مقالة منهجية

تقييم الاستجابة المناعية الخلوية ذبابة الفاكهة، melanogaster المورفولوجية، استخدام "في فيفو البلعمه بالانزيم"

7.3K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/59543

⸱

أبريل 10, 2019

 , 
1Department of Biology, University of Maryland, 2Department of Cell Biology and Molecular Genetics, University of Maryland, 3Institute for Bioscience and Biotechnology Research, University of Maryland

في هذه المقالة

ملخص

ويصف هذا البروتوكول مقايسة المجراة في البلعمه في الكبار melanogaster المورفولوجية التحديد الكمي للاعتراف بلعمية وتخليصها من العدوى الميكروبية.

الملخص

ويوفر الحصانة الفطرية في جميع الحيوانات، دفاع فورية وقوية ضد طائفة واسعة من العوامل الممرضة. الاستجابات المناعية خلطيه وخلوية الفروع الرئيسية للحصانة الفطرية، والعديد من العوامل التي تنظم هذه الاستجابات هي تقحم المصانة بين اللافقاريات والثدييات. البلعمه، عنصرا رئيسيا من الحصانة الفطرية الخلوية، قام بها خلايا الدم متخصصة في الجهاز المناعي. ذبابة الفاكهة، melanogaster المورفولوجية، برز كنموذج وراثية قوية للتحقيق في الآليات الجزيئية والتأثيرات الفسيولوجية البلعمه في الحيوانات كلها. هنا علينا أن نظهر مقايسة المستندة إلى حقن المجراة في البلعمه قياس امتصاص الجسيمات وتدمير خلايا الدم المورفولوجية ، هيموسيتيس. الإجراء الذي يسمح للباحثين التحكم بدقة في تركيز الجسيمات والجرعة، مما يجعل من الممكن الحصول على نتائج عالية استنساخه في فترة قصيرة من الزمن. التجربة الكمية، من السهل القيام به، ويمكن تطبيقها على الشاشة لعوامل المضيف هذا التأثير الممرض الاعتراف وامتصاص وإزالة الألغام.

المقدمة

دفاعات المناعة الفطرية تشكل الخط الأول للدفاع ضد الجراثيم المسببة للأمراض. يمكن تقسيم هذه الردود وظيفيا إلى الحصانة الفطرية خلطيه وخلوية، وكلاهما وساطة من مستقبلات الاعتراف بنمط ترميز الخط (برس) أن الشعور بأنماط الجزيئية المرتبطة بالعوامل الممرضة (بامبس)1. هي حفظت العديد من مسارات الإشارات والآليات المستجيب للحصانة الفطرية في الثدييات واللافقريات، مثل ديدان أسطوانية، ايليجانس كاينورهابديتيس، وذبابة الفاكهة، المورفولوجية ميلانوجاستير2. ذبابة الفاكهة برز كنظام قوي لدراسة الدفاع المضيف ضد الكائنات الدقيقة المعدية3. المورفولوجية وراثيا أصعب، بسهولة وبتكلفة زهيدة تربيتها في المختبرات، وله وقت قصير جيل. وعلاوة على ذلك، يسلك ذبابة الفاكهة ذات كفاءة عالية الدفاعات ضد مجموعة ميكروبات، مما يتيح النظر في الحصانة المضيف ضد مسببات الأمراض الفيروسية والبكتيرية والفطرية، أو الطفيلية.

تاريخيا استخدمت للذيفان المورفولوجية شاشات الجينية إلى الأمام، على نطاق الجينوم الحمض النووي الريبي بوساطة التدخل ([رني]) فحص خطوط الخلية الحشرات، والقائمة من قبل سلالات ذبابة متحولة دراسة الحصانة الفطرية – مما يؤدي إلى تحديد وتوصيف لعدة مسارات مأمن خلطيه تقحم المصانة4،5،6،،من78. الاستجابة المناعية الفطرية خلطيه، يمكن القول، الأفضل وصف الدفاع المناعي في ذباب الفاكهة. في أعقاب الإصابة، يقود استجابة خلطيه لإنتاج وإطلاق النظمية للميكروبات الببتيد جزيئات (أمبير) في hemolymph، الدم يعادل في الحشرات. الامبير تنتجها حصيلة عالية المصانة و Imd إشارات المسارات. المسار حصيلة مثلى للثدييات TLR/إيل-1R مستقبلات الإشارات، ومسار Imd مثلى لإشارات الثدييات عامل نخر الورم-ألفا. في حصيلة المورفولوجية، مما يشير إلى فعل إيجابية البكتيريا والفطريات فيرو "س المورفولوجية"s6،،من910 وإشارات Imd هو الناجم عن بكتيريا سلبية الغرام11 ،12.

الحصانة الخلوية، تتألف من التغليف، وشكل الميلانين والبلعمه من مسببات الأمراض الغازية، التي تقوم بها خلايا الدم متخصصة تسمى هيموسيتيس13. وهناك ثلاث فئات من هيموسيتيس في ذبابة الفاكهة: كريستال الخلايا ولاميلوسيتيس وبلاسماتوسيتيس13. كريستال الخلايا، التي تشكل 5% هيموسيتيس المتداولة في يرقات، الإفراج عن الإنزيمات بروفينولوكسيداسي (قتراح) مما يؤدي إلى شكل الميلانين المسببة للأمراض والأنسجة المضيف في مواقع الجرح. لاميلوسيتيس، التي لا توجد عادة في أجنة صحية أو يرقات، هي ملتصقة الخلايا التي تغلف الكائنات الخارجية. فعل هذه الخلايا عند بوبارييشن، أو عندما يتم إيداع باراسيتيزينج دبور البيض في اليرقات. بلاسماتوسيتيس متجولة، التي تشكل 95% من تعميم هيموسيتيس في اليرقات وجميع هيموسيتيس المتبقية في البالغين، تلعب دوراً في الأنسجة يعيد البناء خلال التنمية، ولا سيما، بمثابة الخلية الرئيسية المستجيب المورفولوجية الخلوية الحصانة.

البلعمه خط فورية وحاسمة للدفاع المناعة الفطرية؛ الميكروبات التي خرق الحاجز الظهارية المضيفة هي غارقة بسرعة والقضاء على خلايا الدم متجولة (لإجراء استعراض شامل لبيولوجيا الخلايا البلعمه راجع مرجع 14). تبدأ هذه العملية عند التعرف على نمط germline ترميز مستقبلات (PRRs) على هيموسيتيس الاعتراف بالعوامل الممرضة المرتبطة أنماط الجزيئية (بامبس) للميكروبات. مرة ملتزمة بأهدافها، بدء برس الشلالات مما يشير إلى أن يؤدي إلى تشكيل بسيودوبودس من خلال إعادة عرض cytoskeleton أكتين. بسيودوبودس تحيط الميكروبات، والتي اجتاحت في وقت لاحق واستيعابه في عضية وليدة، يبلوع. وتدمر الميكروبات كما يبلوع يخضع لعملية نضج يبلوع عند يبلوع يتم الاتجار بهن نحو الداخلية من هيموسيتي وأسيديفيس من خلال سلسلة من التفاعلات مع ليسوسوميس. في المختبر والخلية كانت دراسات علم الأحياء في خلايا الثدييات الأولية دور فعال في تحديد ووصف العوامل التي تنظم البلعمه، مثل مستقبلات Fc-غاما الثدييات ومستقبلات C3b15،16. ومع ذلك، محدودة القدرة على تنفيذ الدراسات المجراة في الشاشات على نطاق واسع أو في نظم الثدييات.

نقدم هنا مقايسة المجراة في البلعمه في ذباب الفاكهة الكبار، الذي يرتكز على إجراء لأول مرة بمختبر ديفيد شنايدر في 200017. مختبر شنايدر أظهرت أن phagocytose لاطئة هيموسيتيس متفاوت المسافات على طول السفينة الظهرية البطن سهولة الخرز البوليسترين والبكتيريا. تصور البلعمه، يتم حقن الذباب بالجسيمات المسمى فلوريسسينتلي (مثل كولاي المسمى مع fluorescein isothiocyanate (كولاي-فيتك))، المحتضنة لمدة 30 دقيقة لإتاحة الوقت هيموسيتيس بابتلاع الجزيئات، ومن ثم حقن تريبان الأزرق، الذي يروي fluorescence الجسيمات لا فاجوسيتوسيد أثناء فترة الحضانة. يتم تصوير الأوعية الظهرية يطير ثم استخدام مجهر فلوري مقلوب. استخدام تجربة بسيطة نسبيا، أثبتت أن هيموسيتيس phagocytose البكتيريا ويمكن أن تحول دون مطاط الخرز، أن البلعمه البكتيريا بالحقن قبل الذباب هذه الورقة المنوي، مع الخرز مطاط، وأن الذباب دون الخلوية وخلطيه الاستجابات المناعية عرضه حتى كولاي. ويستند التحليل الوارد في هذا التقرير عمل المختبر شنايدر كمياً المجراة في البلعمه بقياس كثافة الجسيمات التي عصفت بالسفينة الظهرية المرتبطة هيموسيتيس الأسفار.

على غرار النهج المتبع في أنظمة الثدييات، الصفات المورفولوجية المستخدمة في البداية على نطاق الجينوم شاشات [رني] في المختبر لتحديد الجينات المطلوبة للاستجابة المناعية الخلوية18،19،20 ،21،،من2223. بيد أن وضع مقايسة البلعمه المجراة في الكبار مكن تجارب متابعة سيضطلع سهولة في الحيوانات كلها، مما يسمح للباحثين للتحقق من البيولوجية دور العوامل التي تم تحديدها في الدراسات في المختبر. وهذا هو الحال مع مستقبلات transmembrane أكلي لحوم البشر، التي حددت لأول مرة كمستقبل بكتيرية في شاشة [رني] استخدام S2 الخلايا24 وثم بعد ذلك سيظهر للتوسط في الإشريكيّة القولونية (كولاي)، البرازية فايكاليس، و المكوّرات العنقودية الذهبية (S. aureus) البلعمه في البالغين25.

لدينا مختبر يعمل الإنزيم البلعمه في المجراة في الشاشات الوراثية إلى الأمام والدراسات على نطاق الجينوم الرابطة (باستخدام لوحة إشارة المورفولوجية الوراثية (دجرب)) لتحديد الجينات الجديدة التي تنظم البلعمه في هيموسيتيس الكبار. أدت هذه الدراسات إلى الوصف مستقبلات بجرب-SC1A وبجرب-سا26، حويصلة داخل الخلايا الاتجار بالبروتين Rab1427غلوتامات الناقل بوليفيموس28، والجيش الملكي النيبالي ملزمة البروتين فوكس-129.

ونحن نتوقع أن الشاشات المستقبلية تتضمن البلعمه المجراة في يمكن أن يؤدي إلى تحديد الجينات الإضافية التي تعتبر مهمة للاستجابة المناعية الخلوية في المورفولوجية. شاشات باستخدام خطوط فطري متسلسلة تماما، مثل دجرب أو المورفولوجية الاصطناعية السكان الموارد (دسبر)، يمكن تحديد المتغيرات الطبيعية التي تؤثر على التنمية البلعمه أو هيموسيتي. وعلاوة على ذلك، يمكن اعتماد في الأنواع الأخرى من المورفولوجية التقنية أو المستخدمة في الشاشة الجديدة موارد المجتمع، مثل جمع 250 الأنواع المورفولوجية الاحتفاظ بالأنواع المورفولوجية الوطنية مخزون مركز (ندسك ) في كورنيل. هذه التجارب يمكن القيام بها باستخدام المسمى فلوريسسينتلي البكتيرية أو الفطرية الجدار بيوبارتيكليس متوفرة تجارياً أو يمكن أن يؤديها باستخدام أي عدد من الأنواع البكتيرية أو الفطرية – المقدمة أن الميكروب تعرب عن علامات نيون .

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1. إعداد جسيمات فلوريسسين للحقن

  1. إعادة تشكيل 10 مغ بكتيريا المتاحة تجارياً، قتلت الحرارة الجسيمات المسمى مع فلوريسسين (انظر الجدول للمواد) إلى تركز أسهم من 10 ملغ/مل بإضافة PBS العقيمة x 1 ميليلتر 990 و 10 ميليلتر 50 مم أزيد الصوديوم. دوامة المزيج.
    1. تقسيم إلى مختبرين ميليلتر 8 تستخدم مرة واحدة في أنابيب 0.2 مل وتخزينها في مربع الظلام عند 4 درجة مئوية لتقليل ضوء حساسية المرتبطة بها.
      ملاحظة: أزيد الصوديوم الحافظة هو اختياري ويمكن إهماله إذا تم إجراء مخزون 10 ملغ/مل مع PBS العقيمة 1 x 1 مل، الكوتيد، والمخزنة في-20 درجة مئوية.
  2. جعل حلاً 10 مل من الأغذية 5% التلوين في برنامج تلفزيوني 1 x بخلط 500 ميليلتر محقن تصفية المواد الغذائية الخضراء التلوين ومل 9.5 x 1 العقيمة برنامج تلفزيوني.
  3. أغسل الجسيمات قبل الحقن لإزالة أزيد الصوديوم. 42 مزيج ميليلتر العقيمة 1 x برنامج تلفزيوني وميليلتر 8 من 10 ملغ/مل في أنبوب 1.7 مل. الطرد المركزي في أقصى سرعة ل 2.5 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
    1. إزالة المادة طافية، إضافة 50 ميليلتر 1 x برنامج تلفزيوني، وأجهزة الطرد المركزي في أقصى سرعة ل 2.5 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
    2. كرر الخطوات من 1-3 و 1.3.1 x 2، ليصبح مجموع يغسل 3.
    3. وبعد الغسيل النهائي، تجاهل المادة طافية وإعادة تعليق الجسيمات إلى 1.6 ملغ/مل في 50 ميليلتر من الغذاء 5% التلوين في برنامج تلفزيوني 1 x.
    4. لف الأنبوب في رقائق الألومنيوم لحماية من الضوء. تخزين في 4 درجات مئوية، وتجاهل بعد أسبوع واحد.

2-إعداد محطة ضخ والذباب

  1. إعداد لوحة المفاتيح الحقن. لحقن تصل إلى لوح الأنماط الجينية 4 من الذباب في الوقت نفسه، استخدام مختبر الشريط لتقسيم ذبابة2 CO مستطيلة إلى أربعة أقسام. على مقاعد البدلاء قرب المجهر، تعين المناطق مكان في القنينات مرة واحدة وقد اصطف الذباب على لوحة المفاتيح (واحد لكل زاوية من لوحة المفاتيح).
  2. إعداد قنينة من العمر-المتطابقة، 4-7 أيام-الذباب القديمة، للحقن. لكل سلالة اختبارها، نقل 5 ذكور و 5 إناث في قنينة جديدة، المسمى من الطعام المعد يطير والإبقاء على 25 درجة مئوية.
  3. إعداد محقن هوائي (انظر الجدول للمواد) بإعداد الصك إلى وضع TIMED (رشقات نارية قصيرة من ضغط الغاز بطرد السائل – السماح بإيصال كميات sub-نانولتر) 100 مللي ثانية.
  4. إعداد شرائح المجهر. قص شرائط 1.5 بوصة من الشريط الكهربائي وإضعاف في حلقة مع الجانب لاصقة بها ومكان إلى شريحة مجهر مسمى.

3-إعداد الزجاج الإبر الشعرية

  1. سحب الزجاج الإبر (رقيقة الجدار الزجاج الشعيرات الدموية) باستخدام ساحبة إبرة.
    1. اضغط الإبرة تحت المجهر مع ميكرومتر وكسر تلميح استخدام #5 نقطة غرامة ملاقط الفولاذ المقاوم للصدأ. 100 ميكرومتر نصائح تكفي بيرس بشرة يطير مع التقليل من إصابة.
    2. قياس حجم السوائل التي سيتم ضخها في كل الطيران. تحميل الإبرة معقمة 5% الغذاء التلوين في برنامج تلفزيوني 1 x وطرد السائل على قطره زيت المعدني في ميكرومتر مرحلة 0.01 مم.
      ملاحظة: إذا الحبرية السائل كروي، يحسب وحدة التخزين في بيكوليتيرس (الحجم)3/1910. 30 سيتم إخراج إبرة قطرها 100 ميكرومتر ~ 2 nL 100 مللي ثانية.

4-حقن الذباب

  1. "الماصة؛" 10 ميليلتر من الجسيمات 1.6 ملغ/مل على مربع صغير من بارافيلم.
    1. سحب السائل في الإبرة وجبل في فوهة حاقن (انظر الجدول للمواد).
    2. تخدير الذباب مع CO2 وخط لهم في منطقتهم المعينة في فليباد، مع الجانب البطني الأعلى والرؤساء الموجهة نحو الجزء الأمامي من لوحة المفاتيح. ضع قارورة في المناطق المقابلة على مقاعد البدلاء.
    3. حقن الذباب في الزاوية العليا من البطن مع 5، 100 مللي مضخات السائل (~ 10 nL المجموع).
    4. نقل الذباب المحقون للقنينات المناسبة، ملاحظة الوقت في القنينة. تبقى عند 25 درجة مئوية.
  2. تحميل إبرة جديدة مع 0.4% "تريبان الأزرق الحل".
  3. تعيين حاقن تعمل بالهواء المضغوط إلى محكمة الإيداع، مما يتيح تدفق مستمر للهواء لدفع السائل من الإبرة.
  4. تخدير الذباب بعد أن كانوا قد استراح لمدة 30 دقيقة وحقن تريبان الأزرق حتى البطن كامل ومنتفخة.
    ملاحظة: عند دراسة النضج يبلوع مع الجسيمات المسمى بصبغة حساسة لدرجة الحموضة، السماح للذباب للراحة ح 1 ولا حقن تريبان الأزرق قبل تصاعد الذباب.
  5. جبل ذباب على شرائح المجهر مع الشريط الكهربائي، الجانب البطني لأسفل. دفع الأجنحة إلى جانب الطاير وتأمينها للشريط. أيضا، دفع بلطف الرأس إلى الشريط للتأكد من أنه لن يتحرك الطاير.
  6. الانتقال مباشرة إلى الخطوة 5.

5-تصوير الذباب

  1. صورة الذباب، واحدة في وقت واحد، وفي 25 x أو 32 x التكبير باستخدام مجهر مقلوب الأسفار تعلق على الكاميرا الرقمية والكمبيوتر (انظر الجدول للمواد). وتركز على السفينة الظهرية ذبابة باستخدام برامج الحاسوب للكاميرا الرقمية.
  2. تسجيل وقت التعرض والتكبير بين التجارب.
    ملاحظة: فقدان المسار للأنماط الجينية مصدر محتمل للخطأ عند تصوير سلالات متعددة في جلسة واحدة. لتجنب بكتيريا الذباب، دون ملاحظة عن عدد صورة فوتوغرافية يطير الأول والأخير لكل الوراثي.

6-التحديد الكمي، وتطبيع الأسفار

  1. افتح البرنامج وافتح صورة واحدة في كل مرة.
    1. قياس كثافة السفينة الظهرية الأسفار. رسم مضلع حول السفينة الظهرية. تحديد قياس وتسجيل كثافة الأسفار داخل المضلع.
    2. تحديد كثافة fluorescence الخلفية. نسخ المضلع الأول ونقله إلى منطقة مجاورة للسفينة الظهرية ذبابة. حدد قياس وكثافة fluorescence سجل المنطقة الخلفية.
    3. تطبيع fluorescence السفينة الظهرية بالأسفار الخلفية:
      سفينة الظهرية ÷ الخلفية.
    4. حساب المتوسط تطبيع السفينة الظهرية fluorescence كثافة الذباب جميع في سلالة.
    5. تكرار التجربة 2 مرات أكثر.
    6. استخدام طالب مزاوج تي-اختبار لمقارنة الكثافات fluorescence النسبية يعني الذباب مراقبة واختبار الذباب من التجارب الثلاث. حساب حجم تأثير استخدام الصيغة: كوهين د = (م1-M2) ÷ SDالمجمعة، حيث م1 متوسط التركيب الوراثي 1 وأم2 متوسط التركيب الوراثي 2 &
      التنمية المستدامة المجمعة =figure-protocol-1
      حيث SD1 هو الانحراف المعياري للنمط الوراثي 1 و SD2 هو الانحراف المعياري للنمط الوراثي 2.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

ويبين الشكل 1Aتخطيطي للمقايسة البلعمه المجراة باستخدام الجسيمات المسمى فلوريسسين. هي الذباب الجانب البطني المحملة إلى أسفل على قطعة من الشريط الكهربائية والجزء الأول والثاني من البطن، حيث يقع السفينة الظهرية، مرئية بوضوح (الشكل 1B). المصادر الرئيسية للخطأ التجريبي تنشأ في الحقن وتصوير خطوات الإجراء (الشكل 1). استخدام نفس الإبرة في حقن الذباب متعددة قد يؤدي إلى انسداد الأنسجة يطير أو جسيمات (اللوحة ال...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

تستخدم الجسيمات المتاحة تجارياً، والمسمى فلوريسسينتلي لتقييم البلعمه في العام (0.2 ميكرون تعديل كاربوكسيلات الجزئي المجالات الخرز الصغير) أو البلعمه للميكروبات (المسمى فلوريسسينتلي الحرارة-أو كيميائيا قتل البكتيريا أو الخميرة). تقييم نضج يبلوع، حدد الباحثون الجسيمات المسمى بصبغة حساسة لدرجة الحموضة فلوريسسيس عند درجة الحموضة يقلل من محايد إلى حمضية، كما هو الحال فاجوليسوسومي. بدلاً من ذلك، ينبغي اختيار الباحثين لدراسة الخطوات الأولية البلعمه، والاعتراف بالعوامل الممرضة وامتصاص، الجسيمات المسمى بواسطة العلاما...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

شكر وتقدير

يشكر المؤلفون غونزاليس بيت الدكتور والدكتور أبراجيتا جارج للدعم في إجراء التجارب المجراة في البلعمه. منحة البذور NSF الخفة مقدما والخفة المعاهد الوطنية للصحة T32 التدريب المنح والخلية و "البيولوجيا الجزيئية" (CMB) والتفاعلات المضيف الممرض (HPI)، بتمويل هذا العمل.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
0.2 & مو ; م أحمر الفلورسنت الكربوكسيل المعدل FluoSpheresInvitrogenF8810حبات اللاتكس ذات العلامات الفلورية لاختبار القدرة البلعمية العامة للخلايا البلعمة. (~ 580 / ~ 605 نانومتر) حقن 1:20 تخفيف في PBS مع صبغة 5٪.
5430-10 PicoNozzle KitPrecision Instruments5430-10حامل لماصة 1.0
مم < م > بكتريا قولونية (سلالة < / em >K-12) الجسيمات الحيوية ، Alexa Fluor 488 المترافقInvitrogenE13231Killed E. coli< / em> المسمى ب Alexa Fluor 488. يستخدم لاختبار التعرف على الخلايا البلعمية وامتصاص البكتيريا سالبة الجرام. (~ 495 / ~ 519 نانومتر)
الإشريكية القولونية (< / em>K-12 سلالة) الجسيمات الحيوية ، Alexa Fluor 594 المترافقInvitrogenE23370Killed E. القولوني< / em> المسمى ب Alexa Fluor 594. يستخدم لاختبار التعرف على الخلايا البلعمية وامتصاص البكتيريا سالبة الجرام. (~ 590 / ~ 617 نانومتر)
الإشريكية القولونية (< / em>K-12 سلالة) الجسيمات الحيوية ، الفلورسين المترافقInvitrogenE2861قتل الإشريكية القولونية< / em> المسمى FITC (الفلورسين). يستخدم لاختبار التعرف على الخلايا البلعمية وامتصاص البكتيريا سالبة الجرام. (~ 494 / ~ 518 نانومتر)
الإشريكية القولونية (< / em>K-12 سلالة) الجسيمات الحيوية ، تكساس الأحمر المترافقInvitrogenE2863قتل الإشريكية القولونية< / em> المسمى بتكساس الأحمر. يستخدم لاختبار التعرف على الخلايا البلعمية وامتصاص البكتيريا سالبة الجرام. (~ 595 / ~ 615 نانومتر)
الإشريكية القولونية (< / em>K-12 سلالة) الجسيمات الحيوية ، تكساس الأحمر المترافقInvitrogenE2863قتل الإشريكية القولونية< / em> المسمى بتكساس الأحمر. يستخدم لاختبار التعرف على الخلايا البلعمية وامتصاص البكتيريا سالبة الجرام. (~ 595 / ~ 615 نانومتر)
مجتذب ماصة إبرةديفيد كوبفموديل 725
فرودو أحمر < م > بكتريا قولونية < / em > الجسيمات الحيوية المترافقة للبلعمةInvitrogenP35361مقتول <م > الإشريكية القولونية < / م > المسمى باللون الأحمر الفرودو. يستخدم لاختبار استعادة الخلايا البلعمية ، وامتصاصها ، ونضج البلعمة للبكتيريا سالبة الجرام. (~ 560 / ~ 585 نانومتر). لا حاجة للإخماد باستخدام Trypan Blue.
pHrodo أحمر S. aureus < / em>BioParticles مترافق للبلعمةInvitrogenA10010قتل S. aureus< / em> المسمى باللون الأحمر. يستخدم لاختبار استعادة الخلايا البلعمية ، وامتصاصها ، ونضج البلعمة لبكتيريا الجرام المبوسيت. (~ 560 / ~ 585 نانومتر). لا حاجة للإخماد باستخدام Trypan Blue.
مضخة PicoPump الهوائية PV820العالمية للأدوات الدقيقةSYS-PV820تستخدم مضخة PicoPump الهوائية PV820 للأدوات الدقيقة العالمية ضغوطا تفاضلية لاحتفاظ السائل في الإبرة الزجاجية بين الحقن. يتحكم المستخدم يدويا في رشقات نارية قصيرة من ضغط الغاز لطرد السائل &ndash ؛ السماح بتسليم أحجام أقل من نانولتر. تعتمد كمية السائل التي يتم تسليمها على متغيرين رئيسيين &ndash. حجم فتحة الإبرة الزجاجية ومقدار الوقت الذي يتم فيه تطبيق ضغط الحقن. اضبط الأداة على 100 مللي ثانية " موقوت" طريقة.
S. aureus < / em> (سلالة الخشب بدون بروتين أ) الجسيمات الحيوية ، Alexa Fluor 488 المترافقInvitrogenS23371Killed S. aureus< / em> المسمى ب Alexa Fluor 488. يستخدم لاختبار التعرف على الخلايا البلعمية وامتصاص البكتيريا موجبة الجرام. (~ 495 / ~ 519 نانومتر)
S. aureus < / em> (سلالة الخشب بدون بروتين أ) الجسيمات الحيوية ، Alexa Fluor 594 المترافقInvitrogenS23372Killed S. aureus< / em> المسمى ب Alexa Fluor 594. يستخدم لاختبار التعرف على الخلايا البلعمية وامتصاص البكتيريا موجبة الجرام. (~ 590 / ~ 617 نانومتر)
S. aureus < / em> (سلالة الخشب بدون بروتين أ) الجسيمات الحيوية ، الفلورسين المترافقInvitrogenE2851قتل S. الذهبي< / em> المسمى ب FITC (الفلورسين). يستخدم لاختبار التعرف على الخلايا البلعمية وامتصاص البكتيريا موجبة الجرام. (~ 494 / ~ 518 نانومتر)
الشعيرات الدموية الزجاجية رقيقة الجدارالعالمية أدوات الدقةTW100F-3الإبر للحقن. OD = 1.0 مم
محلول تريبان بلو (0.4٪)SigmaT8154يستخدم لإخماد التألق خارج الخلية للجسيمات المسماة بالفلورسين أو Alexa Fluor أو Texas Red.
مجهر ZEISS SteREO (Discovery.V8)ZeissSteREO Discovery.V8مجهر مضان مقلوب لتصوير الذباب. استخدم كاميرا رقمية (على سبيل المثال: كاميرا AxioCam HC) والبرامج المصاحبة (على سبيل المثال: برنامج AxioVision 4.7) لالتقاط الصور.
Zymosan A (Saccharomyces cerevisiae< / em>) الجسيمات الحيوية ، Alexa Fluor 488 المترافقInvitrogenZ23373Killed المسمى ب Alexa Fluor 488. يستخدم لاختبار التعرف على البلعمة وامتصاص الخميرة. (~ 495 / ~ 519 نانومتر)
Zymosan A (Saccharomyces cerevisiae< / em>) الجسيمات الحيوية ، Alexa Fluor 594 المترافقInvitrogenZ23374Killed المسمى ب Alexa Fluor 594. يستخدم لاختبار التعرف على البلعمة وامتصاص الخميرة. (~ 590 / ~ 617 نانومتر)
Zymosan A (Saccharomyces cerevisiae< / em>) الجسيمات الحيوية ، الفلورسين المترافقInvitrogenZ2841مقتول بعلامة FITC (الفلورسين). يستخدم لاختبار التعرف على البلعمة وامتصاص الخميرة. (~ 494 / ~ 518 نانومتر)
Zymosan A (Saccharomyces cerevisiae< / em>) الجسيمات الحيوية ، تكساس الأحمرInvitrogenZ2843قتل المسمى باللون الأحمر تكساس. يستخدم لاختبار التعرف على البلعمة وامتصاص الخميرة. (~ 595 / ~ 615 نانومتر)
World

المراجع

  1. Akira, S., Uematsu, S., Takeuchi, O. Pathogen recognition and innate immunity. Cell. 124 (4), 783-801 (2006).
  2. Kim, D. Studying host-pathogen interactions and innate immunity in Caenorhabditis elegans. Disease Models & Mechanisms. 1 (4-5), 205-208 (2008).
  3. Lemaitre, B., Hoffmann, J. The host defense of Drosophila melanogaster. Annual Review Immunology. 25, 697-743 (2007).
  4. Wu, L. P., Choe, K. M., Lu, Y., Anderson, K. V. Drosophila Immunity: Genes on the Third Chromosome Required for the Response to Bacterial Infection. Genetics. 159 (1), 189-199 (2001).
  5. De Gregorio, E., Spellman, P. T., Tzou, P., Rubin, G. M., Lemaitre, B. The Toll and Imd pathways are the major regulators of the immune response in Drosophila. EMBO Journal. 21 (11), 2568-2579 (2002).
  6. Michel, T., Reichhart, J. M., Hoffmann, J. A., Royet, J. Drosophila Toll is activated by Gram-positive bacteria through a circulating peptidoglycan recognition protein. Nature. 414 (6865), 756-759 (2001).
  7. Choe, K. M., Werner, T., Stoven, S., Hultmark, D., Anderson, K. V. Requirement for a peptidoglycan recognition protein (PGRP) in Relish activation and antibacterial immune responses in Drosophila. Science. 296 (5566), 359-362 (2002).
  8. Wu, J., Randle, K. E., Wu, L. P. ird1 is a Vps15 homologue important for antibacterial immune responses in Drosophila. Cellular Microbiology. 9 (4), 1073-1085 (2007).
  9. Lemaitre, B., Nicolas, E., Michaut, L., Reichhart, J. M., Hoffmann, J. A. The dorsoventral regulatory gene cassette spatzle/Toll/cactus controls the potent antifungal response in Drosophila adults. Cell. 86 (6), 973-983 (1996).
  10. Zambon, R. A., Nandakumar, M., Vakharia, V. N., Wu, L. P. The Toll pathway is important for an antiviral response in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 102 (20), 7257-7262 (2005).
  11. Lemaitre, B., et al. A recessive mutation, immune deficiency (imd), defines two distinct control pathways in the Drosophila host defense. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 92 (21), 9465-9469 (1995).
  12. Leulier, F., Rodriguez, A., Khush, R. S., Abrams, J. M., Lemaitre, B. The Drosophila caspase Dredd is required to resist gram-negative bacterial infection. EMBO Reports. 1 (4), 353-358 (2000).
  13. Meister, M., Lagueux, M. Drosophilablood cells. Cellular Microbiology. 5 (9), 573-580 (2003).
  14. Flannagan, R. S., Jaumouille, V., Grinstein, S. The cell biology of phagocytosis. Annual Review Pathology. 7, 61-98 (2012).
  15. Anderson, R. A., Sando, G. N. Cloning and expression of cDNA encoding human lysosomal acid lipase/cholesteryl ester hydrolase. Similarities to gastric and lingual lipases. Journal of Biological Chemistry. 266 (33), 22479-22484 (1991).
  16. Ross, G. D., Reed, W., Dalzell, J. G., Becker, S. E., Hogg, N. Macrophage cytoskeleton association with CR3 and CR4 regulates receptor mobility and phagocytosis of iC3b-opsonized erythrocytes. Journal of Leukocyte Biology. 51 (2), 109-117 (1992).
  17. Elrod-Erickson, M., Mishra, S., Schneider, D. S. Interactions between the cellular and humoral immune responses in Drosophila. Current Biology. 10, 781-784 (2000).
  18. Ramet, M., Pearson, A. M., Manfruelli, P., Li, X., Koziel, H., Gobel, V. Drosophila Scavenger Receptor CI Is a Pattern Recognition Receptor for Bacteria. Immunity. 15 (6), 1027-1038 (2001).
  19. Ramet, M., Manfruelli, P., Pearson, A. M., Mathey-Prevot, B., Ezekowitz, R. A. Functional genomic analysis of phagocytosis and identification of a Drosophila receptor for E. coli. Nature. 416 (6881), 644-648 (2002).
  20. Philips, J. A., Rubin, E. J., Perrimon, N. Drosophila RNAi screen reveals CD36 family member required for mycobacterial infection. Science. 309, 1251-1253 (2005).
  21. Agaisse, H., Burrack, L. S., Philips, J. A., Rubin, E. J., Perrimon, N., Higgins, D. E. Genome-wide RNAi screen for host factors required for intracellular bacterial infection. Science. 309 (5738), 1248-1251 (2005).
  22. Stuart, L. M., et al. Response to Staphylococcus aureus requires CD36-mediated phagocytosis triggered by the COOH-terminal cytoplasmic domain. Journal of Cell Biology. 170 (3), 477-485 (2005).
  23. Stroschein-Stevenson, S. L., Foley, E., O’Farrell, P. H., Johnson, A. D. Identification of Drosophila gene products required for phagocytosis of Candida albicans. PLoS Biology. 4 (1), e4(2006).
  24. Kocks, C., et al. Eater, a transmembrane protein mediating phagocytosis of bacterial pathogens in Drosophila. Cell. 123 (2), 335-346 (2005).
  25. Nehme, N. T., et al. Relative roles of the cellular and humoral responses in the Drosophila host defense against three gram-positive bacterial infections. PLoS One. 6 (3), e14743(2011).
  26. Garver, L. S., Wu, J., Wu, L. P. The peptidoglycan recognition protein PGRP-SC1a is essential for Toll signaling and phagocytosis of Staphylococcus aureus in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 103 (3), 660-665 (2006).
  27. Garg, A., Wu, L. P. Drosophila Rab14 mediates phagocytosis in the immune response to Staphylococcus aureus. Cellular Microbiology. 16 (2), 296-310 (2014).
  28. Gonzalez, E. A., Garg, A., Tang, J., Nazario-Toole, A. E., Wu, L. P. A glutamate-dependent redox system in blood cells is integral for phagocytosis in Drosophila melanogaster. Current Biology. 23 (22), 2319-2324 (2013).
  29. Nazario-Toole, A. E., Robalino, J., Okrah, K., Corrada-Bravo, H., Mount, S. M., Wu, L. P. The Splicing Factor RNA-Binding Fox Protein 1 Mediates the Cellular Immune Response in Drosophila melanogaster. Journal of Immunology (Baltimore, Md: 1950). 201 (4), 1154-1164 (2018).
  30. Guille, M. Molecular Methods in Developmental Biology: Xenopus and Zebrafish. , Springer Science & Business Media. (1999).
  31. Koundakjian, E. J., Cowan, D. M., Hardy, R. W., Becker, A. H. The Zuker collection: a resource for the analysis of autosomal gene function in Drosophila melanogaster. Genetics. 167 (1), 203-206 (2004).
  32. Horn, L., Leips, J., Starz-Gaiano, M. Phagocytic ability declines with age in adult Drosophila hemocytes. Aging Cell. 13 (4), 719-728 (2014).
  33. Brennan, C. A., Delaney, J. R., Schneider, D. S., Anderson, K. V. Psidin is required in Drosophila blood cells for both phagocytic degradation and immune activation of the fat body. Current Biology. 17 (1), 67-72 (2007).
  34. Akbar, M. A., Tracy, C., Kahr, W. H., Kramer, H. The full-of-bacteria gene is required for phagosome maturation during immune defense in Drosophila. Journal of Cell Biology. 192 (3), 383-390 (2011).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة