مقالة منهجية

تقييم التعريب الخاص بنواه عدسه Zebrafish والنزاهة التكوينية

DOI:

10.3791/59528

⸱

مايو 6, 2019

 ,  , 
1Department of Physiology and Biophysics, University of California, Irvine, 2Department of Developmental and Cell Biology, University of California, Irvine

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد تم تطوير هذه البروتوكولات لتحليل شكل العدسة القشرية ، والسلامة الهيكلية لغرز العدسة الزبرافيه في العدسات الثابتة والحية ، ولقياس وضعيه نواه العدسة الزبرافيه علي طول المحور الامامي الخلفي.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

و الزرد هو مناسبه فريدة من نوعها للتلاعب الوراثية والتصوير في الجسم الخارجي ، مما يجعلها نموذجا شعبيه متزايدة للدراسات الوراثية العكسية ولتوليد العابرة للتصوير في الجسم الخارجي. هذه القدرات فريدة من نوعها جعل الزرد منصة مثاليه لدراسة تطوير عدسه العين وعلم وظائف العيون. النتائج التي توصلنا اليها مؤخرا ان اكوابورين-0 ، Aqp0a ، مطلوب لاستقرار خياطه العدسة الاماميه ، وكذلك للتحول من نواه العدسة إلى مركز العدسة مع العمر ادي بنا إلى تطوير أدوات مناسبه بشكل خاص لتحليل خصائص العدسات الزرد. هنا نحن الخطوط العريضة طرق مفصله لتشريح العدسة التي يمكن تطبيقها علي كل من العدسات اليرقة والكبار ، لاعدادهم للتحليل النسيجي ، والمناعي والتصوير. ونحن نركز علي تحليل سلامه خياطه العدسة والمورفولوجية الخلية القشرية ومقارنه البيانات المتولدة من العدسات تشريح مع البيانات التي تم الحصول عليها من التصوير في الجسم المجري من الشكل العدسة التي جعلت ممكنا من قبل خط الزرد الوراثية الجديدة مع وراثيا ترميز الفلورسنت علامة. تحليل العدسات التي تم تشريحها عموديا علي محورها البصري يسمح بالتحديد الكمي للوضع النسبي لنواه العدسة علي طول المحور الامامي الخلفي. مطلوب حركه نواه العدسة من الوضع الامامي الاولي إلى المركز لبصريات العدسة العادية في zebrafish الكبار. التالي ، فان القياس الكمي للموقف النووي للعدسة يرتبط ارتباطا مباشرا بخواصه البصرية.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

و الزرد هو نموذج ممتاز لدراسة تطور العدسة وعلم وظائف العيون بسبب أوجه التشابه التشريحية لعدسات الثدييات, سهوله نسبيه للتلاعب الوراثي والدوائي, سرعه نمو العين الجنينية, حجم صغير والشفافية في المراحل المبكرة السماح للتصوير في الجسم الفيفو . وقد وضعت الأساليب الموصوفة هنا لتحليل الشكل عدسه الزرد في مراحل الجنينية والكبار مع التركيز علي السلامة التكوينية ، والمورفولوجية غشاء القشرية في المختبر والجسم المجري ، وموقع عدسه الموقف النووي علي طول المحور الامامي الخلفي السابق فيفو. هذه الأساليب بمثابه نقطه انطلاق للدراسات الوظيفية لتطوير العدسة وعلم وظائف القلب ، فضلا عن الشاشات الجينية العكسية لأنماط العدسات في zebrafish.

التصوير المورفولوجية عدسه الزرد

اكوابورين 0 (AQP0) هو البروتين الأكثر وفره في غشاء العدسة ، وهو ضروري لكل من تطوير العدسات والوضوح ، وذلك بسبب الوظائف الاساسيه المتعددة في الثدييات. Zebrafish لديها اثنين من Aqp0s (Aqp0a و Aqp0b) وقامنا بتطوير أساليب لتحليل فقدان وظائفهم في كل من العدسات الجنينية والبالغين. وتكشف دراساتنا ان aqp0a-/-المسوختتطور التعتيم القطبية الاماميه بسبب عدم استقرار الخياطة الاماميه ، و aqp0a/b المسوخ مزدوجة تطوير التعتيم النووي1. وقد ثبت AQP0 للعب ادوار في النقل المائي2، التصاق3،4، خلوي رسو5 وتوليد الانحدار مؤشر الانكسار6، ولكن تم اجراء هذه الدراسات إلى حد كبير في المختبر. يوفر الزرد فرصه فريدة لدراسة كيفيه فقدان وظيفة ، أو وظيفة مضطربة من Aqp0a أو Aqp0b سيؤثر علي التشكل ووظيفة في عدسه حيه. لتقييم شكل خليه العدسة والسلامة التكوينية اثناء التطوير ، قمنا بتعديل الأساليب الموجودة في المختبر مناعي7 للاستخدام في العدسات الجنينية والبالغة ، والمحولات المتولدة لمراقبه هذه العملية في الجسم المجري .

تم اجراء تحليل مناعي لهيكل غشاء البلازما والسلامة التكوينية في الاجنه الثابتة بالبالكامل والعدسات البالغة. عدسات zebrafish هي صغيره للغاية (قطر العدسة هو ~ 100 μm في الاجنه وتصل إلى 1 ملم في البالغين) مقارنه مع نظرائهم الثدييات ولها نقطه الغرز8، والتي يتم القبض عليها نادرا في الحلويات. التالي ، فان العدسات كلها ضرورية لتحليل السلامة التكوينية. لتحليل الجسم المجري لتشكيل الخياطة الاماميه ، وتصوير هندسه خلايا العدسات الدقيقة ، قمنا بتوليد المحولات عبر التعبير عن mapple التي وضعت علي وجه التحديد ملصقات لاغشيه العدسات.

مزايا التصوير الحي لغشاء العدسة المتحولة تشمل: 1) تجنب التحف التثبيت ، 2) دراسة التغيرات المورفولوجية الديناميكية في الأفلام الفاصلة الزمنيه ، و 3) تمكين الدراسات الطولية التي يمكن ان تكون مرتبطة الاحداث السابقة مع في وقت لاحق ظواهر. وعاده ما يمنع تصبغ القزحية التصوير الواضح لمحيط العدسة. أضافه 1-فينيل 2-ثيوريا (PTU) قبل المرحلة بريبريديا-5 (بريم-5)9 يمنع الخلايا الصباغية وتصبغ العين تصل إلى حوالي 4 أيام بعد الإخصاب (dpf). ومع ذلك ، بعد 4 dpf ، يتم حجب محيط العدسة في الجسم المجري، وخاصه في المراحل القديمة. وعلاوة علي ذلك ، فان كثافة العدسة نفسها تحجب التصوير من القطب الخلفي لها. ولذلك ، لدراسة المورفولوجية من محيط العدسة ، أو خياطه الخلفي ، بعد 4 dpf ، العدسات تحتاج إلى ان تكون مثيره وثابته.

وقد استخدمت خطوط الزرد المحورة وراثيا لتحليل بنيه غشاء العدسة الجنينية في الجسم المجري10. الQ01 المحورة وراثيا يعبر عن البروتين الفلوري السماوي تنصهر فيه تسلسل استهداف الغشاء ، Gap43 ، مدفوعا بمروج EF1α و HEXAMER من عنصر DF4 pax6 محسن بشكل مطلق في خلايا ألياف العدسة11. Q01 لديها التعبير خارج عدسي ، بما في ذلك الخلايا الاماكيني في شبكيه العين ، والذي يضيف اشاره الخلفية إذا كان الاهتمام الرئيسي هو العدسة. وضعنا خطا جديدا المحورة وراثيا الذي يعبر عن mApple غشاء المربوطة علي وجه التحديد في العدسة ، وذلك بهدف تجنب اي اشاره خارج عدسي.

توطين نواه العدسة

اكتشفنا ان نواه العدسة تتحرك من الموقع الامامي الاولي في اليرقات الزرد إلى موقع مركزي في المحور الامامي الخلفي في العدسات البالغين. ويعتقد ان هذا التحول في موقف نواه عدسه الانكسار عاليه لتكون شرطا للتطوير الطبيعي للبصريات عدسه الزرد1. تسمح أساليبنا بالقياس الكمي للمركزية النووية للعدسة فيما يتعلق بنصف قطر العدسة. باستخدام هذه الطريقة ، أظهرنا ان Aqp0a مطلوب للمركزية النووية للعدسة1، ويمكن تطبيق هذه الطريقة البسيطة علي دراسات أخرى لتطوير وفسيولوجيا العدسة وخصائصها البصرية في نموذج الزرد.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

البروتوكولات الحيوانية المستخدمة في هذه الدراسة تلتزم البيان ARVO لاستخدام الحيوانية في بحوث العيون والبصر وتمت الموافقة عليها من قبل المؤسسة المؤسسية للعناية بالماشية والاستخدام (IACUC) من جامعه كاليفورنيا ، ايرفين.

1. التربية الوحشية والقتل الرحيم

  1. رفع والحفاظ علي الزرد (AB سلاله) في اطار الظروف المختبرية القياسية12. رفع الاجنه في وسط الجنين (EM)12. أضافه 0.003 ٪ PTU إلى EM من 20-24 h بعد الإخصاب (قبل المرحلة بريم 5) لمنع تشكيل الصباغ في الاجنه12 المستخدمة للتصوير في المراحل الجنينية9. رفع اليرقات من 6-30 يوما بعد الإخصاب (dpf) علي نظام غذائي من الروتيفرز الحية حتى 14 dpf ، ويعيش artemia بعد 14 dpf12.
    تحذير: PTU هو سام جدا
  2. تخدير الأسماك باستخدام tricaine حتى غير مستجيبة للمس.
    1. اعداد الأسهم tricaine من خلال الجمع بين 400 ملغ من 3-امينو البنزويك اكيدثيستر ، مع 2.1 مل من تريس 1 م (pH 9) ، في 100 mL من ddH2س. ضبط إلى الأس الهيدروجيني 7.0 وتخزين في-20 درجه مئوية.
      تحذير: Tricaine سامه.
    2. تمييع 4.2 مل من الأسهم tricaine في 100 mL من خزان المياه لتخدير اليرقات/البالغين أو في EM لتخدير الاجنه (التركيز النهائي من tricaine في 0.0165 ٪ ث/الخامس).

2. تثبيت الاجنه واليرقات

ملاحظه: مناعيت بروتوكولات كان من سابقا ينشر مواد7.

  1. إصلاح الاجنه المكررة أو اليرقات حتى 2 أسابيع بعد الإخصاب في 4 ٪ (v/v) بارافورمالدهيد (PFA) في الفوسفات مخزنه المالحة (تلفزيوني) بين عشيه وضحيها في 4 درجه مئوية علي الروك.
    تحذير: PFA قابله للاحتراق ومسرطنه.
  2. يغسل الاجنه ثلاث مرات لمده 10 دقيقه في الاذاعه التلفزيونية ، ويتخلل في الاذاعه التلفزيونية مع 10 ٪ تريتون و 1 ٪ DMSO (تلفزيوني-T) بين عشيه وضحيها في 4 درجه مئوية.
    تحذير: DMSO سامه ، ضاره بابتلاع أو امتصاص الجلد ، يحمل المواد الخطرة من خلال الجلد ، وقابله للاحتراق. تريتون هو سامه ، وتاكل وخطره علي البيئات المائية.

3. تشريح العدسات الكبيرة والكبار Zebrafish

  1. تخدير الأسماك من 6 يرقات dpf إلى مرحله البلوغ مع tricaine حتى غير مستجيبة للمس ولكن لا تزال تظهر نبضات قويه. قياس طول السمك القياسية وفقا شيلينغ (2002) لتجهيز13.
  2. علي الفور المكوس باستخدام مقص الصغرى تشريح ومكان في طبق تشريح في تلفزيوني (الشكل 2 أظهرت للعيون الكبار).
    1. جعل طبق 35 mm مخصصه مليئه سيليكون لفصل العدسة. مره واحده وقد وضعت سيليكون ، والمكوس ديفوت حول 2-3 مم في القطر و 0.5 مم عميق لتعبئة عيون الكبار/العدسات اثناء تشريح.
  3. تشريح العدسات البالغة الزرد
    1. وضع العين البالغين في صحن ديفوت الجانب الخلفي حتى مليئه بالتلفزيونية. تحريك العين عن طريق إدخال ملقط في < زاوية 45 ° من خلال القرص البصري. يجب الحرص علي عدم نك أو ضغط العدسة. اجراء اثنين أو ثلاثه شقوق شعاعي من خلال شبكيه العين والصلبة من القرص البصري إلى منطقه الهدبيه مع مقص تشريح.
    2. قشر الظهر الشبكية والصلبة مثل بتلات الزهور وعكس العين ، والجانب القرنية حتى. التعبئة العدسة بشكل غير مباشر عن طريق التلاعب في الصلبة والقرنية مع الجانب المسطح من المقص ، في حين سحب بعيدا الشبكية والانسجه المرفقة مع ملقط. تقليم الانسجه الزائدة بعناية من العدسة.
      ملاحظه: من الضروري تشريح بعناية للحصول علي عدسات صحية باستمرار.
  4. تشريح عدسات اليرقات الزبرافيش
    1. وضع الجانب الخلفي العين يرقات حتى علي الجزء المسطح من صحن السيليكون مليئه بالتلفزيون واستخدام ابره التنغستن شحذ لجعل التخفيضات شعاعي من خلال شبكيه العين والصلبة في حين التعبئة للعين مع ابره التنغستن أخرى أو ملقط.
      ملاحظه: احرص علي عدم اتلاف العدسة.
      1. شحذ غيض من طول 2 سم من 0.1 مم التنغستن الأسلاك اليكتروليتيا عن طريق تعليق غيض الأسلاك إلى 10 ٪ (ث/ف) NaOH وتطبيق الجهد المنخفض بالتناوب الحالي14. تامين الابره في ماصه باستور عن طريق ذوبان نهاية الزجاج باستخدام موقد Bunsen.
        ملاحظه: ويمكن أيضا استخدام أدوات التشريح الدقيقة البديلة.
        تحذير: NaOH هو تاكل.
    2. اسكب العدسة برفق من العين المنفصلة بجانب حاد من الابره ، واسحب الانسجه المرفقة بعيدا بعناية.

4. تثبيت عدسات التشريح

  1. علي الفور إصلاح العدسات تشريح في 1.5 ٪ (v/v) PFA في الخدمات التلفزيونية لمده 24 ساعة في درجه حرارة الغرفة (RT). غسل العدسات ثلاث مرات في الاذاعه التلفزيونية لمده 10 دقيقه لكل منهما.
  2. العدسات التي تتخلل التحليل الكامل لجبل أو كريوبروتيكت للحصول علي التجميد (انظر القسم 8).
    1. العدسات التي تتخلل الليل في الساعة 4 درجه مئوية.

5. عدسه مناعي

  1. اغشيه التسمية من الاجنه الثابتة/اليرقات أو البالغين العدسات عن طريق الحضانة في Phسبائك-اليكسا فلور 546 (1:200) ونواه الخلية مع dapi (1:1000 من 5 ملغ/مل الأسهم) في الليلة الواحدة في الاذاعه التلفزيونية-T في 4 ° c.
    تحذير: DAPI هو مهيج الجلد والعين.
  2. يغسل ثلاث مرات مع تلفزيوني-T لمده 10 دقيقه لكل منهما. مسح الانسجه عن طريق الحضانة في 30 ٪ ، 50 ٪ و 70 ٪ الجلسرين في تلفزيوني-T (v/v) لمده 1 ساعة علي الأقل في RT لكل منهما ، أو بين عشيه وضحيها في 4 درجه مئوية.
  3. جبل الأسماك في 70 ٪ الجلسرين في تلفزيون-T (v/v) علي الزجاج السفلي 35 مم الاطباق microwell مع عيون مسطحه ومباشره ضد زلة الغطاء ممكن. بالنسبة للأسماك الأصغر سنا ، قد يساعد الميل الامامي الجانبي الخفيف علي توجيه خيط العدسة ليكون موازيا للكوفرشفه.

6. تحليل الغرز العدسة الاماميه Zebrafish باستخدام خط المحورة وراثيا في فيفو

  1. توليد Tg (الخط الأول: mAppleCAAX) خطوط باستخدام Tol2 kit15. Tol2 العنصر تسري النظام15 تمكن التكامل مستقره من البناء حيث هو مدفوعة mapple بواسطة 300 bp من الإنسان البشرية-بلورات المروج16 المربوطة إلى الغشاء من قبل تسلسل caax مما ادي إلى التعبير علي وجه التحديد في اغشيه الخلايا ألياف العدسة.
    ملاحظه: هذا البناء (ID: 122451) متاح للشراء.
    1. في صباح الحقن ، واعداد خليط الحقن والحفاظ علي الجليد. للوصول إلى الحجم النهائي من 10 μl التي تحتوي علي rnase-وخاليه من dnase H2س ، أضافه:1.5 μl من هو البكاء: mapplecaax الحمض النووي بناء في 50 ng/μl-[0.375-0.75 pg/الحقن النهائي] ، 1.5 μl من Tol2 للترانسبوزاز mrna في 300 ng/μl (Tol2 kit)15 [15-30 pg/ الحقن النهائي] ، و 1 μL من مؤشر الفينول الأحمر في 1 ٪ ث/ف [1 x10-5٪ (ث/ف)/الحقن النهائي].
    2. حقن 50-100 pL من خليط الحقن في 1 خليه الاجنه المرحلة12.
  2. قياس الكفاءة عبر التكوين في F0 حقن الاجنه عن طريق قياس تواتر الاجنه مع العدسات الايجابيه mApple في 3 dpf.
    ملاحظه: نتوقع ان يكون > 80% الكفاءة عبر التكوين باستخدام هذا الأسلوب. F0 الفسيفساء تسمح بتحليل مفصل من مورفولوجيس غشاء الخلايا الفردية. مستويات مختلفه من الفسيفساء يسمح للمرء ان الصورة المتحولة من مجموعات واحده أو صغيره من الخلايا ، في حين ان التعبير عن عدسه أكثر العالمية يسمح تحليل الهياكل متعدد الخلايا مثل الغرز عدسه في الجسم المجري.
  3. Outcross F0 الأسماك الفسيفساء لتوليد خطوط مستقره ، والتي تسميه جميع اغشيه الخلايا ألياف. F0 مؤسسي مع الجينات المدمجة في جرثومي سوف تولد ذريه مع التكامل مستقره التي يمكن الحفاظ عليها كخطوط المحورة وراثيا.

7. تحليل الغرز العدسة الاماميه Zebrafish باستخدام خط المحورة وراثيا في فيفو

  1. تخدير 3 dpf أو الكبار الفسيفساء أو الأسماك المعدلة وراثيا مستقره وجبل في 1 ٪ ذوبان منخفضه اجنشا (LMA) مع tricaine مع العين شقه ضد زلة غطاء من الزجاج الاطباق microwell القاع.
    1. تذوب 1 غرام من LMA في 100 مل من EM (بدون الميثيلين الأزرق) لجعل 1 ٪ LMA. تخزين علي المدى الطويل كما 15 مل الأسهم في 4 ° c. الميكروويف لأذابه الأوراق المالية وتخزينها عند 42 درجه مئوية حتى يتم استخدام كل أنبوب.
  2. تغطيه الأسماك تصل إلى 6 dpf مع EM مع tricaine ، أو مع خزان المياه مع tricaine للبالغين عندما يتم تعيين LMA.
    1. مزيج 5 مل من EM دون الميثيلين الأزرق أو خزان المياه مع 250 μL من الأسهم tricaine و 7 μL من PTU إذا التصوير PTU الأسماك المعالجة.

8. العدسات والمناعي

  1. كريوبروتيكت الاجنه الثابتة أو العدسات الكبار عن طريق وضع إلى 10 ٪ السكروز في التليفزيون (w/v) ، السكروز 20 ٪ ل 1 ح في RT كل (أو بين عشيه وضحيها في 4 درجه مئوية) وبين عشيه وضحيها في 30 ٪ السكروز في 4 درجه مئوية.
  2. تضمين الانسجه في أكتوبر في قوالب قاعده ، ومن ثم تجميد علي البقع مع OCT. الحصول علي 12-14 μm وجمع علي الشرائح المجهر Superfrost/زائد. المقاطع الدافئة علي الشريحة لمده 10 دقيقه علي الشريحة دفئا يسخن إلى ~ 35 درجه مئوية.
  3. غسل المقاطع ثلاث مرات مع تلفزيوني لمده 10 دقيقه لكل منهما. أقسام التسمية مع الفوليدين-اليكسا الطحين 546 (1:200) مع DAPI (1:1000) أو WGA-اليكسا الطحين 594 (1:200) ، تليها ثلاثه يغسل التلفزيونية. جبل مع المضادة--تتلاشي تصاعد المتوسطة ، وختم كوفيرسليب مع طلاء الأظافر.

9-التصوير

  1. الحصول علي الصور مع المجهر البؤري. الحصول علي أكوام z أو شرائح بصريه باستخدام 60x N/A 1.2 المياه الغمر الهدف ، أو ما شابه ذلك ، في مناطق معينه من العمود الامامي للعدسة الخلفية. استخدام إعدادات الاكتساب التالية: 1.2 القرص مهواه باستخدام الليزر 561 nm ، تكساس الحمراء فلتر ل phمسبوكه-اليكسا الطحين 546 أو mApple ، أو الليزر 405 مع فلتر الاشعه فوق البنفسجية ل DAPI.
  2. تصحيح قوه الليزر z-الكثافة لمواجهه فقدان الاشاره مع عمق في العدسة. وهذا يسمح لاشاره قويه في القطب الخلفي من الاجنه الثابتة والحية 3 dpf ، واشاره قويه في الشرائح البصرية الاستوائية في عدسات الأسماك الكبار.
  3. تجميع الصور وعرضها باستخدام برامج معالجه الصور.

10. قياس توطين نواه العدسة في المحور الامامي الخلفي

  1. توجيه العدسات المثيرة الطازجة في الاذاعه التلفزيونية في صحن 35 مم مع أسفل الغطاء الزجاجي ، مع أقطاب والغرز المنحى موازيه لمستوي التركيز. ابحث عن فرق في مؤشر الانكسار ، والذي يحدث عاده في واجهه قشره العدسة ونواه العدسة للتعرف علي نواه العدسة.
    ملاحظه: العدسات البرية الصحية البالغة النوعية شفافة للغاية مما يجعل من الصعب رؤية غرز العدسات والنواة ، أو لتحديد اتجاه العدسة. في هذه الحالة ، فان الشق البسيط مع الملقط إلى كبسوله العدسة يسبب ضررا طفيفا ، مما يجعل الغرز ونواه العدسة واضحة في حوالي 10 دقائق مما يساعد علي توجيه العدسة لهذا القياس. ومع ذلك ، تصبح العدسات غير قابله للاستخدام للتطبيقات المصب كما انها معطوبة الآن.
  2. التقاط صور من العدسات مع نواه العدسة في التركيز تحت أضاءه الحقل الساطع مع أو بدون البصريات DIC باستخدام مجهر تشريح مع كاميرا المرفقة. صوره ميكرومتر تحت نفس التكبير للمعايرة.
    1. انقر علي زر العرض المباشر ، واضبط إعدادات التعريض لتصور نواه العدسة ومحيط العدسة ، والتقط صوره بالنقر علي زر التقاط المفاجئ. حفظ كملف tif.
    2. استخدام برامج معالجه الصور لمعايره صور العدسات المكتسبة. حدد أداه الخط المستقيم وارسم خطا من الطول المعروف علي صوره الميكرومتر ، انقر فوق تحليل | تعيين المقياس. ادخل المسافة المعروفة والوحدات وحدد المعايرة "العمومية" ، وانقر موافق.
  3. قياس المسافة من مركز نواه العدسة إلى القطب الامامي (a-r).
    1. استخدم أداه الخط المستقيم في برنامج معالجه الصور لرسم خط عبر مركز نواه العدسة في الاتجاه المحوري. خذ مركز هذا الخط كمركز لنواه العدسة.
    2. رسم خط آخر من هذه النقطة إلى القطب الامامي من العدسة وحدد "قياس" في القائمة ' تحليل ' لقياس المسافة (ا-r) ، حيث هو نصف قطر العدسة و r هو المسافة من مركز العدسة إلى مركز نواه.
    3. رسم خط آخر من الامامي إلى القطبين الخلفي وقياس هذه المسافة كما قطر العدسة (2a). انسخ هذه الأطوال من نافذه "النتائج" وانقلها إلى جدول بيانات أو برنامج إحصائيات.
      ملاحظه: فمن الأسهل لقياس بدقه من وسط النواة إلى القطب الامامي ، من قياس من مركز نواه العدسة إلى مركز العدسة. يتم تحويل هذا القياس بواسطة الصيغة في الخطوة 10.3.5 للإبلاغ عن المسافة من مركز نواه العدسة إلى مركز العدسة. دائما استخدام نواه الكبار للقياسات ، حتى لو كانت النواة الجنينية واضحة.
    4. تقسيم القطر بمقدار 2 ، لحساب نصف قطر العدسة ، ا.
    5. احسب r/a، figure-protocol-1 وهو التوطين الطبيعي لنواه العدسة فيما يتعلق بنصف قطر العدسة.
      ملاحظه: بالنسبة لنواه وضعت أقرب إلى القطب الامامي ، r/a سيكون > 0.0 ، في حين سيكون نواه مترجمه مركزيا r/a من 0.0.
  4. رسم بياني لقياس النواة المحورية التي تم تطبيعها كداله للطول القياسي لتحديد التغييرات في توطين نواه العدسة اثناء التطوير الإشعاعي.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكبار التشريح العين الزرد يشبه عن كثب ان من الثدييات (الشكل 1a). علي الرغم من بعض الاختلافات بين العيون الزبرده والثدييات ، مثل وجود منطقه الهالهاري بدلا من الجسم الهالهاري17، والاختلافات في الخصائص البصرية18، والاختلافات في التكوين الجنيني خلال النمو في الجنين19، و العين الزرد هو نموذج ممتاز لدراسة تطور العين وفهم امراض العيون20،21

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تحليل شكل العدسة الزبرافيش هو الخطوة الاولي في فهم الأنماط الظاهرية في المسوخ ، أو اثار التدخلات الدوائية التي تهدف إلى دراسة علم الاحياء من عدسه العين. ونحن الخطوط العريضة لتحليل الغرز عدسه ، والنسيج الخلية ألياف القشرية وجوانب من نواه العدسة. وهذه النهج هي مزيج من المختبرات والكائنات المجرية (مقارنه بالجدول 1). الأساليب في المختبر تسمح لمزيد من التفاصيل من الشكل الخارجي الخلايا القشرية ، فضلا عن الوصول إلى خياطه الخلفي في العدسات الكبار.

في...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدينا إفصاحات

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نود ان نعترف مصدر التمويل لدينا: المعاهد القومية للصحة R01 EY05661 إلى j. e. H ، Ines gehring للمساعدة في توليد aqp0a/b المسوخ مزدوجة وتربيه الزرد ، الدكتور دانيال dranow للمناقشات المؤدية إلى توليد العابرين ، الدكتور بروس مختبرات بلومبيرج والدكتور كين تشو لاستخدام المجاهر التشريح ، والدكتورة ميغان سميث للمساعدة في التحليل الإحصائي.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
1-فينيل-2-ثيوريا (PTU)SigmaP7629CAUTION & ذو سمية
جدا 4٪ محلول مائي بارافورمالدهيدعلوم المجهر الإلكترونيRT 157-4CAUTION & مخاطر صحية,
مجهر متحد البؤرNikonEclipse Ti-E
CryostatLeicaCM3050Sضبط الهدف ودرجة حرارة الغرفة على -21 & درجه; C
DAPIInvitrogenD1306CAUTION & ndash; تهيج للعيون والجلد
ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO)فيشر ScientificD128CAUTION – قابل للاحتراق ، يخترق الجلد  
قالب قاعدة يمكن التخلص منهVWR Scientific15154-631
ماصات زجاجية باستور يمكن التخلصمنها Fisherbrand13-678-20A
Dumont # 5 ملقطDumont & amp FilsKeep ملقط شحذ
ملح إيثيل 3-أمينوبنزوات ميثان سولفونات (تريكايين)Sigma-AldrichA5040CAUTION -
طبق صغير ذو قاع زجاجي سام (طبق بتري 35 مم ، 14 مم ميكروويل ، # 1.5 غطاء زجاجي)MatTek CorporationP35G-1.5-14-C
GlycerolSigmaG2025
hu & beta ؛ B1cry:mAppleCAAX DNA buildAddgeneID:122451
ImageJWayne Rasband, NIHv1.51n
Low Melt Agarose (LMA)Apex902-36-6
NIS-ElementsNikonV 4.5
NIS-Elements ARsoftware Nikon
Olympus  مع نموذج 2.1.1.183 وحدة تحكمأوليمبوسDP70
أوليمبوس المجهر أوليمبوس كوربSZX12
فالويدين أليكسا طحين 546ثيرمو فيشرA22283
مؤشر الفينول الأحمر (1٪ وزن / حجم)شركة ريكا للكيماويات5725-16
محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS)فيشر ساينتفيكBP399
فوتوشوبأدوبيCS5 v12.0
برنامج فوتوشوبأدوبيCS5 v12.0
خطة Apo 60x / 1.2 WD الهدفنيكون
مصدر الطاقةWild HeerbruggMTr 22أو مصدر طاقة مكافئ  
نموذج مدفأة الشرائح رقم 26020FSفيشر Scientific12-594
حبات هيدروكسيد الصوديومفيشر ScientificS612-3تحذير - تآكل / مزعج للعيون والجلد ، العضو المستهدف - الجهاز التنفسي ، تآكل للمعادن Superfrost
/ Plus مجهر شريحةفيشر Scientific12-550-15
سيلجارد 184 سيليكون داو كورنينجوورلد بريفيجن إنستروكسSYLG184
Tissue-Tek O.C.T. مركبساكورا فينيتيك4583
تريتون X-100 BioXtraسيجماT9284الحذر & سامة ، خطرة على البيئة المائية ،
مقص تشريح دقيق VannasTed Pella Inc1346نصائح مستقيمة حادة / حادة
Vectashield مضاد للبهتان وسيطVector مختبراتH-1000
Wheat Germ Agglutinin (WGA) - Alexa Flour-594Life TechnologiesW11262
قابل للاحتراق كورب التآكل

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Vorontsova, I., Gehring, I., Hall, J. E., Schilling, T. F. Aqp0a Regulates Suture Stability in the Zebrafish Lens. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 59 (7), 2869-2879 (2018).
  2. Hall, J. E., Mathias, R. T. The Aquaporin Zero Puzzle. Biophysical Journal. 107 (1), 10-15 (2014).
  3. Nakazawa, Y., Oka, M., Funakoshi-Tago, M., Tamura, H., Takehana, M. The Extracellular C-loop Domain Plays an Important Role in the Cell Adhesion Function of Aquaporin 0. Current Eye Research. 42 (4), 617-624 (2017).
  4. Kumari, S. S., Varadaraj, K. Intact AQP0 performs cell-to-cell adhesion. Biochemical and Biophysical Research Communications. 390 (3), 1034-1039 (2009).
  5. Lindsey Rose, K. M., et al. The C Terminus of Lens Aquaporin 0 Interacts with the Cytoskeletal Proteins Filensin and CP49. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47 (4), 1562-1570 (2006).
  6. Kumari, S. S., Varadaraj, K. Aquaporin 0 plays a pivotal role in refractive index gradient development in mammalian eye lens to prevent spherical aberration. Biochemical and Biophysical Research Communications. 452 (4), 986-991 (2014).
  7. Uribe, R. A., Gross, J. M. Immunohistochemistry on Cryosections from Embryonic and Adult Zebrafish Eyes. Cold Spring Harbor Protocols. 2007 (7), (2007).
  8. Dahm, R., Schonthaler, H. B., Soehn, A. S., van Marle, J., Vrensen, G. F. J. M. Development and adult morphology of the eye lens in the zebrafish. Experimental Eye Research. 85 (1), 74-89 (2007).
  9. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Developmental Dynamics. 203 (3), 253-310 (1995).
  10. Greiling, T. M. S., Clark, J. I. Early lens development in the zebrafish: A three-dimensional time-lapse analysis. Developmental Dynamics. 238 (9), 2254-2265 (2009).
  11. Godinho, L., et al. Targeting of amacrine cell neurites to appropriate synaptic laminae in the developing zebrafish retina. Development. 132 (22), 5069-5079 (2005).
  12. Westerfield, M. The Zebrafish Book: A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio). , University of Oregon Press. (2002).
  13. Schilling, T. F. Zebrafish. Nusslein-Volhard, C., Dahm, R. 261, Oxford University Press. 59-94 (2002).
  14. Brady, J. A simple technique for making very fine, durable dissecting needles by sharpening tungsten wire electrolytically. Bulletin of the World Health Organization. 32 (1), 143-144 (1965).
  15. Kwan, K. M., et al. The Tol2kit: A multisite gateway-based construction kit for Tol2 transposon transgenesis constructs. Developmental Dynamics. 236 (11), 3088-3099 (2007).
  16. Hou, H. H., Kuo, M. Y. P., Luo, Y. W., Chang, B. E. Recapitulation of human βB1-crystallin promoter activity in transgenic zebrafish. Developmental Dynamics. 235 (2), 435-443 (2006).
  17. Soules, K., Link, B. Morphogenesis of the anterior segment in the zebrafish eye. BMC Developmental Biology. 5 (1), 12(2005).
  18. Greiling, T. M. S., Clark, J. I. The transparent lens and cornea in the mouse and zebra fish eye. Seminars in Cell & Developmental Biology. 19 (2), 94-99 (2008).
  19. Greiling, T. M. S., Aose, M., Clark, J. I. Cell Fate and Differentiation of the Developing Ocular Lens. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51 (3), 1540-1546 (2010).
  20. Richardson, R., Tracey-White, D., Webster, A., Moosajee, M. The zebrafish eye-a paradigm for investigating human ocular genetics. Eye. 31, 68(2016).
  21. Gestri, G., Link, B. A., Neuhauss, S. C. F. The Visual System of Zebrafish and its Use to Model Human Ocular Diseases. Developmental Neurobiology. 72 (3), 302-327 (2012).
  22. Chhetri, J., Jacobson, G., Gueven, N. Zebrafish on the move towards ophthalmological research. Eye. 28 (4), 367-380 (2014).
  23. Lim, J. C., Walker, K. L., Sherwin, T., Schey, K. L., Donaldson, P. J. Confocal Microscopy Reveals Zones of Membrane Remodeling in the Outer Cortex of the Human Lens. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 50 (9), 4304-4310 (2009).
  24. Lim, J. C., Vaghefi, E., Li, B., Nye-Wood, M. G., Donaldson, P. J. Characterization of the Effects of Hyperbaric Oxygen on the Biochemical and Optical Properties of the Bovine LensEffects of HBO on the Bovine Lens. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 57 (4), 1961-1973 (2016).
  25. Gold, M. G., et al. AKAP2 anchors PKA with aquaporin-0 to support ocular lens transparency. EMBO Molecular Medicine. 4 (1), 15-26 (2012).
  26. Petrova, R. S., Schey, K. L., Donaldson, P. J., Grey, A. C. Spatial distributions of AQP5 and AQP0 in embryonic and postnatal mouse lens development. Experimental Eye Research. 132, 124-135 (2015).
  27. Chee, K. N., Vorontsova, I., Lim, J. C., Kistler, J., Donaldson, P. J. Expression of the sodium potassium chloride cotransporter (NKCC1) and sodium chloride cotransporter (NCC) and their effects on rat lens transparency. Molecular Vision. 16, 800-812 (2010).
  28. Hayes, J. M., et al. Integrin α5/fibronectin1 and focal adhesion kinase are required for lens fiber morphogenesis in zebrafish. Molecular Biology of the Cell. 23 (24), 4725-4738 (2012).
  29. Imai, F., Yoshizawa, A., Fujimori-Tonou, N., Kawakami, K., Masai, I. The ubiquitin proteasome system is required for cell proliferation of the lens epithelium and for differentiation of lens fiber cells in zebrafish. Development. 137 (19), 3257-3268 (2010).
  30. Biswas, S. K., Lee, J. E., Brako, L., Jiang, J. X., Lo, W. K. Gap junctions are selectively associated with interlocking ball-and-sockets but not protrusions in the lens. Molecular Vision. 16, 2328-2341 (2010).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة