توفر هذه الطريقة إطارا لدراسة دمج الأحماض الدهنية الخارجية من المصادر المضيفة المعقدة في الأغشية البكتيرية ، وخاصة المكوراتالعنقودية العضوية . ولتحقيق ذلك، يتم وصف بروتوكولات لإثراء جزيئات البروتين الدهني من صفار بيض الدجاج وتوصيف الأحماض الدهنية اللاحقة للفوسفوليبيدات البكتيرية باستخدام قياس الطيف الكتلي.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
عزل جزيئات البروتين الدهني من صفار بيض الدجاج لدراسة دمج الأحماض الدهنية المسببة للأمراض البكتيرية في الدهون الفوسفاتية الغشاء
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
المكورات العنقودية أوريوس وغيرها من مسببات الأمراض إيجابية الجرام دمج الأحماض الدهنية من البيئة في فوسفوليبيدات الغشاء. خلال العدوى ، توجد غالبية الأحماض الدهنية الخارجية داخل جزيئات البروتين الدهني المضيف. ولا يزال عدم اليقين قائما فيما يتعلق بخزانات الأحماض الدهنية المضيفة والآليات التي تستخرج بها البكتيريا الأحماض الدهنية من جزيئات البروتين الدهني. في هذا العمل، ونحن نصف بروتوكولات لإثراء البروتين الدهني منخفض الكثافة (LDL) جزيئات من صفار البيض الدجاج وتحديد ما إذا كانت LDLs بمثابة خزانات الأحماض الدهنية لS. aureus. هذا الأسلوب يستغل تحليل الدهون غير متحيزة وLDLs الدجاج، وهو نموذج فعال واقتصادي لاستكشاف التفاعلات بين LDLs والبكتيريا. يتم إجراء تحليل S. aureus التكامل من الأحماض الدهنية الخارجية من LDLs باستخدام عالية الدقة / قياس الطيف الكتلي الدقيق والقياس الطيفي الكتلي جنبا إلى جنب، مما يتيح توصيف تكوين الأحماض الدهنية للبكتيريا غشاء وتحديد غير متحيزة من تركيبات جديدة من الأحماض الدهنية التي تنشأ في الدهون الغشاء البكتيري عند التعرض لLDLs. تقدم هذه التقنيات المتقدمة لقياس الطيف الكتلي منظورًا لا مثيل له لدمج الأحماض الدهنية الدهنية من خلال الكشف عن الأحماض الدهنية الخارجية المحددة المدمجة في الدهون الفوسفاتية. الطرق المبينة هنا قابلة للتكيف مع دراسة مسببات الأمراض البكتيرية الأخرى والمصادر البديلة للأحماض الدهنية المعقدة.
المقدمة
Methicillin مقاومة S. aureus (MRSA) هو السبب الرئيسي للعدوى المرتبطة بالرعاية الصحية ومقاومة المضادات الحيوية المرتبطة بها هو تحد سريري كبير1،2،3. ولذلك، فإن وضع استراتيجيات علاجية جديدة هو أولوية عالية. استراتيجية العلاج واعدة لمسببات الأمراض إيجابية الجرام هو تثبيط تخليق الأحماض الدهنية، وهو شرط لإنتاج الدهون الفوسفاتية الغشاء الذي، في S. أوريوس،ويشمل فوسفاتيديلغليسيرول (PG)، ليسل-PG، وcardiolipin4. في البكتيريا، يحدث إنتاج الأحماض الدهنية عن طريق التخليق الأحماض الدهنية الثاني المسار (FASII)5، والذي يختلف اخ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
ملاحظة: البروتوكول التالي لإثراء جزيئات LDL من صفار بيض الدجاج مشتق من موسى وآخرون 200233.
1. إعداد صفار البيض الدجاج لإثراء جزيئات LDL
- قم بتعقيم بيضتي دجاج كبيرتين عن طريق غسل الأصداف بمحلول الإيثانول بنسبة 70% والسماح بتجفيف الهواء.
- قم بتعقيم فاصل البيض باستخدام محلول الإيثانول بنسبة 70% والسماح بتجفيف الهواء. يُرفق فاصل البيض على شفة كوب متوسط الحجم.
- الكراك كل بيضة على حدة في فاصل البيض والسماح للألبومين لتدفق إلى الكأس. سيتم الاحتفاظ صفار البيض سليمة من قبل فاصل.
- اغسل صفار البيض مرتين مع 30 مل من محلول ملحي معقم بالفوسفات (PBS) لإزالة الزلال المتبقي.
- وضع صفار البي....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
ويتضح بروتوكول إثراء LDL من صفار البيض الدجاج في الشكل 1. تبدأ هذه العملية بتخفيف صفار البيض الكامل مع المالحة وفصل المواد الصلبة صفار البيض المشار إليها كحبيبات منالكسر القابل للذوبان أو البلازما التي تحتوي على LDLs (الشكل 1)33. يتم إثراء محتوى LDL من جزء البلازما من خلال هطول الأمطار من ~ 30-40 kDa β-livetins (الشكل 2)33. وجود نطاقات البروتين في 140، .......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
S. aureus يدمج الأحماض الدهنية الخارجية في الدهون الفوسفاتية غشاء27،32،43. تركيب فوسفوليبيد باستخدام الأحماض الدهنية الخارجية يتجاوز تثبيط FASII ولكن أيضا يغير الخصائص البيوفيزيائية للغشاء27،32،44. في حين أن دمج الأحماض الدهنية الخارجية في الدهون الفوسفاتية من مسببات الأمراض إيجابية الجرام موثقة بشكل جيد، لا تزال هناك ثغرات في .......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
وليس لدى أصحاب البلاغ أي كشف.
شكر وتقدير
نشكر أعضاء مختبر هامر على تقييمهم النقدي للمخطوطة ودعمهم لهذا العمل. الدكتور أليكس هورسويل من كلية الطب بجامعة كولورادو يرجى تقديم AH1263. قدم الدكتور كريس ووترز مختبر في جامعة ولاية ميشيغان الكواشف. وقد تم دعم هذا العمل من قبل جمعية القلب الأمريكية منحة 16SDG30170026 والأموال الناشئة التي تقدمها جامعة ولاية ميشيغان.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| كبريتات الأمونيوم | فيشر | BP212R-1 | & ge ؛ 99.5٪ |
| حاضنة ثقافة الخلية | النقية Thermo | MaxQ 6000 | |
| Centrafuge | Thermo | 75-217-420 | Sorvall Legen XTR ، الدوار F14-6x250 LE |
| لوحة فحص Costar | Corning | 3788 | 96 بئر |
| ورق ترشيح | Schleicher & Schuell | 597 | |
| بيضة دجاج كبيرة | N / A | N / | A اشترى متجر مشترك بيض |
| مقياس الطيف الضوئي Microplate | BioTek | Epoch 2 | |
| NaCl | Sigma | S9625 | |
| S. aureus سلالة AH1263 | N / A | N / A | مقدمة من أليكس هورسويل من جامعة كولورادو |
| أنابيب غسيل الكلى | بيرس | 68700 | 7,000 MWCO |
| Tryptone | Becton و Dickison and Company | 211705 | |
| 0.5 مم حبات أكسيد الزركونيوم | Next Advance | ZROB05 | |
| Bullet Blender | Next Advance | BBX24B | |
| Methanol (درجة LC-MS) فيشر | A4561 | ||
| الكلوروفورم (درجة الكاشف) | فيشر | MCX10559 | |
| الأيزوبروبانول (درجة LC-MS) | فيشر | A4611 | |
| ديميريستويل فوسفاتيديل كولين | أفانتي الدهون القطبية | 850345C-25mg | |
| بيكربونات الأمونيوم | سيجما | 9830 | & ge ؛ 99.5٪ فورمات |
| الأمونيوم | Sigma | 70221-25G-F | |
| برنامج Xcalibur | Thermo Scientific | OPTON-30801 | |
| LTQ-Orbitrap Velos مطياف الكتلة | الحرارية العلمية | عالية الدقة / كتلة دقيقة MS | |
| Agilent 1260 الشعيرات الدموية HPLC | Agilent | ||
| SpeedVac مكثفات الفراغ | الحرارية العلمية |
المراجع
- Noskin, G. A., et al. National trends in Staphylococcus aureus infection rates: impact on economic burden and mortality over a 6-year period (1998-2003). Clinical Infectious Diseases. 45 (9), 1132-1140 (2007).
- Noskin, G. A., et al.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
