مقالة منهجية

المصيدة الرقمية الحبريه (ddTRAP): تكييف بروتوكول تضخيم التيتيمير المكرر إلى التفاعل المتسلسل الرقمي لسلسله البلمره

DOI:

10.3791/59550

⸱

مايو 3, 2019

 ,  , 
1School of Kinesiology, University of Michigan

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

قمنا بنجاح بتحويل معيار التضخيم المكرر لبروتوكول التيتيمير (فخ) ليتم استخدامه في التفاعلات المتسلسلة الرقمية للبوليميريز. هذا الفحص الجديد ، ويسمي ddTRAP ، هو أكثر حساسية وكميه ، مما يسمح للكشف بشكل أفضل والتحليل الإحصائي للنشاط التيلوميراز داخل الخلايا البشرية المختلفة.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ان بروتوكول تضخيم التيلوميريه (فخ) هو الاختبار الأكثر استخداما للكشف عن نشاط التيتيلوراز داخل عينه معينه. يسمح الأسلوب القائم علي تفاعل البلمره المتسلسل (PCR) باجراء قياسات قويه لنشاط الانزيم من معظم الخلايا الخلوية. فخ القائم علي هلام مع فلوريسسينتلي المسمي الإشعال حدود الانتاجيه عينه ، والقدرة علي الكشف عن الاختلافات في عينات يقتصر علي اثنين اضعاف أو أكبر التغييرات في نشاط الانزيم. فخ الرقمية الحبريه, ddTRAP, هو نهج حساسة للغاية التي تم تعديلها من المقايسة فخ التقليدية, تمكين المستخدم من اجراء تحليل قوي علي 96 عينات لكل تشغيل والحصول علي التحديد الكمي المطلق للحمض النووي (التيلوميراز تمديد المنتجات ) المدخلات داخل كل PCR. ولذلك ، فان فحص ddTRAP المطور حديثا يتغلب علي القيود التي تفرضها المقايسة التقليدية القائمة علي الهلام ويوفر نهجا أكثر كفاءه ودقه وكميه لقياس نشاط التيلوميراز داخل المختبرات والإعدادات السريرية.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

التيلوميرات هي مركبات حيوية من بروتين الحمض النووي في نهايات الكروموسومات الخطية. وتتكون التيلوميرات البشرية من مجموعه من 5 '-TTAGGGn هيكامريميك تكرار التي تختلف في الطول بين 12-15 كيلوبياسيس (kb) عند الولادة1. الإنسان التيلوميراز ، انزيم ريبونكليوبروتين الذي يحافظ علي التيلوميرات ، تم تحديده لأول مره في خليه هيلا (خط الخلايا السرطانية)2. معا ، تلعب التيلوميرات والتيلوميراز دورا رئيسيا في طيف من العمليات البيولوجية مثل حماية الجينوم ، وتنظيم الجينات ، وخلود الخلايا السرطانية3،4،5،6.

يتكون التيلوميراز البشري في المقام الأول من مكونين رئيسيين ، هما الناسخ العكسي التيلوميراز والحمض الريبي التيلوميراز (hTERT و Htert ، علي التوالي). الوحدة الفرعية للبروتين ، hTERT ، هي مكون الناسخ العكسي النشط المحفز لانزيم التيلوميراز. يوفر قالب RNA ، hTERC ، التيلوميراز مع القالب لتمديد و/أو الحفاظ علي التيلوميرات. معظم الانسجه الجسدية البشرية ليس لها نشاط قابل للكشف عن التيلوميراز. ان عدم قدره البوليميرات الحمض النووي علي تمديد نهاية الحبل المتخلف من الحمض النووي إلى جانب عدم وجود التيلوميراز يؤدي إلى التقصير التدريجي للوميرات بعد كل جولة من الانقسام الخلوي. وتؤدي هذه الظواهر إلى تقصير التيلوميريه في معظم الخلايا الجسدية حتى تصل إلى الطول المختصر للغاية ، حيث تدخل الخلايا حاله من الشيخوخة التكرارية. والعدد الأقصى من المرات خليه يمكن تقسيم تمليه طول التيتيمير وهذا كتله لاستمرار انقسام الخلايا ويعتقد لمنع التقدم إلى اونكوجينيسيس7. الخلايا السرطانية قادره علي التغلب علي الشيخوخة المستحثة التيلوميريه والاستمرار في التكاثر عن طريق استخدام التيتيلوراز للحفاظ علي التيلوميرات. وينشط حوالي 90% من السرطانات التيلوميراز ، مما يجعل نشاط التيلوميراز مهما للغاية في كل من الكشف عن السرطان وعلاجه.

وكان تطوير اختبار الفخ في التسعينات مفيدا في تحديد المكونات الضرورية لانزيم التيلوميراز ، فضلا عن قياس التيلوميراز في مجموعه واسعه من الخلايا والانسجه ، سواء كانت طبيعيه أو سرطانيه. الأصلي المستندة إلى هلام الفحص PCR تستخدم راديوب# نشاط المسمي ركائز الحمض النووي للكشف عن النشاط التيلوميراز. في 2006, تم تكييف الفحص في شكل غير مشع باستخدام فلوريسسينتلي المسمي ركائز8,9. باستخدام ركائز فلوريسسينتلي المسمية ، كان المستخدمون قادرين علي تصور منتجات تمديد التيلوميراز كعصابات علي هلام من خلال تعريضه لطول الموجه الاثاره الصحيحة. وقد جعلت حساسية الفحص فخ وقدرته علي الكشف عن النشاط التيلوميراز في الخلايا الخام لهذا الفحص الطريقة الأكثر استخداما للكشف عن النشاط التيلوميراز. ومع ذلك ، الفحص فخ له قيود. ويستند الفحص إلى الهلام ، مما يجعل من الصعب اجراء النسخ المتماثلة الضرورية في الدراسات المتوسطة إلى العالية الانتاجيه ، التالي ، نادرا ما يتحقق التحليل الإحصائي السليم. وعلاوة علي ذلك ، من الصعب تحديد الفحص القائم علي الهلام بشكل موثوق بسبب عدم قدره الكشف عن الاختلافات المزدوجة في نشاط التيلوميراز بين العينات. التغلب علي هذين القيدين أمر بالغ الاهميه لاختبارات النشاط الانزيمي مثل فخ للانتقال إلى الإعدادات السريرية أو الصناعية للكشف عن نشاط التيلوميراز في عينات المريض أو دراسات تصميم المخدرات.

تم تطوير PCR الرقمية في البداية في 1999 كوسيلة لتحويل الطبيعة الاسيه والتناظرية من PCR إلى الفحص الخطي والرقمي10. الحبريه الرقمية PCR (ddPCR) هو أحدث الابتكارات من منهجيه PCR الرقمية الاصليه. وجاءت القطرة الرقمية PCR مع ظهور ميكروفلويديكس المتقدمة والنفط في المياه مستحلب الكيمياء لتوليد موثوق بها قطرات مستقره والحجم علي قدم المساواة. علي عكس الهلام القائم وحتى PCR الكمي (qPCR) ، ddPCR يولد التحديد الكمي المطلق للمواد المدخلة. المفتاح إلى ddPCR هو توليد التفاعلات الفردية ~ 20,000 عن طريق تقسيم عينات إلى قطرات. بعد نقطه النهاية PCR ، يمسح القارئ القطيرات كل قطره في الأزياء التي تشبه التدفق المضخم للخلايا ، والعد ، والتحجيم ، وتسجيل وجود أو غياب الفلورية في كل قطره فرديه (اي غياب أو وجود الرموز المصغرة PCR في كل قطره). ثم ، باستخدام توزيع بواسون ، يتم تقدير جزيئات الإدخال استنادا إلى نسبه القطرات الموجبة إلى العدد الإجمالي للقطيرات. يمثل هذا الرقم تقديرا لعدد جزيئات الإدخال في كل PCR. وعلاوة علي ذلك ، يتم تنفيذ ddPCR وتحليلها علي لوحه 96 البئر الذي يسمح للمستخدم لتشغيل العديد من العينات ، فضلا عن أداء البيولوجية والتقنية والنسخ المتماثلة للتحليل الإحصائي السليم. ونتيجة لذلك ، فقد جمعنا بين القياس الكمي القوي والطبيعة المتوسطة الانتاجيه لddpcr مع مقايسة الفخ لتطوير الفحص الخاص ب Ddpcr11. تم تصميم هذا الفحص للمستخدمين لدراسة وتحديد كميه النشاط التيلوميراز المطلق من العينات البيولوجية11،12. وتسمح حساسية ddTRAP بالتحديد الكمي لنشاط التيلوميراز من العينات المحدودة والثمينة ، بما في ذلك قياسات الخلايا الواحدة. وعلاوة علي ذلك ، يمكن للمستخدمين أيضا دراسة اثار التلاعب التيلوميراز و/أو المخدرات مع التحديد الكمي المطلق لأقل من التغييرات مزدوجة (~ 50 ٪ الاختلافات). و ddTRAP هو التطور الطبيعي لفحص فخ في الطبيعة الرقمية والانتاجيه العالية من التجارب المختبرية الحديثة والإعدادات السريرية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. اعداد المخزن المؤقت والتخزين

  1. اعداد 50 mL من 1x الأوراق المالية RNase-/Dnase-rfree NP-40 تحلل العازلة (10 ملم تريس-HCl [pH 8.0] ، 1 مم MgCl2، 1 مم ايثيلنديدياتيتاتاتاستيك حمض (أدتا) ، 1 ٪ [المجلد/المجلد] NP-40 ، 10 ٪ [vol/vol] الجلسرين ، 150 Mm nacl ، 5 مم β-mercaptoethanol ، و 0.1 mm 4- هيدروكلوريد فلوريد بينزينيسولفونيل (AEBSF بنك). يمكن نقل هذه المخزن المؤقت وتخزينها في-20 درجه مئوية للاستخدام في المستقبل. تجنب دورات التجميد/الذوبان من أجل الحصول علي تحلل أمثل من الخلايا.
  2. اعداد 50 مل من 10x المخزون RNase-/Dnase-fan الحرة فخ الفاصل العازلة (200 mM تريس-HCl [pH 8.0] ، 15 مم MgCl2، 630 Mm kcl ، 0.5 ٪ [vol/vol] توين 20 ، و 10 ملم الاثيلين جلايكول-bis (β-امينوايثيل الأثير)-N ، N ، n ′ ، n′-رباعي حامض (egta)). هذا المخزن المؤقت يمكن ان اقتبس إلى 1 مل قسامات وتخزينها في-20 درجه مئوية للاستخدام في المستقبل.

2-التحلل الخلوية

  1. اعداد الخلايا
    1. ذوبان الجليد المجمدة من NP-40 تحلل العازلة. بمجرد أذابه ، ضع العازل التحلل علي الجليد. أضافه فلوريد فينيل ميثيل السلفونيل (مثبطات الانزيم البروتيني PMSF) إلى تحلل العازلة NP-40 للوصول إلى التركيز النهائي من 0.2 مم.
      ملاحظه: يجب ان يتم ذلك مباشره قبل ليسينج الخلايا.
    2. أزاله اي السائل الزائد من الكريات الخلية التي تم جمعها لضمان بيليه الخلية الجافة. لاحظ ان كريات الخلايا ، سواء الطازجة التي تم جمعها أو المجمدة سابقا (-80 درجه مئوية أو فلاش المجمدة في N2السائل) ، يجب ان لا تحتوي علي اي حلول متبقية من سينتريفوجيشنز السابقة لان هذه الحلول قد تتداخل مع الإجراءات المصب.
    3. قم بزراعه وجمع وتجميد كل من خطوط الخلايا الموجبة والسالبة التيلوميراز (BJ الليفية ، IMR-90 أو U2OS) من أجل استخدامها كعناصر تحكم ايجابيه وسلبيه. استخدام التحكم الجديدة لست] في كل مره يتم اجراء الفحص لضمان فحص استنساخ.
      ملاحظه: ينصح بزراعه ثقافة كبيره من خلايا التيلوميراز السالبة ونقلها قبل التجمد لأزاله اي قطع أثريه ذات صله بالانسجه التي قد يتم إدخالها خلال الثقافة طويلة الأمد لخطوط الخلايا للمساعدة في ضمان نتائج قابله للتكرار عينه التحكم السلبية.
    4. ضع كريات الخلايا علي الثلج. إذا كانت الخلايا المجمدة ، والسماح لهم بالذوبان لفتره وجيزة علي الجليد.
      ملاحظه: احجام الخلايا النموذجية بيليه ل ddTRAP بين 500,000 و 1,000,000 الخلايا. يمكن أيضا استخدام كريات الخلايا الأصغر إذا لزم الأمر ، ولكن يجب ان يكون رقم الخلية معروفا/مثاليا. ويمكن أيضا ان يتم تنفيذ ddTRAP استنادا إلى مدخلات البروتين باستخدام فحص بروتين BCA (الإدخال هو عاده 1 ميكروغرام).
  2. ليسينج من الخلايا
    1. Lyse الخلايا في المخزن المؤقت تحلل NP-40. الحفاظ علي تكافؤ خليه 25,000 خلايا/μL من المخزن المؤقت. علي سبيل المثال ، lyse بيليه (تحتوي علي خلايا 1,000,000) في 40 μL من NP-40 تحلل المخزن المؤقت. ماصه pipet-x بلطف لاعلي ولأسفل من أجل كسر فتح الخلايا. في محاولة لتجنب صنع فقاعات.
    2. السماح للخلايا إلى lyse علي الجليد لمده 30 دقيقه. تاكد من الدوامة بلطف محلله لمنع مجموعات من الحطام الخلية من تشكيل. وهذا يمكن ان يتم كل 10 دقيقه ، ويهدف إلى الحفاظ علي محلله خليط متجانس.
    3. تمييع الخلية محلله (25,000 خلايا/μl) 1:20 في NP-40 تحلل العازلة ، مما يجعل التكافؤ الخلية الجديدة 1,250 الخلايا/μl. علي سبيل المثال ، تمييع 5 μl من الخلية محلله إلى 95 μl من المخزن المؤقت تحلل.

3. رد فعل التمديد التيلوميراز

  1. اعداد مزيج رئيسي (الجدول 1) للتفاعل التمديد التيلوميراز (لكل رد فعل).
    ملاحظه: فمن الأفضل لاعداد التمديد رد فعل المزيج الرئيسي خلال تحلل الخلية وتخزينها علي الجليد.
    1. Pipet 48 μL من الامتداد الرئيسي مزيج في كل أنبوب PCR.
    2. أضافه 2 μl من المخفف (1,250 خلايا/μl) محلله إلى رد فعل التمديد. يجب ان يكون الحجم الإجمالي الآن 50 μL مع مكافئ الخلية النهائية من 50 خلايا/μL.
  2. قم باجراء تفاعل التمديد التيلوميراز (الجدول 2).
  3. تخزين منتجات تمديد التيلوميراز في 4 درجه مئوية لمده تصل إلى 3-5 أيام ؛ ومع ذلك ، فمن الأمثل لاستخدام المنتجات التمديد في غضون 24 ساعة الاولي.

4. قطره PCR الرقمية الاعداد

  1. اعداد مزيج رئيسي (الجدول 3) لل ddtrap (لكل رد فعل).
    ملاحظه: بمجرد الكواشف هي في درجه حرارة الغرفة ، لا تضع لهم أو المزيج الرئيسي علي الجليد. وضع المزيج علي الجليد قد يزيد من اللزوجة ويؤدي إلى تشكيل قطره الفقراء. البوليميرات الحمض النووي في المزيج الفائق ddPCR هو بداية ساخنه وينبغي ان تكون مستقره في درجه حرارة الغرفة. ويمكن تخزين المزيج الفائق من ddPCR عند درجه حرارة 4 درجات مئوية بعد الذوبان الاولي من-20 درجه مئوية.
    1. Pipet 19.8 μL من ddPCR ماستر مزيج في كل أنبوب PCR.
    2. أضافه 2.2 μL من رد الفعل التمديد لكل أنبوب. لاحظ انه يجب ان يكون إجمالي حجم الآن 22 μL.
      ملاحظه: المبلغ الإجمالي للعينه المطلوبة ل ddTRAP هو 20 μL (التكافؤ الخلية 100 الخلايا). حجم إضافي هو الاحتياط لخطا ماصه pipet-x أو فقدان العينة.
  2. قم باعداد خرطوشه توليد القطرات.
    ملاحظه: تحتوي الخرطوشة علي ثلاثه أعمده مختلفه من الآبار التي تمت تسميتها.
    1. تحميل 20 μL من رد فعل أعدت وفقا للخطوة 4.1.2 في عينه جيدا (بئر الأوسط) في خرطوشه. تجنب فقاعات عند الأنابيب العينة.
      ملاحظه: إذا كان هناك فقاعات ، انقر برفق علي جانب الخرطوشة بحيث تاتي هذه الفقاعات إلى الجزء العلوي من الحل.
    2. تحميل 70 μL من النفط الجيل القطيرات في بئر النفط (اليسار بشكل جيد).
      ملاحظه: من أجل تجنب التلوث ، استخدم بدقه مجموعه منفصلة من الماصات ونصائح لخطوات توليد القطرات ddPCR. ترتيب تحميل الخرطوشة مهم. يجب ان يتم تحميل العينة قبل تحميل النفط والنفط هو أثقل وسوف تملا الغرف ميكروفلويديك ويؤدي إلى تشكيل قطره الفقراء. الحد الأدنى لعدد العينات التي يمكن تشغيلها هو ثمانيه. يجب ان يتم تحميل جميع الآبار من خرطوشه مع العينة كما اي بئر فارغه سوف يؤدي إلى وقف في توليد القطيرات من مولد الحبريه. إذا لم تتوفر عينات كافيه لتحميل جميع الآبار الثمانية داخل خرطوشه ، يمكن تحميل 20 μL من المزيج الرئيسي ddTRAP (الخطوة 4.1) في الخراطيش المتبقية.
    3. تامين طوقا في المكان عن طريق الربط إلى نهايات خرطوشه.
      ملاحظه: الافتقار أو وضع غير لائق من طوقا سوف تمنع مولد من توليد قطرات.
    4. ضع الخرطوشة المحملة والمجمعة في مولد القطرة.
      ملاحظه: يتم التعرف علي خرطوشه من قبل المغناطيس في المولد ، والتي سوف تبلغ المستخدم عندما يتم وضع خرطوشه بشكل صحيح.
  3. قم بازاله الخرطوشة بمجرد ان يتم إنشاء القطرات وتكتمل الدورة (~ 60 – 90 ثانيه).
    1. قم بازاله الطوق برفق من الخرطوشة. Pipet القطرات المتولدة حديثا (الحق في البئر) ، وذلك باستخدام ماصه متعددة القناات ، إلى لوحه PCR 96 البئر.
      ملاحظه: يجب ان يكون الحجم التقريبي لمستحلب القطيرات الذي تم إنشاؤه حديثا 40 – 43 μL.
    2. الحرارة ختم لوحه مع رقائق ألومنيوم PCR لوحه الأختام مره واحده يتم تحميل جميع العينات في لوحه 96 البئر من أجل منع التبخر خلال الخطوات PCR.
  4. تحميل لوحه 96-بئر في ثيرموسيكلير وتنفيذ رد فعل PCR التالية (الجدول 4).
    ملاحظه: يجب تعيين جميع معدلات المنحدر بين درجات درجه الحرارة إلى 2.5 درجه مئوية/ثانيه من أجل تسخين ردود الفعل بشكل صحيح.

5. الكشف عن منتجات تمديد التيلوميراز

  1. تحميل لوحه 96 البئر في قارئ الحبريه.
    ملاحظه: تاكد من توجيه لوحه بشكل صحيح بحيث يطابق نموذج A1 مع ان الحامل.
    1. افتح البرنامج المقترن بقارئ القطرات. انقر نقرا مزدوجا فوق أول A1 جيدا لفتح شاشه محرر العينة/البئر.
    2. انقر علي التجربة وحدد ABS من القائمة المنسدلة.
      ملاحظه: تعرف التجربة نوع الفحص الذي سيتم استخدامه (اي التحديد الكمي المطلق أو فحص رقم النسخة الجينية). ABS لتقف علي التحديد الكمي المطلق.
    3. حدد QX200 ddPCR Evagreen Supermix لضمان استخدام طريقه الكشف الصحيحة من قبل القارئ. انقر فوق تطبيق في الجانب الأيسر السفلي من شاشه محرر البئر لحفظ الإعدادات المعرفة من قبل المستخدم لجميع الآبار المبرزة.
      ملاحظه: supermix يحدد نوع المزج PCR والكيمياء الكشف التي سيتم قراءتها من قبل القارئ.
    4. انقر علي الهدف في شاشه محرر البئر من البرنامج من أجل تحديد العينة.
    5. حدد نوع النموذج بالنقر فوق القائمة المنسدلة الهدف وتحديد اما غير معروفأو مرجعأو الاداره الانتقالية (لا يوجد قالب عنصر تحكم).
      ملاحظه: قد يشير المجهول إلى عينه تجريبية ، ويمكن ان يكون المرجع عينه تحكم من نشاط التيلوميراز المعروف ، والتقرير الانتقالي هو عنصر تحكم حاسم لتحديد صحة المقايسة من حيث التلوث و اشاره الخلفية.
    6. تسميه كافة العينات في المقطع اسم نموذج وانقر فوق تطبيق للتاكد من تحرير الآبار المبرزة بشكل مناسب.
  2. انقر فوق تشغيل لتشغيل/قراءه لوحه. حدد اما الاعمده أو الصفوف في شاشه خيارات التشغيل عند مطالبتك باعلام الجهاز حول الاتجاه الذي يجب قراءه اللوحة به.

6-تحليل البيانات

  1. تحديد عدد القطرات المقبولة لكل عينه من خلال النقر علي الآبار الفردية. انقر نقرا مزدوجا فوق الآبار الفردية أو رؤوس الاعمده/الصفوف لعرض بيانات العينة وتحليلها.
    ملاحظه: أهم المعايير المتعلقة بالمضي قدما في تحليل عينه معينه هي عدد "القطرات المقبولة". بالنسبة إلى ddTRAP ، فان العينات التي تحتوي علي 10,000 أو أكثر من القطرات المقبولة صالحه لمزيد من التحليل. يمكن توفير البيانات للمستخدم في العديد من الاشكال ، بما في ذلك الجدول .csv ، الصور jpg ، الرسوم البيانية ، الخ. هناك العديد من الموارد المتاحة للتحليل المتعمق لبيانات ddpcr ، بما في ذلك ddpcr11،13. تقدم هذه الموارد دليلا لتحليل بيانات ddtrap ، من تحديد عتبات11،13 لاختيار عينات لمزيد من التحليل11،13، وتحديد الإيجابيات الزائفة والسلبية13، و العامة استكشاف الأخطاء وإصلاحها13.
  2. تسليط الضوء علي الآبار التي تمثل نماذج متماثلة وعينات المجلس الانتقالي. تحليل العينات بالمقارنة اما بخطوط التحكم التابعة للمجلس الانتقالي أو السلبية ، مثل خلايا BJ (كما هو مذكور أعلاه في الخطوة 2-1-2).
    1. تعيين عتبه للعينات يدويا عن طريق النقر علي أيقونه لاعداد عتبات في الجزء السفلي الأيسر من الشاشة. تعيين عتبات لكل فرد بشكل جيد أو لآبار متعددة في كل مره (مستحسن).
      ملاحظه: إذا تم الكشف عن الخلفية في المجلس الانتقالي ، فانه يمكن طرحها من جميع العينات الأخرى إلى "تطبيع" الاشاره والتاكد من انه يتم تحليل الاشاره الايجابيه الحقيقية فقط. وعاده ما تكون قيم الجهاز الانتقالي في نطاق 0.2 – 1 جزيء/μL لنظام المخزن المؤقت تحلل 40. سيلزم اختبار النظم والمكونات الأخرى العازلة (علي سبيل المثال ، مخازن الفصول المؤقتة).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

باستخدام ddTRAP ، تم قياس نشاط التيلوميراز في لوحه خليه تتكون من خطوط الخلايا التالية (الشكل 1): سرطان الرئة غير الصغيرة للخلايا (H2882 ، H1299 ، Calu6 ، H920 ، A549 ، و H2887) ، وسرطان الرئة الخلوية الصغيرة (H82 و SHP77) ، والسلبية التيلوميراز الخلايا الليفية (BJ). 1,000,000 الكريات الخلية التي كانت في المخزن المؤقت NP-40 ، وأجريت تفاعلات تمديد التيلوميراز في ثلاثيات بيولوجية. عنصر التحكم السلبي الشائع والموصي به بشده هو "الاداره الانتقالية" ، عنصر التحكم بد...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعد قياس نشاط التيلوميراز أمرا حاسما بالنسبة لعدد كبير من المواضيع البحثية بما في ذلك ، علي الرغم من عدم الاقتصار علي ، السرطان ، والبيولوجيا التيلوميريه ، والشيخوخة ، والطب التجديدي ، وتصميم الادويه المستندة إلى البنية. التيلوميراز RNPs منخفضه الوفرة ، حتى في الخلايا السرطانية ، مما يجعل الكشف عن هذا الانزيم ودراسته أمرا صعبا. في هذه الورقة ، وصفنا الإجراءات خطوه بخطوه لفحص ddTRAP المطور حديثا لقياس نشاط التيلوميراز بقوة في الخلايا. من خلال الجمع بين تفاعل التيلوميراز التقليدي مع ddPCR ، تمكنا من الكشف الكمي عن نشاط الت...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وليس لدي المؤلفين ما يفصحون عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويود أصحاب البلاغ ان ينووا بمصادر التمويل من المعاهد الوطنية للصحة (R00-CA197672-01A1). كانت الخلايا الصغيرة لسرطان الرئة (SHP77 و H82) هديه سخية من المركز الطبي لجنوب غرب البلاد ، جون مينا وعدي غازدار.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
1 م Tris-HCl درجة الحموضة 8.0أمبيونAM9855GRNAse / DNAse خالي
من 1 م MgCl2AmbionAM9530GRnAse / DNAse خالي
من 0.5 M EDTA درجة الحموضة 8.0AmbionAM9261RNAse / DNAse خالي
من السطحي - أمبير NP-40Thermo Scientific28324
100٪ جلسرين فائق النقاء15514011خالي من RNAse / DNAse
فينيل ميثيل سلفونيل فلوريدThermo Scientific36978مسحوق
2-MercaptoethanolSIGMA-ALDRICH516732
Nuclease Free H20AmbionAM9932RNAse / DNAse خالي
من 2.5 ملي مولار dNTP مزيجحراري علميR725012.5 ملي مولار من كل dATP و dCTP و dGTP و dTTP
2 M KClAmbionAM9640GRNAse / DNAse مجاني
100٪ توين -20فيشر9005-64-5
0.5 م EGTA درجة الحموضة 8.0فيشر50-255-956RNAse / DNAse
خالية من التيلوميراز الركيزة (TS) برايمرتقنية الحمض النووي المتكاملة المتكاملة (IDT)التمهيدي المخصص (HPLC المنقى)5'- AATCCGTCGAGCAGAGTT-3'ACX
(عكس) برايمرتقنية الحمض النووي المتكاملة (IDT)التمهيدي المخصص (منقى HPLC)5 '- GCGCGGCTTACCCTTACCCTTACCCTAACC -3'أنابيب
رقيقة الجدران (250 ul) PCR الصف الولاياتالمتحدة الأمريكية العلمية1402-2900شرائط وألواح وأنابيب إلخ.
QX200 ddPCR EvaGreen SupermixBio Rad1864034
Twin-Tec 96 Well PlateFisherEppendorf 951020362
Piercable foil foilRad1814040
Droplet Droplet cartedges (DG8)Bio Rad1863008
Droplet Droplet مولدBio Rad1863005
Droplet حشية مولدBio Rad1863009
96-well Thermocycler T100Bio Rad1861096
PX1 PCR Plate SealerBio Rad1814000
QX200 Droplet Reader و Quantasoft SoftwareBio Rad1864001 و 1864003
ddPCR Droplet Reader OilBio Rad1863004
Nuclease Free Filtered Pipette TipsThermo Scientific10 ul و 20 ul و 200 ul و 1000 ul
seal Bio الزيت

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Frenck, R. W. Jr, Blackburn, E. H., Shannon, K. M. The rate of telomere sequence loss in human leukocytes varies with age. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (10), 5607-5610 (1998).
  2. Morin, G. B. The human telomere terminal transferase enzyme is a ribonucleoprotein that synthesizes TTAGGG repeats. Cell. 59 (3), 521-529 (1989).
  3. de Lange, T. How telomeres solve the end-protection problem. Science. 326 (5955), 948-952 (2009).
  4. Shay, J. W., Wright, W. E. Role of telomeres and telomerase in cancer. Seminars in Cancer Biology. 21 (6), 349-353 (2011).
  5. Kim, W., Shay, J. W. Long-range telomere regulation of gene expression: Telomere looping and telomere position effect over long distances (TPE-OLD). Differentiation. 99, 1-9 (2018).
  6. Robin, J. D., et al. Telomere position effect: regulation of gene expression with progressive telomere shortening over long distances. Genes Development. 28 (22), 2464-2476 (2014).
  7. Shay, J. W., Wright, W. E. Senescence and immortalization: role of telomeres and telomerase. Carcinogenesis. 26 (5), 867-874 (2005).
  8. Norton, J. C., Holt, S. E., Wright, W. E., Shay, J. W. Enhanced detection of human telomerase activity. DNA Cell Biology. 17 (3), 217-219 (1998).
  9. Herbert, B. S., Hochreiter, A. E., Wright, W. E., Shay, J. W. Nonradioactive detection of telomerase activity using the telomeric repeat amplification protocol. Nature Protocols. 1 (3), 1583-1590 (2006).
  10. Vogelstein, B., Kinzler, K. W. Digital PCR. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (16), 9236-9241 (1999).
  11. Ludlow, A. T., et al. Quantitative telomerase enzyme activity determination using droplet digital PCR with single cell resolution. Nucleic Acids Research. 42 (13), e104(2014).
  12. Huang, E. E., et al. The Maintenance of Telomere Length in CD28+ T Cells During T Lymphocyte Stimulation. Scientific Reports. 7 (1), 6785(2017).
  13. Ludlow, A. T., Shelton, D., Wright, W. E., Shay, J. W. ddTRAP: A Method for Sensitive and Precise Quantification of Telomerase Activity. Methods Molecular Biology. 1768, 513-529 (2018).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

NP 40 PMSF QX200 ddPCR EvaGreen

مقالات ذات صلة