يعرض هنا بروتوكول لقياس تكاثر خلايا CD4+ T استجابة للبروتينات المضادة للجينات أو الببتيدات باستخدام تخفيف الصبغة. هذا الفحص حساس بشكل خاص للخلايا T النادرة الخاصة بالمستضد ويمكن تعديله لتسهيل استنساخ الخلايا الخاصة بالمستضد.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
القياس الكمي لتكاثر CD4 - T الخاصة بمستضد الإنسانباستخدام Carboxyfluorescein Succinimidyl Ester
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
وصف هو بسيط، في المختبر، طريقة تعتمد على تخفيف الصبغة لقياس انتشار الخلايا CD4+ T الخاصة بالمستضد في الخلايا أحادية النووية للدم المحيطي البشري (PBMCs). تطوير مستقرة، غير سامة، والأصباغ الفلورية مثل carboxyfluorescein succinimidyl استر (CFSE) يسمح للخلايا T نادرة، مستضد محددة أن تكون متميزة عن المارة عن طريق التضاؤل في تلطيخ الفلورسنت، كما تم الكشف عن طريق قياس التدفق الخلوي. ولهذه الطريقة المزايا التالية على النُهج البديلة: '1' أنها حساسة جداً للخلايا T ذات التردد المنخفض، '2' لا حاجة إلى معرفة المستضد أو الظهارة، '3' يمكن تحليل النمط الظاهري للخلايا المستجيبة، و'4' قابلة للتطبيق، وتستجيب يمكن فرز الخلايا واستخدامها لمزيد من التحليل، مثل استنساخ الخلايا T.
المقدمة
القدرة على الكشف عن ودراسة الخلايا T مستضد محددة مهم في دراسات الحصانة الخلية بوساطة. ومع ذلك، فإن القيام بذلك يشكل تحدياً كبيراً لاستجابات CD4+ الخلايا T الخاصة بمستضد تلقائي، والتي هي ضعيفة جداً ويصعب الكشف عنها. وهناك طريقة شائعة تستخدم للكشف عن انتشار الخلايا الليمفاوية مستضد محدد هو [3H]-thymidine، وهو النيوكليوتيد المسمى لاسلكيا المدرجة في الحمض النووي للخلايا المتكاثرة. على الرغم من أن اختبار [3H]-thymidine يمكن الكشف عن تخليق الحمض النووي، وهذا الأسلوب هو مقياس غير مباشر لتقسيم الخلايا، لأن تخليق الحمض النووي يمكن أن تبدأ بشكل مستقل عن الانقسام الانقسام (أي، أثناء ازدواجية الجينات والمبرمج1). وتتفاقم هذه المسألة من حقيقة أن ا....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
وأعطى جميع الأشخاص موافقة مستنيرة قبل جمع الدم المحيطي. وقد منحت شركة سانت فنسنت هوسبيتال (HREC-A 135/08، وHREC-A 161/15) الموافقة الأخلاقية على التجارب التي تستخدم PBMC.
1. إعداد الكاشف
-
وسائل الإعلام خلية T الإنسان
- إعداد وسائل الإعلام RP-5 لزراعة PBMC، والذي يتكون من RPMI 1640، 1X الأحماض الأمينية غير الأساسية، L-ألانل-L-الجلوتامين ثنائي الببتيد (2 MM)، البنسلين (100 U/mL) / العقدية (0.1 ملغ / مل)، و 5٪ المصل البشري المجمعة (PHS).
-
حلول أسهم CFSE
- إعداد مخزون رئيسي عن طريق حل 25 ملغ من CFSE في ~ 9 مل من DMSO لتحقيق حل المخزون النهائي مع تركيز 5 MM. ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
التحفيز في المختبر من PBMCs البشرية مع بروتين توكسويد التيتانوس: كانت ملطخة PBMCs مع CFSE وحفز لمدة 7 أيام في وجود توكسويد التيتانوس. وأظهرت جميع الجهات المانحة تقريبا استجابة قوية من الخلايا T إلى توكسويد التيتانوس لأنها قد تم تطعيمها، مما يجعل توكسويد التيتانوس مستضد اقويد إيجابي مفيد للسيطرة. ويبين الشكل 2 في ثلاثة أضعاف، أن انتشار خلايا CD4+ T من مركبات ثنائي الفينيل متعدد البروم غير المحفزة كان ضئيلاً (حوالي 12 خليةخافتة من CFSE؛
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
الانتشار القائم على CFSE هو طريقة بسيطة وقوية للكشف عن وتعداد خلايا CD4+ T البشرية الخاصة بالمستضد. وقد ثبت سابقا أن استخدام التركيز الأمثل من CFSE أمر ضروري للحصول على أفضل النتائج4. فهناك الكثير من الـ CFSE يلغي الانتشار، في حين أن القليل جدا لا يسمح بتمييز الخلايا المقسمة وغير المقسمة. وعلى النقيض من ذلك، يتم استخدام تركيزات عالية نسبيا (5.0 درجة مئوية) من CFSE لتسمية خلايا Murine T النقية3. بسبب التباين بين الدفعات، فمن المستحسن أن يتم تصنيف كل دفعة لتحديد ال.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ويعلن صاحبا البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح.
شكر وتقدير
وقد تم دعم هذا العمل من قبل: مؤسسة أبحاث مرض السكري للأحداث (JDRF 5-CDA-2014-210-A-N] (S.M.). المجلس الوطني للصحة والبحوث الطبية (NHMRC GNT123586) (S. M.)، جائزة أبحاث السكري الأسترالية الاستئمانية للألفية (Y17M1-MANS) (S.M.)، برنامج دعم البنية التحتية التشغيلية للحكومة الفيكتورية (S.M., A.D., E. T., M.S.), وNHMRC منحة الدراسات العليا APP1094337 وJDRF منحة الدكتوراه في المتابعة (M.S.).
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| CD4-AlexaFluor647 | Biolegend | 317422 | RRID: AB_2716180 |
| كربوكسي فلوريسين إستر السكسينيميديل (CFSE)ThermoFisher | C1157 | ||
| Ficoll-Paque Plus | GE Healthcare | 71-7167-00 | |
| Glutamax (1x) | Gibco | 35050 | |
| Influenza A H1N1 (PR8) Matrix protein 1 Sino | Biological | 40010- V07E | |
| الأحماض الأمينية غير الأساسية (1x) | Gibco | 11140 | |
| البنسلين / الستربتومايسين (1x) | Gibco | 15070063 | |
| محلول ملحي مخزن الفوسفات (PBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| مصل بشري مجمع | الصليب الأحمر الأسترالي | N / A | |
| Proinsulin C-peptide PI33-63 | Purar Chemicals | N / A | مخصص صنع الببتيد الاصطناعي |
| RPMI 1640 | Sigma-Aldrich | R8758 | |
| البروتين ذيفان الكزاز | ستاتنز مصل Intitut | N / A |
المراجع
- Duque, A., Rakic, P. Different effects of BrdU and 3H-Thymidine incorporation into DNA on cell proliferation, position and fate. Journal of Neuroscience. 31, 15205-15217 (2011).
- Mannering, S. I., Zhong, J. I. E., Cheers, C.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
