركز الحقن في 1.2 مم الأمامي إلى بريما، 1.2 مم الجانبية إلى خط الوسط، 0.2 ملم تحت بيا.
   6. حقن 20 مل من الجسيمات الفيروسية المخففة (~ 10 نمل / دقيقة). انتظر 10 دقائق على الأقل وتراجع ببطء إبرة الحقن (~ 12.5 درجة مئوية / ثانية).
   7. الانتهاء من إجراء حقن stereotaxic والغراء / خياطة الجلد^26.

4. تركيب نافذة الجمجمة

1. إجراء وضع نافذة الجمجمة على الفئران التي تعبر عن tAKARα عن طريق IUE (القسم 3.1) أو حقن الجسيمات الفيروسية بستيريوتاكسي (القسم 3.2)، بين أيام ما بعد الولادة 30 و60. للماوس المصاب بالجسيمات الفيروسية، قم بتنفيذ نافذة الجمجمة بعد أسبوعين على الأقل من حقن الفيروس. تثبيت نافذة الجمجمة كما هو موضح سابقا^27،28، مع التفاصيل التالية. التخدير الماوس كما هو موضح في الخطوة 3.1.2.، وتطبيق الحقن تحت الجلد من المسكنات المحيطة بالجراحة 0.075 ملغ / كغ Buprenex والعوامل المضادة للالتهابات Dexamethasone في 4 ملغ / كغ.
2. إزالة periosteum وسحب عضلة الرقبة. الغراء حافة الجلد إلى الجمجمة مع لاصق الأنسجة لتجنب التعرض للعضلات الرقبة بعد الجراحة.
3. تجفيف وإزالة أي periosteum من الجمجمة عن طريق كشط بلطف باستخدام مشرط. ضع لوحة التصوير (قطرها الداخلي 8 مم) لإحاطة حقل التصوير المقصود. الغراء لوحة الرأس إلى الجمجمة باستخدام الغراء على أساس سيانوكريلات، تليها الاسمنت الاكريليك الأسنان. للالتصاق الأمثل، تأكد من أن اللوحة تقع على الجمجمة المكشوفة والمجففة. ويمكن استخدام مسرع الغراء لتسريع تصلب.
4. رسم دائرة قطرها 5 مم فوق حقل التصوير المقصود (الإحداثيات كما هو محدد في الخطوة 3-2-3) باستخدام مثقاب الأسنان وفضح الأم دورا.
5. تطبيق طبقة رقيقة من البوليمر شفافة، وتسمى أيضا دورا الاصطناعية، على سطح دورا لتغطية نافذة الجمجمة بأكملها. سوف البوليمر حماية وتثبيت الأم دورا. ضع غطاء دائري معقم (قطره 5 مم) على ماتر دورا. تأمين غطاء مع الغراء cyanoacrylate تطبيقها حول حواف النافذة تليها الاسمنت الاكريليك الأسنان.

5. في فيفو اثنين من الفوتون الفلورة التصوير مدى الحياة المجهرية

1. بدء التصوير 2pFLIM في أو بعد 2 أسابيع بعد تركيب نافذة الجمجمة (القسم 4). تقليل التداخل التجريبي بسبب الإجهاد من خلال التعامل المتكرر والوخز من الماوس قبل بدء دراسة التصوير لسكن الماوس.
2. تعيين اثنين من الفوتون الإثارة الليزر الطول الموجي إلى 960 نانومتر باستخدام البرنامج الذي يتحكم في الليزر اثنين من الفوتون.
3. تخدير الماوس باستخدام 4٪ isoflurane. تأكيد التخدير السليم عن طريق قرصة الذيل ومراقبة معدلات التنفس. وهذا يعني، لا ينبغي أن يكون هناك استجابة لقرصة الذيل وينبغي خفض معدل التنفس إلى ~ 1 التنفس في الثانية الواحدة. لتقليل الوقت الإجرائي غير الضروري ولأن التخدير يستمر لمدة دقيقتين إلى ثلاث دقائق فقط، لا يتم استخدام زيوت تشحيم العين.
4. نقل الماوس التخدير إلى المطحنة الآلية(الشكل 2C)وجبل لوحة رأس الماوس إلى حامل لوحة الرأس من إعداد المطحنة (انظر الشكل 2 للحصول على التفاصيل). تنظيف سطح غطاء النافذة القحفية على الماوس مع الإيثانول 70٪.
5. ضع المطحنة الآلية مع الماوس المثبت تحت هدف 2pFLIM. تطبيق قطرة من الماء المقطر بين غطاء النافذة القحفية والهدف.
6. دع الفأر المُركب يستيقظ من التخدير ويصبح متأقلماً مع بيئة المطحنة والمجهر لمدة 10 دقائق على الأقل.
7. انتقل إلى موقع الحقن تحت الإضاءة الظهارية. توثيق الخصائص fiducial (أي الأوعية الدموية) تحت brightfield للمساعدة في تصوير نفس المنطقة ذات الأهمية (ROI) خلال جلسات التصوير اللاحقة.
8. القضاء على أي ضوء واردة غير الضوء المنبعث من أنسجة الدماغ. قم بإيقاف مصدر ضوء الإضاءة الظّهة للضوء وأغلق الضميمة الخاصة بجهاز الحفر 2pFLIM. تنشيط PMT 2pFLIM عن طريق التبديل على التحكم في الجهد قيادة الأجهزة.
9. الحصول على صورة z-كومة 2pFLIM باستخدام برنامج اكتساب 2pFLIM FLIMimage مع الإعدادات الموصى بها التالية لتصوير tAKARα إيجابية سوماتا في الفئران مستيقظا. تعيين الإطار في المتوسط إلى 3 إطارات، وسرعة المسح الضوئي إلى 2 مللي ثانية / خط، وحجم الصورة إلى 128 × 128 بكسل، ومجال الرؤية إلى 90-100 ميكرومتر. ضبط إعدادات التصوير استنادًا إلى إعداد وتكوين الأجهزة.
10. فحص الصورة المكتسبة في FLIMview (تم تطوير برامج مخصصة داخلية؛ انظر القسم 6). اضبط إعدادات التصوير بعد الخطوة 5.9 لتحسين عدد الفوتونات وتقليل ابيضاض الصور.
    ملاحظة: عدد الفوتونات المدمجة القابلة للتطبيق في عائد الاستثمار للتصوير مدى الحياة للسوما إيجابية tAKARα في الجسم الحي هو ~ 1,000-10,000 فوتون اتّبعاً على سعة الإشارة الناتجة عن حافز معين (انظر المناقشة).
    1. عند الحاجة، استخدم مجال رؤية منخفض، وانخفاض سرعة المسح الضوئي، وزيادة قوة الليزر، وزيادة عدد الإطارات التي سيتم متوسطها لزيادة عدد الفوتونات المتكاملة وتقليل خطأ التقدير مدى الحياة. وفي الوقت نفسه، تأكد من استخدام الحد الأدنى من طاقة الليزر الأساسية، ومتوسط الإطار، وسرعة المسح الضوئي لتقليل ابيضاض الصور.
11. صورة في فاصل زمني منتظم (على سبيل المثال، كل 30-60 s) عن طريق تكرار الحصول على مكدس z باستخدام الإعدادات المحددة في الخطوة 5.10. احصل على صور خط الأساس 2pFLIM لمدة 15 دقيقة على الأقل بسرعة المطحنة الصفرية.
12. اضبط سرعة دوران المطحنة إلى 15 سم/ث لمدة 15 دقيقة مع الحصول على صور 2pFLIM. مواصلة التصوير ل ≥ 20 دقيقة بعد إيقاف دوران المطحنة، لتقييم مدة نشاط PKA بعد وقف الحركة القسرية.

6. تحليل صور 2pFLIM

1. افتح الصور التي تم الحصول عليها في FLIMview وقمت بتعيين المعلمات التالية في FLIMview.
   ملاحظة: يتم وصف تفاصيل المعلمة في المناقشة.
   1. انقر على حقول الحد الأدنى والحد الأقصى لعد الفوتون (SPC) في FLIMview. أدخل قيمة النطاق الأدنى والحدالي المناسب ة SPC، التي تتراوح عادة بين 1.2-2 و10-12 ns، على التوالي.
   2. انقر على الحقل قيمة t₀ في FLIMview وأدخل قيمة t₀ (عادةً ~ 2 ns). انقر على حقل قيمة الحد الأدنى لقيمة الحد الأدنى للإضاءة مدى الحياة في FLIMview وأدخل قيمة العتبة المطلوبة إلى 5−30 فوتون.
2. انقر على زر المجموعة الجديدة (N) وتعيين اسم مجموعة تجربة. سيؤدي هذا إلى إنشاء مجموعة تجمع البيانات من كل صورة FLIM المضافة.
3. انقر على زر عائد الاستثمار في وحدة التحكم في عائد الاستثمار من FLIMview ورسم عائد الاستثمار حول سوما tAKARα إيجابية. تقليل نطاق z-stack، عن طريق تحريك الحد z السفلي والعلوي في أشرطة التمرير التحكم z-كومة في FLIMview، لتقليل تلوث الإشارة الناشئة من الفوتونات الخلفية في أعماق z الأخرى.
4. انقر على زر + لإضافة صورة FLIM إلى المجموعة (الخطوة 6.2). انقر على زر Calc لحساب متوسط العمر (LT، ويسمى أيضًا متوسط وقت انبعاث الفوتون [MPET])، لعائد الاستثمار وخطأ تقدير العمر (δי).
5. افتح الملف التالي في سلسلة التصوير المزمنة 2pFLIM. كرر الخطوة 6.4. تأكد من ضبط موضع عائد الاستثمار ومجموعة z-stack لقياس نفس سوما إيجابية tAKARα مع مرور الوقت، لأنه يمكن أن يكون هناك الانجراف الأنسجة مع مرور الوقت.
6. حدد deltaMPET/MPET₀ في القائمة المنسدلة من الوحدة النمطية "عناصر تحكم المجموعة". انقر على الحقل "الأساس#" وأدخل الفهرس (الفهرسات) (على سبيل المثال، 1 2 3 4 5 للصور الخمس الأولى في المجموعة التي تم إنشاؤها في الخطوة 6.3). سيؤدي ذلك إلى تعريف الصورة (الصور) المستخدمةلحساب عمر الأساس (LT 0).
7. انقر على مؤامرة لإنشاء رسم بياني يحتوي على استجابة FLIM (ΔLT/LT₀₎من tAKARα أثناء التجربة في ROIs المعرفة. تسمح التغييرات التي تمت تسويتها في عمر (ΔLT)لـ ROIs الفردية حسب عمر الأساس المقابل (LT 0) بمقارنة نشاط PKA أثناء الحركة عبر علاقات عامة مختلفة.

تسمح مستشعرات FRET-FLIM بتصور العديد من مسارات الإشارات المختلفة، بما في ذلك مسار CAMP/PKA المتضمن في التشكيل العصبي. يستخدم البروتوكول الحالي مستشعر tAKARα الذي تم تطويره مؤخرًا مع 2pFLIM لتصور أنشطة PKA في الفئران التي تتصرف بالرأس. ويمكن ترقية معظم المجاهر القائمة ذات الفوتونين بقدرات 2pFLIM بإضافة ثلاثة إلى أربعة مكونات، كما هو موضح في الشكل 1 (انظر أيضا ً القسم 1). لتصور FRET في الصور التي تم الحصول عليها 2pFLIM، تم تنفيذ القياس الكمي لمتوسط العمر على قطع الرسم البياني من توقيت الفوتون التي تم جمعها لكل بكسل (الشكل3A،B). تم تصور متوسط العمر باستخدام صورة ذات ألوان زائفة، حيث متوسط العمر العالي (اللون البارد) والمنخفض (اللون الدافئ) متوسط العمر تمثل أنشطة PKA منخفضة وعالية، على التوالي، حيث أن تنشيط PKA يؤدي إلى انخفاض العمر. يجب توخي الحذر لتعيين نطاق SPC بشكل صحيح; وينبغي تعيين هذا النطاق ضمن الفاصل الزمني لنبض الليزر (على سبيل المثال، 12.5 ns من معدل النبض البالغ MHz 80) مع تقليل القطع الأثرية لحافة الأجهزة (انظر أيضاً القسم 6 والنقاش). تم حساب نشاط PKA داخل ROIs عن طريق الجمع بين LT من جميع وحدات البكسل ضمن عائد استثمار معين (الشكل3C,D). في الرأس ثابت ة الفئران مستيقظا الأعمار القاعدية تراوحت بين 1.3 و 1.8 ns (الشكل3E). يسمح تصوير tAKARα في القشرة الحركية في الفئران مستيقظا ثابتالرأس لتحديد كمية في الوقت الحقيقي من نشاطPKA مع القرار الخلوي أثناء الحركة القاعدية والقسري (الشكل 4). يمكن تكرار التجربة على مدى أيام وأشهر. فرض الحركة يؤدي نشاط PKA في مجموعة من الخلايا العصبية داخل طبقات سطحية من القشرة الحركية الماوس17. هذا النشاط PKA يعتمد على التشكيل العصبي عن طريق تفعيل β-adrenergic ومستقبلات D117.

الشكل 1: مخطط نظام 2pFLIM. يمكن تنفيذ 2pFLIM على المجهر التقليدي ذي الفوتون اتّصال بإضافة مكونات الأجهزة الصفراء المميزة: وحدة عد توقيت الفوتون، أنبوب مضاعف ضوئي سريع منخفض الضوضاء (PMT)، وهو صمام ضوئي (مطلوب فقط إذا لم يكن الليزر يحتوي على إشارة الإخراج لتوقيت الليزر)، ومقسم إشارة اختياري. تم تعديل هذا الرقم من Ma et al.17. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2: تصميم جهاز للمشي آلي مصمم خصيصاً. (أ) التخطيطي لتصميم المطحنة من الأمام (أعلى اليسار)، الجانب (أعلى اليمين)، ووجهات النظر العليا (أسفل اليسار). يتم توصيل المحور المطحنة (الكرة رغوة) إلى التشفير الدوارة والمحرك التي شنت بشكل جماعي على اثنين من المشاركات على لوحة الخبز الألومنيوم الصلبة. يتم تثبيت حامل متوافق مع اللوحة على قوس الزاوية اليمنى إلى وظيفة صلبة ووضعها فوق المطحنة. الرسومات التخطيطية ليست للتحجيم. الجبهة (B) والجانب (C) عرض الصور من المطحنة. يظهر تحديد المواقع المناسب للماوس على المطحنة في اللوحة C. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 3: التحديد الكمي لبيانات 2pFLIM. (أ) صورة FLIM مع كل بكسل الزائفة اللون لتمثيل متوسط العمر (LT)، نسبة إلى توقيت الليزر، من جميع الفوتونات في هذا البكسل. (ب) تم رسم أوقات وصول الفوتون ضمن بكسل واحد (مربع أرجواني في اللوحة A)في الرسم البياني (اللوحة اليسرى). تم تعيين حدود التكامل لتحديد نطاق عد الفوتون المفرد (SPC، رمادي). ضمن نطاق SPC، تم تقسيم جزء لا يتجزأ من توقيت الفوتون على العدد الإجمالي للفوتونات ثم طرح هاد0 (1.65 ns، خط متقطع)، مما أدى إلى متوسط العمر (LT، المسافة بين خطوط متقطعة ومتقطعة) من 1.74 ns. التحديد الكمي لمتوسط عمر مجال الرؤية بأكمله (مربع أزرق فاتح في اللوحة A) ينطوي على دمج توقيت الفوتون الذي تم جمعه في جميع وحدات البكسل (اللوحة اليمنى)، مما أدى إلى متوسط عمر 1.7 ns. إظهار Insets نفس البيانات في مقياس شبه السجل. (جيم ودال) تحديد متوسط العمر لكل منطقة اهتمام (ROI). (C) مثال تمثيلي لصورة 2pFLIM. تم رسم اثنين من ROIs حول اثنين من somata في طبقة 2/3 من القشرة الحركية. (D) توزيعات توقيت الفوتون المدمجة عبر جميع وحدات البكسل داخل كل عائد استثمار (اللوحة اليسرى). تم ترميز ROIs الخلية (كما هو موضح في لوحة C) الأحمر، الخلية 1؛ الأزرق، الخلية 2. تسمح عمليات حساب الفوتون العادية بمقارنة توزيعات توقيت الفوتون بين نقطتي التحكم في الألواح (اللوحة اليمنى، متوسط العمر؛ الخلية 1، 1.33 ns؛ الخلية 2، 1.73 ns). إظهار Insets نفس البيانات في مقياس شبه السجل. (E) رسم توزيع متوسط العمر القاعدي من 254 خلية مصوّرة في الطبقات السطحية من القشرة الحركية. خلايا L1 (n = 186 خلية/11 خلية/ 11 الحيوانات، اللوحة اليسرى)، التي تقيم في حدود 100 ميكرومتر تحت بيا، أعرب عن tAKARα بعد حقن مجسمة من AAV2/1-hSyn-tAKARα-WPRE، وL2/3 الخلايا الهرمية (ن = 68 خلية / 4 الحيوانات، لوحة الحق)، ويقيم على الأقل 150 ميكرومتر تحت بيا، عبّر عن [تكر] بعد [إيو] من [كغ-تكر]-[وبر] [دنا] بناء. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 4: tAKARα المسارات القسري الأنشطة التي يسببها الحركة PKA في القشرة الحركية. (أ) كثافة تمثيلية (اللوحة اليسرى) وصور العمر (الألواح الوسطى واليسرى) لثلاث خلايا L1 في القشرة الحركية. تم ترميز ROIs الخلية الملونة: البرتقالي، الخلية 1. الأزرق، الخلية 2؛ الأصفر، الخلية 3. (B) توزيعات توقيت الفوتون المقاسة في الخلية 1 (اللوحة العليا) أثناء الحالة القاعدية (تتبع البرتقال، كما تقاس في اللوحة الوسطى Α)والحركة القسرية (loco.، تتبع برتقالي فاتح، كما تقاس في اللوحة اليمنى A). يسمح بمقارنة الفوتون العادية للمقارنة المباشرة لتوزيع توقيت الفوتون (اللوحة السفلية، متوسط العمر: القاعدية، 1.72 ns؛ الحركة، 1.42 ns). إظهار Insets نفس البيانات في مقياس شبه السجل. (C) Δlifetime/lifetime0 (ΔLT/LT0)آثار الخلايا المقابلة (اللوحة العليا، راجع اللوحة A)مع سرعة الحركة المفروضة (اللوحة السفلى). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.