Method Article

القياس الكمي لتكاثر CD4 - T الخاصة بمستضد الإنسانباستخدام Carboxyfluorescein Succinimidyl Ester

DOI:

10.3791/59545

⸱

June 4th, 2019

 ,  ,  , 
1Immunology and Diabetes Unit, St. Vincent's Institute of Medical Research, 2Department of Medicine, University of Melbourne, St. Vincent's Hospital

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعرض هنا بروتوكول لقياس تكاثر خلايا CD4+ T استجابة للبروتينات المضادة للجينات أو الببتيدات باستخدام تخفيف الصبغة. هذا الفحص حساس بشكل خاص للخلايا T النادرة الخاصة بالمستضد ويمكن تعديله لتسهيل استنساخ الخلايا الخاصة بالمستضد.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وصف هو بسيط، في المختبر، طريقة تعتمد على تخفيف الصبغة لقياس انتشار الخلايا CD4+ T الخاصة بالمستضد في الخلايا أحادية النووية للدم المحيطي البشري (PBMCs). تطوير مستقرة، غير سامة، والأصباغ الفلورية مثل carboxyfluorescein succinimidyl استر (CFSE) يسمح للخلايا T نادرة، مستضد محددة أن تكون متميزة عن المارة عن طريق التضاؤل في تلطيخ الفلورسنت، كما تم الكشف عن طريق قياس التدفق الخلوي. ولهذه الطريقة المزايا التالية على النُهج البديلة: '1' أنها حساسة جداً للخلايا T ذات التردد المنخفض، '2' لا حاجة إلى معرفة المستضد أو الظهارة، '3' يمكن تحليل النمط الظاهري للخلايا المستجيبة، و'4' قابلة للتطبيق، وتستجيب يمكن فرز الخلايا واستخدامها لمزيد من التحليل، مثل استنساخ الخلايا T.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

القدرة على الكشف عن ودراسة الخلايا T مستضد محددة مهم في دراسات الحصانة الخلية بوساطة. ومع ذلك، فإن القيام بذلك يشكل تحدياً كبيراً لاستجابات CD4+ الخلايا T الخاصة بمستضد تلقائي، والتي هي ضعيفة جداً ويصعب الكشف عنها. وهناك طريقة شائعة تستخدم للكشف عن انتشار الخلايا الليمفاوية مستضد محدد هو [3H]-thymidine، وهو النيوكليوتيد المسمى لاسلكيا المدرجة في الحمض النووي للخلايا المتكاثرة. على الرغم من أن اختبار [3H]-thymidine يمكن الكشف عن تخليق الحمض النووي، وهذا الأسلوب هو مقياس غير مباشر لتقسيم الخلايا، لأن تخليق الحمض النووي يمكن أن تبدأ بشكل مستقل عن الانقسام الانقسام (أي، أثناء ازدواجية الجينات والمبرمج1). وتتفاقم هذه المسألة من حقيقة أن انتشار الخلايا الخاصة بالمستضد يمكن أن يؤدي إلى وجود المبرمج ينوب شناطكبير ،مما يؤدي إلى احتمال المبالغة في تقدير الانتشار الخاص بالمستضد. وعلاوة على ذلك، فإن طريقة [3H]-thymidine لا توفر معلومات فينوتيبيك لتكاثر الخلايا الليمفاوية، مثل CD4+ أو CD8+ انتشار النسب في PBMCs حفز مع الببتيدات المضادة للجينات.

الببتيد-MHC تترامر تلطيخ هو وسيلة تستخدم على نطاق واسع للكشف عن واستنساخ CD8 المضادة محددة+ خلايا T. هذا هو أسلوب راسخة7،8،9،10؛ ومع ذلك، يتطلب الاستنساخ القائم على رباعي اتترار معرفة موجودة بتقييد الظهارة/MHC، ويتطلب كل epitope رباعي11الخاص به ، مما يحد من نطاق اكتشاف واستنساخ الخلايا T الجديدة الخاصة بالظعوت. يمكن استخدام الانتشار القائم على CFSE مع الببتيدات أو البروتينات أو الليسات الخلوية. البروتوكول الموضح هنا بسيط وقوي على حد سواء، ويمكن فرز الخلايا CD4+ T المستجيبة للاستخدام في المصب الاختبارات التوصيف الوظيفي والكيميائية الحيوية12،13.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وأعطى جميع الأشخاص موافقة مستنيرة قبل جمع الدم المحيطي. وقد منحت شركة سانت فنسنت هوسبيتال (HREC-A 135/08، وHREC-A 161/15) الموافقة الأخلاقية على التجارب التي تستخدم PBMC.

1. إعداد الكاشف

  1. وسائل الإعلام خلية T الإنسان
    1. إعداد وسائل الإعلام RP-5 لزراعة PBMC، والذي يتكون من RPMI 1640، 1X الأحماض الأمينية غير الأساسية، L-ألانل-L-الجلوتامين ثنائي الببتيد (2 MM)، البنسلين (100 U/mL) / العقدية (0.1 ملغ / مل)، و 5٪ المصل البشري المجمعة (PHS).
  2. حلول أسهم CFSE
    1. إعداد مخزون رئيسي عن طريق حل 25 ملغ من CFSE في ~ 9 مل من DMSO لتحقيق حل المخزون النهائي مع تركيز 5 MM.
    2. إعداد مخزون العمل عن طريق تخفيف المخزون الرئيسي في PBS لتحقيق تركيز العمل من 10 درجة مئوية.

2 - إعداد مركبات ثنائي الفينيل متعدد البروم البشرية من الدم كله

  1. هناك عموما ما بين 0.5-1.5 × 106 PBMCs / مل من الدم المحيطي البشري. ولذلك، فإن كمية الدم المطلوبة تعتمد على العدد المطلوب من مركبات ثنائي الفينيل متعدد البروم. فصل PBMCs عن طريق إضافة 15 مل من كثافة التدرج المتوسطة إلى أنبوب 50 مل، ثم تراكب 35 مل من الدم كله المخفف.
  2. الطرد المركزي في 850 × ز لمدة 15 دقيقة دون تباطؤ في درجة حرارة الغرفة (RT). وهذا سيؤدي إلى ثلاث طبقات واضحة: الطبقة السفلية التي تحتوي على بيليه خلايا الدم الحمراء، والطبقة الوسطى من كثافة التدرج المتوسطة مع خلايا الدم البيضاء بطانة واجهته العليا، وأعلى طبقة البلازما14.
  3. إزالة ما يقرب من 20 مل من طبقة البلازما العليا. جمع طبقة خلايا الدم البيضاء، والحرص على تجنب بيليه خلايا الدم الحمراء. غسل 3X مع PBS وعد الخلايا القابلة للحياة باستخدام استبعاد الأزرق trypan على مقياس الهيموكيتوماتومتر. تمييع إلى 1 × 106 PBMCs / مل في PBS.
  4. الخلايا غير الملطخة بـ CFSE
    1. وتستخدم هذه الخلايا كضوابط التعويض لتدفق قياس الخلايا، والتي تتألف من الخلايا غير ملطخة وCD4+ واحد ملطخة. إضافة 300 درجة مئوية من كل تعليق PBMC عينة التحكم إلى أنبوب 10 مل، أعلى مع PBS، والطرد المركزي في 550 × ز لمدة 5 دقائق في RT.
    2. إعادة تعليق 1 × 106 خلايا /مل في وسائط RP-5. احتضان هذه الخلايا غير المسماة لمدة 7 أيام في حاضنة CO2 37 درجة مئوية /5٪ مع الخلايا التي تحمل علامة CFSE (الخطوة 2.6.1).
  5. الخلايا الملطخة بـ CFSE
    1. نقل الخلايا من الخطوة 2.3 إلى أنبوب 50 مل. إضافة 1.0 درجة مئوية من CFSE حل الأسهم العاملة (10 درجة مئوية) لكل 1 مل من تعليق الخلية إلى جانب الأنبوب. يُمزج المزيج بسرعة عن طريق قلب الأنبوب عدة مرات. التركيز النهائي لـ CFSE هو 10 nM.
    2. حضانة لمدة 5 دقائق في حاضنة CO2 37 درجة مئوية / 5٪. لوقف تلطيخ، إضافة 5 مل من وسائل الإعلام RP-5، بيليه الخلايا عن طريق الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 550 × ز. إعادة تعليق PBMCs في 1 × 106/مل في وسائط RP-5.
    3. إضافة 1.0 مل من تعليق الخلية إلى أنبوب 10 مل. استخدام أنبوب واحد لكل مستضد ليتم اختبارها.
  6. التحفيز المضاد للجينات لمركبات ثنائي الفينيل متعدد البروم البشرية وثقافة الخلايا
    1. ثقافة الإنسان CFSE المسمى PBMCs مع مستضدات في وسائل الإعلام RP-5 لمدة 7 أيام في حاضنة CO2 37 درجة مئوية / 5٪. الثقافة 1 × 105 خلايا / جيدا (100 درجة مئوية) في لوحة 96 جيدا مع 100 درجة مئوية / جيدا من وسائل الإعلام RP-5 التي تحتوي على مستضد مخفف.
      ملاحظة: يرد في الجدول 1موجز للمستضدات المستخدمة، بما في ذلك تركيزات العمل.

3. مكافحة CD4 تلطيخ لتحليل FACS

  1. ماصة 200 ميكرولتر من الخلايا المستزرعة في أنابيب FACS، وغسل الخلايا 1X في 1.0 مل من PBS تحتوي على 0.1٪ FCS، والطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 550 × ز.
  2. وصمة عار مع المضادة للبشرية CD4 اليكسا فلور 647 (0.25 ملغ / مل) في 100 درجة مئوية من PBS / 0.1٪ FCS. يُحفظ جانباً عينة من الخلايا التي تحمل علامة CFSE، غير ملطخة بأي فلوروفور أخرى، لاستخدامها في تحديد تعويض CFSE FACS. حضانة الخلايا في 4 درجة مئوية محمية من الضوء لمدة 20 دقيقة.
  3. غسل الخلايا عن طريق إضافة 1 مل من PBS / 0.1٪ FCS، الطرد المركزي في 550 × ز لمدة 5 دقائق في RT، وإعادة تعليق في 100 ميكرولتر من PBS / 0.1٪ FCS. قبل تحليل FACS مباشرة، أضف 1 ميكرولتر من يوديد البربيديوم (PI، 0.1 ملغ/مل) إلى جميع الأنابيب للسماح باستبعاد الخلايا الميتة عن طريق قياس التدفق.

4. تدفق التكوين السيتومتري واستراتيجية Gating

ملاحظة: ويبين الشكل 1 تكوين نظام مراقبة الأصول الميدانية بما في ذلك ضوابط التعويض واستراتيجية التغرير.

  1. بوابة مبعثر إلى الأمام (FSC) مقابل الجانب مبعثر (SSC) (الشكل1A)السكان لتشمل جميع الخلايا الليمفاوية.
  2. بوابة FSC مقابل PI (الشكل1B)السكان على الخلايا السلبية PI لاستبعاد الخلايا المبرمج.
  3. استخدم الخلايا غير الملطخة لتعيين خط أساس الجهد للخلايا غير الفلورية. تعيين الفولتية لCD4-A647 وCFSE بحيث إشارة الفلورة أقل من 1000 لكل (الشكل1C). استخدام ضوابط لون واحد CFSE (الشكل1D)وCD4-A647 (الشكل1E)لتأكيد إشارات الفلورسنت الإيجابية (~ 10،000) لكل لون، وذلك باستخدام الفولتية تعيين مع الخلايا غير ملطخة.
  4. وللمركبات ذات الـ CFSE وPI بعض التداخل الطيفي؛ ضبط التعويض لطرح الفلورة PI من الفلورة CFSE حتى عينة CFSE فقط لا ينتج إشارة في قناة PI.
    ملاحظة: تم تطبيق هذه البوابات على جميع العينات التي تم تحليلها هنا.

5. حساب مؤشر تقسيم الخلية لتعداد CD4 مستضد محددة+ انتشار الخلايا T

ملاحظة: يشير مؤشر انقسام الخلايا (CDI) إلى عدد الخلايا المقسمة (CD4+/CFSEdim)لكل 5000 خلية غير مقسمة (CD4+/ CFSEمشرق). عندما يكون عدد الخلايا CD4+ غير المقسمة ليس بالضبط 5000، يتم تصحيح عدد الخلايا المقسمة للتعبير عن عدد الخلايا المقسمة لكل 5000 خلية غير مقسمة. على سبيل المثال، باستخدام انتشار توكسويد توكسويد محددة (الشكل2D)،كان هناك 4930 خلية غير مقسمة (CFSEمشرق)و 3268 خلية مقسمة (CFSEخافت)؛ ولذلك، فإن العدد المصحح للخلايا المقسمة هو (000 5/4930) x 268 3 = 304.3 3.

  1. حساب CDI(الجدول1) عن طريق تقسيم عدد الخلايا المقسمة/5000 خلية غير مقسمة من المجموعة المحفزة للمستضد حسب متوسط عدد الخلايا المقسمة (لكل 5000 خلية غير مقسمة) من الخلايا المستزرعة بدون مستضد (الجدول2).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

التحفيز في المختبر من PBMCs البشرية مع بروتين توكسويد التيتانوس: كانت ملطخة PBMCs مع CFSE وحفز لمدة 7 أيام في وجود توكسويد التيتانوس. وأظهرت جميع الجهات المانحة تقريبا استجابة قوية من الخلايا T إلى توكسويد التيتانوس لأنها قد تم تطعيمها، مما يجعل توكسويد التيتانوس مستضد اقويد إيجابي مفيد للسيطرة. ويبين الشكل 2 في ثلاثة أضعاف، أن انتشار خلايا CD4+ T من مركبات ثنائي الفينيل متعدد البروم غير المحفزة كان ضئيلاً (حوالي 12 خليةخافتة من CFSE؛

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الانتشار القائم على CFSE هو طريقة بسيطة وقوية للكشف عن وتعداد خلايا CD4+ T البشرية الخاصة بالمستضد. وقد ثبت سابقا أن استخدام التركيز الأمثل من CFSE أمر ضروري للحصول على أفضل النتائج4. فهناك الكثير من الـ CFSE يلغي الانتشار، في حين أن القليل جدا لا يسمح بتمييز الخلايا المقسمة وغير المقسمة. وعلى النقيض من ذلك، يتم استخدام تركيزات عالية نسبيا (5.0 درجة مئوية) من CFSE لتسمية خلايا Murine T النقية3. بسبب التباين بين الدفعات، فمن المستحسن أن يتم تصنيف كل دفعة لتحديد ال...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويعلن صاحبا البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد تم دعم هذا العمل من قبل: مؤسسة أبحاث مرض السكري للأحداث (JDRF 5-CDA-2014-210-A-N] (S.M.). المجلس الوطني للصحة والبحوث الطبية (NHMRC GNT123586) (S. M.)، جائزة أبحاث السكري الأسترالية الاستئمانية للألفية (Y17M1-MANS) (S.M.)، برنامج دعم البنية التحتية التشغيلية للحكومة الفيكتورية (S.M., A.D., E. T., M.S.), وNHMRC منحة الدراسات العليا APP1094337 وJDRF منحة الدكتوراه في المتابعة (M.S.).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
CD4-AlexaFluor647Biolegend317422RRID: AB_2716180
كربوكسي فلوريسين إستر السكسينيميديل (CFSE)ThermoFisherC1157
Ficoll-Paque PlusGE Healthcare71-7167-00
Glutamax (1x)Gibco35050
Influenza A H1N1 (PR8) Matrix protein 1 SinoBiological40010- V07E
الأحماض الأمينية غير الأساسية (1x)Gibco11140
البنسلين / الستربتومايسين (1x)Gibco15070063
محلول ملحي مخزن الفوسفات (PBS)Sigma-AldrichD8537
مصل بشري مجمعالصليب الأحمر الأستراليN / A
Proinsulin C-peptide PI33-63Purar ChemicalsN / Aمخصص صنع الببتيد الاصطناعي
RPMI 1640Sigma-AldrichR8758
البروتين ذيفان الكزازستاتنز مصل IntitutN / A

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Duque, A., Rakic, P. Different effects of BrdU and 3H-Thymidine incorporation into DNA on cell proliferation, position and fate. Journal of Neuroscience. 31, 15205-15217 (2011).
  2. Mannering, S. I., Zhong, J. I. E., Cheers, C. T-cell activation, proliferation and apoptosis in primary Listeria monocytogenes infection. Immunology. 106, 87-95 (2002).
  3. Lyons, A. B., Parish, C. R. Determination of lymphocyte division by flow cytometry. Journal of Immunological Methods. 171, 131-137 (1994).
  4. Mannering, S. I., et al. A sensitive method for detecting proliferation of rare autoantigen-specific human T cells. Journal of Immunological Methods. 283, 173-183 (2003).
  5. Quah, B. J. C., Parish, C. R. The Use of Carboxyfluorescein Diacetate Succinimidyl Ester (CFSE) to Monitor Lymphocyte Proliferation. Journal of Visualized Experiments. , 4-7 (2010).
  6. Ten Brinke, A., et al. Monitoring T-cell responses in translational studies: Optimization of dye-based proliferation assay for evaluation of antigen-specific responses. Frontiers in Immunology. 8, 1-15 (2017).
  7. Gillespie, G. M. A., et al. Strong TCR Conservation and Altered T Cell Cross-Reactivity Characterize a B*57-Restricted Immune Response in HIV-1 Infection. Journal of Immunolgy. 177, 3893-3902 (2006).
  8. Tynan, F. E., et al. High Resolution Structures of Highly Bulged Viral Epitopes Bound to Major Histocompatibility Complex Class I: Implications for t-cell receptor engagement and t-cell immunodominance. Journal of Biological Chemistry. 280, 23900-23909 (2005).
  9. Blanchard, N., et al. Endoplasmic reticulum aminopeptidase associated with antigen processing defines the composition and structure of MHC class I peptide repertoire in normal and virus-infected cells. Journal of Immunology. 184, 3033-3042 (2010).
  10. Glanville, J., et al. Identifying specificity groups in the T cell receptor repertoire repertoire. Nature. 547, 94-98 (2017).
  11. Wooldridge, L., et al. Tricks with tetramers: how to get the most from multimeric peptide MHC. Immunology. 126, 147-164 (2009).
  12. Mannering, S. I., et al. An efficient method for cloning human autoantigen-specific T cells. Journal of Immunological Methods. 298, 83-92 (2005).
  13. So, M., et al. Proinsulin C-peptide is an autoantigen in people with type 1 diabetes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115, (2018).
  14. Hui-Yuen, J., Mcallister, S., Koganti, S., Hill, E., Bhaduri-Mcintosh, S. Establishment of Epstein-Barr Virus Growth-transformed Lymphoblastoid Cell Lines. Journal of Visualized Experiments. , 2-7 (2011).
  15. Alexander-Miller, M. A., Leggatt, G. R., Berzofsky, J. A., Moss, B. Selective expansion of high or low avidity cytotoxic T lymphocytes and efficacy for adoptive immunotherapy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93, 4102-4107 (1996).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

CD4 T CellsCFSE Proliferation AssayFlow Cytometry AnalysisPeripheral Blood Mononuclear CellsAntigen specific T CellsCell Division IndexFluorescent Dye DilutionT Cell CloningPropidium Iodide StainingDensity Gradient Centrifugation

Related Articles