Method Article

القياس الكمي لتكاثر CD4 - T الخاصة بمستضد الإنسانباستخدام Carboxyfluorescein Succinimidyl Ester

DOI:

10.3791/59545

⸱

June 4th, 2019

 ,  ,  , 
1Immunology and Diabetes Unit, St. Vincent's Institute of Medical Research, 2Department of Medicine, University of Melbourne, St. Vincent's Hospital

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعرض هنا بروتوكول لقياس تكاثر خلايا CD4+ T استجابة للبروتينات المضادة للجينات أو الببتيدات باستخدام تخفيف الصبغة. هذا الفحص حساس بشكل خاص للخلايا T النادرة الخاصة بالمستضد ويمكن تعديله لتسهيل استنساخ الخلايا الخاصة بالمستضد.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وصف هو بسيط، في المختبر، طريقة تعتمد على تخفيف الصبغة لقياس انتشار الخلايا CD4+ T الخاصة بالمستضد في الخلايا أحادية النووية للدم المحيطي البشري (PBMCs). تطوير مستقرة، غير سامة، والأصباغ الفلورية مثل carboxyfluorescein succinimidyl استر (CFSE) يسمح للخلايا T نادرة، مستضد محددة أن تكون متميزة عن المارة عن طريق التضاؤل في تلطيخ الفلورسنت، كما تم الكشف عن طريق قياس التدفق الخلوي. ولهذه الطريقة المزايا التالية على النُهج البديلة: '1' أنها حساسة جداً للخلايا T ذات التردد المنخفض، '2' لا حاجة إلى معرفة المستضد أو الظهارة، '3' يمكن تحليل النمط الظاهري للخلايا المستجيبة، و'4' قابلة للتطبيق، وتستجيب يمكن فرز الخلايا واستخدامها لمزيد من التحليل، مثل استنساخ الخلايا T.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

القدرة على الكشف عن ودراسة الخلايا T مستضد محددة مهم في دراسات الحصانة الخلية بوساطة. ومع ذلك، فإن القيام بذلك يشكل تحدياً كبيراً لاستجابات CD4+ الخلايا T الخاصة بمستضد تلقائي، والتي هي ضعيفة جداً ويصعب الكشف عنها. وهناك طريقة شائعة تستخدم للكشف عن انتشار الخلايا الليمفاوية مستضد محدد هو [3H]-thymidine، وهو النيوكليوتيد المسمى لاسلكيا المدرجة في الحمض النووي للخلايا المتكاثرة. على الرغم من أن اختبار [3H]-thymidine يمكن الكشف عن تخليق الحمض النووي، وهذا الأسلوب هو مقياس غير مباشر لتقسيم الخلايا، لأن تخليق الحمض النووي يمكن أن تبدأ بشكل مستقل عن الانقسام الانقسام (أي، أثناء ازدواجية الجينات والمبرمج1). وتتفاقم هذه المسألة من حقيقة أن ا....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وأعطى جميع الأشخاص موافقة مستنيرة قبل جمع الدم المحيطي. وقد منحت شركة سانت فنسنت هوسبيتال (HREC-A 135/08، وHREC-A 161/15) الموافقة الأخلاقية على التجارب التي تستخدم PBMC.

1. إعداد الكاشف

  1. وسائل الإعلام خلية T الإنسان
    1. إعداد وسائل الإعلام RP-5 لزراعة PBMC، والذي يتكون من RPMI 1640، 1X الأحماض الأمينية غير الأساسية، L-ألانل-L-الجلوتامين ثنائي الببتيد (2 MM)، البنسلين (100 U/mL) / العقدية (0.1 ملغ / مل)، و 5٪ المصل البشري المجمعة (PHS).
  2. حلول أسهم CFSE
    1. إعداد مخزون رئيسي عن طريق حل 25 ملغ من CFSE في ~ 9 مل من DMSO لتحقيق حل المخزون النهائي مع تركيز 5 MM.
      2. ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

التحفيز في المختبر من PBMCs البشرية مع بروتين توكسويد التيتانوس: كانت ملطخة PBMCs مع CFSE وحفز لمدة 7 أيام في وجود توكسويد التيتانوس. وأظهرت جميع الجهات المانحة تقريبا استجابة قوية من الخلايا T إلى توكسويد التيتانوس لأنها قد تم تطعيمها، مما يجعل توكسويد التيتانوس مستضد اقويد إيجابي مفيد للسيطرة. ويبين الشكل 2 في ثلاثة أضعاف، أن انتشار خلايا CD4+ T من مركبات ثنائي الفينيل متعدد البروم غير المحفزة كان ضئيلاً (حوالي 12 خليةخافتة من CFSE؛

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الانتشار القائم على CFSE هو طريقة بسيطة وقوية للكشف عن وتعداد خلايا CD4+ T البشرية الخاصة بالمستضد. وقد ثبت سابقا أن استخدام التركيز الأمثل من CFSE أمر ضروري للحصول على أفضل النتائج4. فهناك الكثير من الـ CFSE يلغي الانتشار، في حين أن القليل جدا لا يسمح بتمييز الخلايا المقسمة وغير المقسمة. وعلى النقيض من ذلك، يتم استخدام تركيزات عالية نسبيا (5.0 درجة مئوية) من CFSE لتسمية خلايا Murine T النقية3. بسبب التباين بين الدفعات، فمن المستحسن أن يتم تصنيف كل دفعة لتحديد ال.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويعلن صاحبا البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد تم دعم هذا العمل من قبل: مؤسسة أبحاث مرض السكري للأحداث (JDRF 5-CDA-2014-210-A-N] (S.M.). المجلس الوطني للصحة والبحوث الطبية (NHMRC GNT123586) (S. M.)، جائزة أبحاث السكري الأسترالية الاستئمانية للألفية (Y17M1-MANS) (S.M.)، برنامج دعم البنية التحتية التشغيلية للحكومة الفيكتورية (S.M., A.D., E. T., M.S.), وNHMRC منحة الدراسات العليا APP1094337 وJDRF منحة الدكتوراه في المتابعة (M.S.).

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
CD4-AlexaFluor647Biolegend317422RRID: AB_2716180
كربوكسي فلوريسين إستر السكسينيميديل (CFSE)ThermoFisherC1157
Ficoll-Paque PlusGE Healthcare71-7167-00
Glutamax (1x)Gibco35050
Influenza A H1N1 (PR8) Matrix protein 1 SinoBiological40010- V07E
الأحماض الأمينية غير الأساسية (1x)Gibco11140
البنسلين / الستربتومايسين (1x)Gibco15070063
محلول ملحي مخزن الفوسفات (PBS)Sigma-AldrichD8537
مصل بشري مجمعالصليب الأحمر الأستراليN / A
Proinsulin C-peptide PI33-63Purar ChemicalsN / Aمخصص صنع الببتيد الاصطناعي
RPMI 1640Sigma-AldrichR8758
البروتين ذيفان الكزازستاتنز مصل IntitutN / A

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Duque, A., Rakic, P. Different effects of BrdU and 3H-Thymidine incorporation into DNA on cell proliferation, position and fate. Journal of Neuroscience. 31, 15205-15217 (2011).
  2. Mannering, S. I., Zhong, J. I. E., Cheers, C.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

CD4 T CellsCFSE Proliferation AssayFlow Cytometry AnalysisPeripheral Blood Mononuclear CellsAntigen specific T CellsCell Division IndexFluorescent Dye DilutionT Cell CloningPropidium Iodide StainingDensity Gradient Centrifugation

Related Articles