قمنا بنجاح بتحويل معيار التضخيم المكرر لبروتوكول التيتيمير (فخ) ليتم استخدامه في التفاعلات المتسلسلة الرقمية للبوليميريز. هذا الفحص الجديد ، ويسمي ddTRAP ، هو أكثر حساسية وكميه ، مما يسمح للكشف بشكل أفضل والتحليل الإحصائي للنشاط التيلوميراز داخل الخلايا البشرية المختلفة.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
المصيدة الرقمية الحبريه (ddTRAP): تكييف بروتوكول تضخيم التيتيمير المكرر إلى التفاعل المتسلسل الرقمي لسلسله البلمره
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
ان بروتوكول تضخيم التيلوميريه (فخ) هو الاختبار الأكثر استخداما للكشف عن نشاط التيتيلوراز داخل عينه معينه. يسمح الأسلوب القائم علي تفاعل البلمره المتسلسل (PCR) باجراء قياسات قويه لنشاط الانزيم من معظم الخلايا الخلوية. فخ القائم علي هلام مع فلوريسسينتلي المسمي الإشعال حدود الانتاجيه عينه ، والقدرة علي الكشف عن الاختلافات في عينات يقتصر علي اثنين اضعاف أو أكبر التغييرات في نشاط الانزيم. فخ الرقمية الحبريه, ddTRAP, هو نهج حساسة للغاية التي تم تعديلها من المقايسة فخ التقليدية, تمكين المستخدم من اجراء تحليل قوي علي 96 عينات لكل تشغيل والحصول علي التحديد الكمي المطلق للحمض النووي (التيلوميراز تمديد المنتجات ) المدخلات داخل كل PCR. ولذلك ، فان فحص ddTRAP المطور حديثا يتغلب علي القيود التي تفرضها المقايسة التقليدية القائمة علي الهلام ويوفر نهجا أكثر كفاءه ودقه وكميه لقياس نشاط التيلوميراز داخل المختبرات والإعدادات السريرية.
المقدمة
التيلوميرات هي مركبات حيوية من بروتين الحمض النووي في نهايات الكروموسومات الخطية. وتتكون التيلوميرات البشرية من مجموعه من 5 '-TTAGGGn هيكامريميك تكرار التي تختلف في الطول بين 12-15 كيلوبياسيس (kb) عند الولادة1. الإنسان التيلوميراز ، انزيم ريبونكليوبروتين الذي يحافظ علي التيلوميرات ، تم تحديده لأول مره في خليه هيلا (خط الخلايا السرطانية)2. معا ، تلعب التيلوميرات والتيلوميراز دورا رئيسيا في طيف من العمليات البيولوجية مثل حماية الجينوم ، وتنظيم الجينات ، وخلود الخلايا السرطانية3،4،5،6.<....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1. اعداد المخزن المؤقت والتخزين
- اعداد 50 mL من 1x الأوراق المالية RNase-/Dnase-rfree NP-40 تحلل العازلة (10 ملم تريس-HCl [pH 8.0] ، 1 مم MgCl2، 1 مم ايثيلنديدياتيتاتاتاستيك حمض (أدتا) ، 1 ٪ [المجلد/المجلد] NP-40 ، 10 ٪ [vol/vol] الجلسرين ، 150 Mm nacl ، 5 مم β-mercaptoethanol ، و 0.1 mm 4- هيدروكلوريد فلوريد بينزينيسولفونيل (AEBSF بنك). يمكن نقل هذه المخزن المؤقت وتخزينها في-20 درجه مئوية للاستخدام في المستقبل. تجنب دورات التجميد/الذوبان من أجل الحصول علي تحلل أمثل من الخلايا.
- اعداد 50 مل من 10x المخزون RNase-/Dnase-fan الحرة فخ الفاصل العازلة (200 mM تريس-HCl [pH 8.0] ، 15 مم MgCl2، 630 Mm kcl ، 0.5 ٪ [vol/vol] توين 20 ، و 10....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
باستخدام ddTRAP ، تم قياس نشاط التيلوميراز في لوحه خليه تتكون من خطوط الخلايا التالية (الشكل 1): سرطان الرئة غير الصغيرة للخلايا (H2882 ، H1299 ، Calu6 ، H920 ، A549 ، و H2887) ، وسرطان الرئة الخلوية الصغيرة (H82 و SHP77) ، والسلبية التيلوميراز الخلايا الليفية (BJ). 1,000,000 الكريات الخلية التي كانت في المخزن المؤقت NP-40 ، وأجريت تفاعلات تمديد التيلوميراز في ثلاثيات بيولوجية. عنصر التحكم السلبي الشائع والموصي به بشده هو "الاداره الانتقالية" ، عنصر التحكم بد.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
يعد قياس نشاط التيلوميراز أمرا حاسما بالنسبة لعدد كبير من المواضيع البحثية بما في ذلك ، علي الرغم من عدم الاقتصار علي ، السرطان ، والبيولوجيا التيلوميريه ، والشيخوخة ، والطب التجديدي ، وتصميم الادويه المستندة إلى البنية. التيلوميراز RNPs منخفضه الوفرة ، حتى في الخلايا السرطانية ، مما يجعل الكشف عن هذا الانزيم ودراسته أمرا صعبا. في هذه الورقة ، وصفنا الإجراءات خطوه بخطوه لفحص ddTRAP المطور حديثا لقياس نشاط التيلوميراز بقوة في الخلايا. من خلال الجمع بين تفاعل التيلوميراز التقليدي مع ddPCR ، تمكنا من الكشف الكمي عن نشاط الت.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
وليس لدي المؤلفين ما يفصحون عنه.
شكر وتقدير
ويود أصحاب البلاغ ان ينووا بمصادر التمويل من المعاهد الوطنية للصحة (R00-CA197672-01A1). كانت الخلايا الصغيرة لسرطان الرئة (SHP77 و H82) هديه سخية من المركز الطبي لجنوب غرب البلاد ، جون مينا وعدي غازدار.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| 1 م Tris-HCl درجة الحموضة 8.0 | أمبيون | AM9855G | RNAse / DNAse خالي |
| من 1 م MgCl2 | Ambion | AM9530G | RnAse / DNAse خالي |
| من 0.5 M EDTA درجة الحموضة 8.0 | Ambion | AM9261 | RNAse / DNAse خالي |
| من السطحي - أمبير NP-40 | Thermo Scientific | 28324 | |
| 100٪ جلسرين فائق النقاء | 15514011 | خالي من RNAse / DNAse | |
| فينيل ميثيل سلفونيل فلوريد | Thermo Scientific | 36978 | مسحوق |
| 2-Mercaptoethanol | SIGMA-ALDRICH | 516732 | |
| Nuclease Free H20 | Ambion | AM9932 | RNAse / DNAse خالي |
| من 2.5 ملي مولار dNTP مزيج | حراري علمي | R72501 | 2.5 ملي مولار من كل dATP و dCTP و dGTP و dTTP |
| 2 M KCl | Ambion | AM9640G | RNAse / DNAse مجاني |
| 100٪ توين -20 | فيشر | 9005-64-5 | |
| 0.5 م EGTA درجة الحموضة 8.0 | فيشر | 50-255-956 | RNAse / DNAse |
| خالية من التيلوميراز الركيزة (TS) برايمر | تقنية الحمض النووي المتكاملة المتكاملة (IDT) | التمهيدي المخصص (HPLC المنقى) | 5'- AATCCGTCGAGCAGAGTT-3'ACX |
| (عكس) برايمر | تقنية الحمض النووي المتكاملة (IDT) | التمهيدي المخصص (منقى HPLC) | 5 '- GCGCGGCTTACCCTTACCCTTACCCTAACC -3'أنابيب |
| رقيقة الجدران (250 ul) PCR الصف الولايات | المتحدة الأمريكية العلمية | 1402-2900 | شرائط وألواح وأنابيب إلخ. |
| QX200 ddPCR EvaGreen Supermix | Bio Rad | 1864034 | |
| Twin-Tec 96 Well Plate | Fisher | Eppendorf 951020362 | |
| Piercable foil foil | Rad | 1814040 | |
| Droplet Droplet cartedges (DG8) | Bio Rad | 1863008 | |
| Droplet Droplet مولد | Bio Rad | 1863005 | |
| Droplet حشية مولد | Bio Rad | 1863009 | |
| 96-well Thermocycler T100 | Bio Rad | 1861096 | |
| PX1 PCR Plate Sealer | Bio Rad | 1814000 | |
| QX200 Droplet Reader و Quantasoft Software | Bio Rad | 1864001 و 1864003 | |
| ddPCR Droplet Reader Oil | Bio Rad | 1863004 | |
| Nuclease Free Filtered Pipette Tips | Thermo Scientific | 10 ul و 20 ul و 200 ul و 1000 ul |
المراجع
- Frenck, R. W. Jr, Blackburn, E. H., Shannon, K. M. The rate of telomere sequence loss in human leukocytes varies with age. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (10), 5607-5610 (1998).
- Morin, G. B.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
