مقالة منهجية

عزل وتنقية البيريكيتالقلبي ة المورين

11.6K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/59571

⸱

أغسطس 16, 2019

 ,  , 
1Department of Cardiometabolic Disorders, Amgen Research and Discovery, Amgen Inc., 2Department of Translational Sciences, Amgen Research and Discovery, Amgen Inc.

في هذه المقالة

ملخص

لقد قمنا بتحسين بروتوكول لعزل وتنقية البيريسيتات القلبية للمورين للبحث والتحقيق الأساسي في البيولوجيا والإمكانات العلاجية.

الملخص

ومن المعروف أن البيريسيس، والخلايا المحيطة بالأوعية الدموية من الأوعية الدقيقة والشعيرات الدموية، تلعب دورا في تكوين الأوعية الدموية، وتثبيت الأوعية، وسلامة الحاجز البطانية. ومع ذلك، وظائفها الخاصة بالأنسجة في القلب ليست مفهومة جيدا. وعلاوة على ذلك، لا يوجد حاليا أي بروتوكول يستخدم مواد يسهل الوصول إليها لعزل وتنقية البيريسيتات ذات المنشأ القلبي. يركز بروتوكولنا على استخدام نموذج الثدييات المستخدم على نطاق واسع، الماوس، كمصدر للخلايا. باستخدام الهضم الأنزيمي والتفكك الميكانيكي لأنسجة القلب، حصلنا على خليط الخلايا الخام التي تم تنقيتها بشكل أكبر عن طريق تنشيط الفلورة فرز الخلايا (FACS) من قبل عدد كبير من العلامات. لأنه لا يوجد علامة واحدة لا لبس فيها لpericytes، ونحن مسور للخلايا التي كانت CD31-CD34-CD45-CD140b+NG2+CD146+ . بعد التنقية، تم زراعة هذه الخلايا الأولية ومرورها عدة مرات دون أي تغييرات في المورفولوجيا والتعبير علامة. مع القدرة على الحصول بانتظام على pericytes القلب المورين الأولية باستخدام بروتوكولنا، ونأمل في مزيد من فهم دور pericytes في علم وظائف الأعضاء القلب والأوعية الدموية وإمكاناتها العلاجية.

المقدمة

تحيط الخلايا المحيطة بالأوعية الدموية المعروفة باسم pericytes بالسفن الدقيقة والشعيرات الدموية لشجرة الأوعية الدموية1،2. من الناحية الفسيولوجية، ومن المعروف أنها تعزز وتلعب دورا في تكوين الأوعية الدموية، وزيادة سلامة الحاجز بسبب علاقتها الوثيقة مع الخلايا البطانية، فضلا عن استقرار ونضج الأوعية1،2. وعلاوة على ذلك، فإن الخلل و / أو فقدان هذه الخلاياقد تورطت في أمراض مثل مرض الزهايمر 2،3 وأمراض القلب والأوعية الدموية المختلفة4. توجد هذه الخلايا في جميع أنحاء الجسم بأكمله، ولكن أرقام الخلايا تعتمد على الأنسجة. وقد درست Pericytes أبرزها في الدماغ بسبب ارتفاع الأوعية الدموية من حاجز الدم في الدماغ1،2. ومع ذلك، في القلب، يتم دراسة بيولوجيا البيريكيت بشكل ناقص.

في الآونة الأخيرة، هناك مصالح متزايدة في هذا المجال لpericytes القلب، ولكن لا يوجد حاليا بروتوكول مبسط المتاحة لعزلها عن واحدة من الأدوات الأكثر استخداما في علم الأحياء - الماوس. هناك بروتوكولات في الأدب على عزل pericytes من الدماغ5, شبكية العين6, المشيمة7, والعضلات الهيكلية8,9; ومع ذلك، هناك عدد قليل من البروتوكولات على عزل pericytes من القلب. هناك العديد من المجموعات التي عزلت pericytes القلب. وقد تمكن نيس وآخرون من عزل كمية وفيرة من البيريسيتات القلبية عن أنواع متعددة بما في ذلك الفأر؛ ومع ذلك، فإن أساليبها تستخدم معدات محددة في المنزل بنيت مما يقلل من استنساخ10. Avolio et al.11,Chen et al.12,and Baily et al.13 successfullyy ayytes من أنسجة القلب البشرية, ولكن الأنسجة البشرية ليست دائما متاحة ويصعب الحصول عليها لبعض المحققين. هنا، قمنا بتطوير طريقة العزل للحصول على pericytes القلب من نماذج الماوس للمحققين لمواصلة دراسة البيولوجيا مع المواد المتاحة بسهولة.

باستخدام الهضم الأنزيمي والفلورة تنشيط فرز الخلايا (FACS) مع علامات البيريكيت الرئيسية المعروفة14، يسمح لنا بروتوكولنا بعزل وتنقية مجموعة من البيريكيت التي تتميز CD31-CD34-CD45- CD140b+NG2+CD146+. تحتوي لوحة علاماتنا على علامات التضمين والاستبعاد على حد سواء. يستخدم CD45 كعلامة لاستبعاد خلايا المكونة للدم. يتم استخدام CD31 كعلامة لاستبعاد الخلايا البطانية. يستخدم CD34 كعلامة لاستبعاد كل من خلايا التبويائية وبطانة الرحم. CD146 هو علامة للخلايا المحيطة بالأوعية الدموية. وأخيرا، NG2 وCD140b (المعروف أيضا باسم الصفائح الدموية المستمدة مستقبلات عامل النمو بيتا - PDGFRβ) هي علامات مقبولة على حد سواء لpericytes14. يمكن أن تكون الثقافة الأساسية التي تم الحصول عليها مستوّلة ومرورها عدة مرات دون أي تغييرات في المورفولوجيا أو تعبير العلامة. وعلاوة على ذلك، يمكن أن تكون هذه الخلايا مشتركة مع الخلايا البطانية لدراسة تفاعلاتها والكلام المتبادل مع بعضها البعض. هذه الطريقة عزل الخلية سوف تسمح للمحققين لدراسة البيولوجيا والفيزيولوجيا المرضية من pericytes القلب من نوع البرية, المرض, ونماذج الماوس متغير وراثيا.

البروتوكول

تم إيواء جميع الحيوانات واستخدامها في منشأة معتمدة من قبل جمعية تقييم واعتماد العناية بالحيوانات المختبرية (AAALAC) وتم إجراء جميع الأعمال الحيوانية تحت إشراف بيطري مناسب وتحت إشراف مؤسسي وافقت لجنة الرعاية والاستخدام (IACUC) بروتوكول شركة Amgen Inc.

1. إعداد الأدوات ووسائل الإعلام الثقافية

  1. الأوتوكلاف الجراحية 9 سم على التوالي طرف مقص نقطة غرامة و 10 سم بزاوية ملقط مسننة.
  2. إضافة 25 مل من 5٪ مصل البقر الجنيني (FBS) و 5 مل من 1٪ البنسلين العقديات (P / S) في زجاجة 500 مل من الكالسيوم المغنيسيوم خالية من دولبكو الفوسفات المخزنة المالحة (CMF-DPBS). وضع الحل في حمام الجليد لضمان أنها سوف تكون باردة في وقت الاستخدام. Aliquot 50 مل في أنبوب مخروطي 50 مل لعزل القلب. إضافة في 250 وحدة / مل من محلول الصوديوم الهيبارين في aliquot 50 مل. وسوف يشار إلى ذلك باسم CMF-DPBS heparinized.
  3. إضافة 20٪ FBS (100 مل) و 1٪ P / S (5 مل) في زجاجة 500 مل من ارتفاع الجلوكوز Dulbecco في المتوسط النسر المعدلة (DMEM). وسوف يشار إلى هذا باسم وسائل الإعلام ثقافة خالية من الإنزيم. Aliquot 20 مل من DMEM + 20٪ FBS + 1٪ P / S وإضافة في 500 ميكروغرام / مل من الكولاجين B. وسوف يشار إلى هذا كحل الإنزيم. حافظ على كل من وسائل الإعلام الثقافية الخالية من الإنزيمات وحل الإنزيمات دافئين عند درجة حرارة 37 درجة مئوية في حاضنة أو حمام مائي.

2. إعداد الحيوان وشراء أنسجة القلب

  1. حقن داخل الصفاع الماوس مع 250 وحدة من محلول الصوديوم الهيبارين مع حقنة إبرة 31 G. ثم انتظر 10-15 دقيقة بينما يبقى الماوس نشطاً في قفصه المنزلي.
    ملاحظة: تم الحصول على البيانات التمثيلية في هذه الدراسة من فأر C57BL/6 ذكر يبلغ من العمر 4 أشهر. ومع ذلك، يمكن استخدام هذا البروتوكول على أي ماوس بغض النظر عن الإجهاد، والعمر، ونوع الجنس، والوزن، الخ.
  2. التخدير الماوس مع 5٪ isoflurane. تحقق من عمق التخدير للماوس عن طريق قرصة رد الفعل.
  3. ضع الماوس المُعنّص في موضع السوبين وسجّل أطرافه الأمامية. افتح تجويف الصدر بعناية وعلبة الأبهر النازل باستخدام إبرة فراشة 25 G.
  4. جعل شق في الأذين الأيمن وperfuse القلب مع ما لا يقل عن 20 مل من 250 وحدة / مل heparinized CMF-DPBS في 2 مل / دقيقة مع مضخة تمعجية متغير التدفق. عندما يخرج PBS من الأذين الأيمن نظيفة، وضخ كاملة.
  5. قطع القلب في الأبهر ووضعها في الجليد الباردة CMF-DPBS.

3. تفكك أنسجة القلب

  1. نقل القلب إلى 15 سم × 15 سم طبق بيتري. اقطع القلب إلى قطع صغيرة (1 مم/قطعة) باستخدام مقص الربيع وملقط النقاط الدقيقة مع محلول إنزيم يُعد ّ كافياً لتغطية القطع (10-15 مل).
  2. نقل القطع والحل في أنبوب مخروطي 50 مل، وختم مع فيلم من البلاستيك البارافين، وحضانة في 37 درجة مئوية على شاكر المداريفي 120 دورة في الدقيقة لمدة 75 دقيقة.
  3. بعد هضم الكولاجين مع محلول الإنزيم، decant السائل من خلال مصفاة خلية 100 م في أنبوب جديد 50 مل ولكن ترك ما يكفي من الحل للتأكد من أن القطع لا تجف.
  4. باستخدام ملقط نقطة غرامة، وإخراج الأنسجة من الأنبوب ووضع بضع قطع على شريحة المجهر. ثم طحن الأنسجة بين اثنين من الشرائح المجهر لتفريق الأنسجة. شطف الشرائح مع وسائل الإعلام ثقافة خالية من الإنزيم في أنبوب مخروطي جديد 50 مل.
  5. كرر الخطوة 3.4 حتى يتم فصل كافة قطع الأنسجة.
  6. الجمع بين الحلول من الخطوات 3.3-3-3.5 في أنبوب واحد. قم بإجهاد التعليق الناتج من خلال مصفاة خلية بـ 100 درجة مئوية في أنبوب مخروطي جديد بـ 50 مل.
  7. الطرد المركزي في 220 × ز، 4 درجة مئوية، لمدة 5 دقائق.
  8. عد الخلايا وتحقق من صلاحيتها باستخدام عداد خلية. تمييع الخلايا إلى 1 × 106 6مل مع المخزن المؤقت لتلطيخ القوات المسلحة الكونغولية الباردة التي تحتوي على 500 مل من DPBS و10−25 مل من 2−5% ألبوم مصل البقر (BSA). الخلايا على استعداد لتكون ملطخة وفرزها.

4. تنقية Pericytes من خليط الخلايا الخام باستخدام FACS

  1. إعداد وتسمية أنابيب FACS 5 مل لجميع الضوابط وعينات الخلية. Aliquot خارج الخلايا (1 مل من الخلايا لكل أنبوب) لعينة غير ملطخة، الفلورة ناقص واحد (FMO) الضوابط، وعناصر التحكم متساوي النمط المتطابقة. استخدم الخلايا المتبقية للفرز. يمكن إعداد جميع الضوابط والعينات وملطخة في نفس الوقت.
    ملاحظه:ما مجموعه 13 مل في 0.5 × 106تم استخدام الخلايا / مل للفرز التمثيلي من قلب واحد. ومع ذلك، يعتمد الحجم على عدد الخلايا التي يحصل عليها المحقق من عزلتها، وعدد القلوب التي يستخدمونها، ومدى هضم أنسجة القلب. حجم كل قلب هو أيضا متغير التي يمكن أن تغير وحدة التخزين.
    1. استخدام حباتالتعويض (جدول المواد) لتحسين ضوابط التعويض الفلورة. إعداد مراقبة تعويض واحدة لكل فلوروكروم في التجربة في أنبوب FACS 5 مل المسمى. لهذه التجربة، قم بإعداد ما مجموعه 9 ضوابط تعويض - نوعين من الخرز غير الملون بالإضافة إلى 7 فلوروكرومات مختلفة من لوحة العلامات بما في ذلك NG2-FITC، CD31-APC، CD140b-PE، CD146-BV605، CD34-BV421، CD45-PE-Cy7، وخلية قابلة للحياة-APC-Cy7 ( جدول المواد).
      1. إضافة قطرة واحدة من الخرز التعويض (~ 50 درجة مئوية) من قارورة الضغط إلى كل أنبوب. ثم إضافة 1 درجة مئوية من الأجسام المضادة إلى الخرز. كرر لكل جسم مضاد من لوحة العلامة. يُمزج المزيج بقوة بواسطة دوامة النبض. حضانة لمدة 30 دقيقة في 4 درجة مئوية محمية من الضوء باستثناء حبات البقاء الخلية التي يمكن تركها في درجة حرارة الغرفة المحمية من الضوء.
      2. بعد ذلك، إضافة 3 مل من FACS تلطيخ العازلة إلى كل أنبوب والطرد المركزي في 300 × ز لمدة 5 دقائق في 4 درجة مئوية. يستنشق قبالة الحل وإعادة تعليق كل بيليه حبة في 400 درجة مئوية من FACS تلطيخ العازلة. عناصر تحكم التعويض جاهزة للاستخدام. حافظ على الثلج
    2. استخدام عناصر التحكم FMO لتحسين تلطيخ الخلفية بسبب التداخل الطيفي.
      1. إعداد عناصر تحكم FMO باستخدام 1 مل من الخلايا التي تم اقتباسها من القسم 4.1 في أنبوب FACS 5 مل وإضافة في جميع الأجسام المضادة من لوحة علامة الموضحة في الخطوة 4.1.1 في تخفيف 1:100 ولكن باستثناء جسم مضاد واحد. على سبيل المثال، قم بإعداد جهاز NG2-AF488 FMO عن طريق تضمين الأجسام المضادة لـ CD31-APC وCD140b-PE وCD146-BV605 وCD34-BV421 وCD45-PE-Cy7 وصبغة صلاحية الخلايا ولكن ليس الجسم المضاد NG2-AF488. يُمزج بلطف مع النبض. كرر لكل جسم مضاد لما مجموعه 7 عناصر تحكم. حضانة لمدة 30 دقيقة في 4 درجة مئوية محمية من الضوء.
      2. بعد ذلك، إضافة 3 مل من FACS تلطيخ العازلة إلى كل أنبوب والطرد المركزي في 300 × ز لمدة 5 دقائق في 4 درجة مئوية. يستنشق قبالة الحل وإعادة تعليق كل بيليه الخلية في 400 درجة مئوية من FACS تلطيخ العازلة. عناصر تحكم FMO جاهزة للاستخدام. حافظ على الثلج
    3. استخدام الأجسام المضادة التحكم isotypeالمتطابقة (جدول المواد) لتلطيخ غير محدد.
      1. إعداد عناصر التحكم isotype عن طريق إضافة الأجسامالمضادة التحكم مطابقة isotype (جدول المواد) إلى 1 مل من عينة الخلية أعدت من القسم 4.1 في تخفيف 1:100 كل في أنبوب FACS 5 مل. يُمزج بلطف مع النبض. حضانة لمدة 30 دقيقة في 4 درجة مئوية محمية من الضوء.
      2. بعد ذلك، إضافة 3 مل من FACS تلطيخ العازلة إلى كل أنبوب والطرد المركزي في 300 × ز لمدة 5 دقائق في 4 درجة مئوية. يستنشق قبالة الحل وإعادة تعليق كل بيليه الخلية في 400 درجة مئوية من FACS تلطيخ العازلة. عناصر تحكم isotype جاهزة للاستخدام. حافظ على الثلج
    4. إعداد الخلايا ليتم فرزها عن طريق إضافة كوكتيل الأجسام المضادة إلى الخلايا المعزولة حديثا.
      1. إعداد عينة الخلية من القسم 4.1 عن طريق إضافة في كوكتيل الأجسام المضادة التي تحتوي على المضادة للماوس NG2-AF488، CD31-APC، CD140b-PE، CD146-BV605، CD34-BV421، CD45-PE-Cy7 في 1:100 تخفيف كل وخلية صبغ صلاحية في 1:100 تخفيف. دوامة بلطف لخلط. عينات الحضانة في 4 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة محمية من الضوء.
      2. بعد تلطيخ، وغسل الخلايا مع FACS تلطيخ العازلة عن طريق الطرد المركزي في 300 × ز لمدة 5 دقائق 4 درجة مئوية. استنشق قبالة الحل وإعادة تعليق بيليه الخلية في FACS تلطيخ العازلة إلى 0.5 × 106 خلايا / مل.
      3. باستخدام أنابيب FACS الجديدة التي لديها 35 ميكرومتر قمم التصفية، عينات الخلية الملونة ماصة على الأغطية والجاذبية filtrate للحصول على تعليق خلية واحدة. حافظ على الثلج
  2. استخدام فارز الخلية لتنقية الخلايا.
    1. تشغيل الخلايا غير الملطخة على فارز الخلية لتعيين الفولتية وتصحيح إشارة الخلفية (على سبيل المثال، تعيين الفولتية للتشتت الأمامي إلى 490-560 ولتشتت الجانب إلى 180-250).
    2. تشغيل كل عينة حبة تعويض لون واحد واحد في وقت واحد لضبط الفولتية لكل قناة وضبط البوابات للإشارة الإيجابية. جمع البيانات. استخدم البرنامج لحساب التداخل الطيفي عن طريق حساب مصفوفة التعويض. جميع الفولتية جاهزة ومجموعة.
    3. تشغيل كل عنصر تحكم isotype واحد في كل مرة ويمكن استخدام هذه البيانات لضبط البوابات لربط غير محدد إذا كان هناك أي.
    4. تشغيل كل عينة FMO واحد في الوقت وضبط الفولتية لكل قناة لتصحيح لنزيف الطيفية من خلال بسبب لوحة متعددة الألوان.
    5. تشغيل عينات الخلية الملونة في فارز الخلية وجمع الخلايا في 10 مل وسائل الإعلام ثقافة خالية من الإنزيم (DMEM + 20٪ FBS + 1٪ P / S) في أنبوب جمع مخروطي 15 مل. استخدم استراتيجية التغرير التالية: بوابة للخلايا المفردة، وبوابة للخلايا الحية، وبوابة للخلايا السالبة CD45، وبوابة للخلايا السلبية CD34 وCD31، وبوابة الخلايا الإيجابية NG2، وأخيراً بوابة الخلايا الإيجابية CD146 وCD140b.

5. زراعة البيريكيت

  1. تُغطّى طبقة من 24 بئرًا مع الجيلاتين بنسبة 0.2% لمدة 5 دقائق وتستنشق محلول الجيلاتين. البذور التي تم الحصول عليها حديثا الخلايا من الخطوة 4.2.5 في DMEM + 20٪ FBS + 1٪ P / S تصل إلى 2 × 104 خلايا / سم2. خلايا الثقافة في حاضنة الخلية تعيين في 37 درجة مئوية، 5٪ CO2 و 95٪ O2.
  2. تمرير من البيريكيت
  3. مرة واحدة في الخلايا هي 95٪ confluent، وغسل الخلايا مع DPBS 1X الدافئة، ورفع الخلايا مع 200 ميكرولتر من 0.1٪ تريبسين في كل بئر في درجة حرارة الغرفة لمدة 3-5 دقيقة.
  4. اضغط بلطف على اللوحة لتخفيف الخلايا.
  5. تحييد التربسين مع 3.5x كمية وسائل الإعلام الثقافة (700 μL DMEM + 20٪ FBS + 1٪ P / S) وتمرير البذور اثنين (P2) الخلايا على لوحة غير المغلفة 6 جيدا في 2 × 104 خلايا / سم2.
  6. كل بئر، عندما confluent، يمكن نقلها إلى قارورة واحدة T-75 كخلايا P3 التي يمكن بعد ذلك تقسيمها بنسبة 1:6.

6. توصيف البيريكيت

  1. تحليل قياس التدفق
    1. استخدم نفس بروتوكول تلطيخ نظام مراقبة الأصول الميدانية واستراتيجية التغرير كما سبق وصفه في القسم 4.
    2. تشغيل الضوابط وعينات ملطخة على مقياس التدفق. جمع البيانات وتحليلالبيانات باستخدام برنامجالتحليل (جدول المواد).
  2. لجمع الصور brightfield، تنمو الخلايا في قارورة في حاضنة خلية تعيين في 37 درجة مئوية، 5٪ CO2 و 95٪ O2. التقاط الصور على المجهر بعد الخلايا تعلق على السطح.
  3. الكيمياء المناعية
    1. تنمو الخلايا في لوحة 96 جيدا حتى 90٪ confluent. غسل الخلايا مع DPBS 1X الدافئة وإصلاح مع 4٪ بارافورمالدهايد لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
    2. غسل الخلايا 3X مع 1X DPBS وpermeabilize مع المنظفات 0.1٪ لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
    3. حضانة الخلايا مع حجب العازلة لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة. بعد الحظر، أضف الأجسام المضادة الأساسية (جسم مضاد واحد لكل بئر) مخففة 1:100 في حظر المخزن المؤقت والحضانة عند 4 درجة مئوية بين عشية وضحاها. الأجسام المضادة الأولية هي: المضادة للNG2، المضادة للCD140b، المضادة CD31، المضادة للفيمنتين، المضادة للديسمين، ومكافحة ألفا الأكتين العضلات الملساء.
    4. في اليوم التالي، وغسل الخلايا3X مع العازلة غسل (جدول المواد). إضافة الأجسام المضادة الثانوية المخففة 1:1,000 في حظر العازلة وحضانة لمدة 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة في الظلام. الأجسام المضادة الثانوية هي المضادة للأرنب المترافقة مع FITC.
    5. غسل الخلايا 3X مع العازلة غسل. إضافة 300 μM وصمة عار النووية المخففة في 1:1,000 لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
    6. غسل الخلايا 3X مع 1X DPBS وجبل مع تصاعد وسائل الإعلام.
    7. خلايا الصورة مع مجهر البؤري.

النتائج

بعد الهضم الأنزيمي وتفكك القلب كله وقبل تنقية FACS من الخلايا، والخلايا هي خليط الخام الذي يحتوي على العديد من أنواع الخلايا المختلفة من القلب (الشكل1A). بعد تنقية FACS والزراعة، والخلايا متجانسة. فهي واحدة النوى، مسطحة تماما، ولها مورفولوجيا البيريكيت rhomboid نموذجية (الشكل1B).

باستخدام FACS، يتم تنقية الخلايا إلى التجانس. يتم استخدام عينة خلية التحكم غير ملطخة لإظهاراستراتيجية gating (الشكل 2). أولاً، تم وضع بوابات للحطام ودوبلتس على أساس توزيعات التشتت الأمامي والجانبي. ثم تم بوابات الخلايا الميتة بسبب رد فعل أمين مع الصبغة التي تنتج إشارة أكبر وأكثر كثافة من الخلايا الحية. من الخلايا الحية، تم بوابات الخلايا المكونة للدم من خلال كونها CD45+. لمزيد من إزالة الخلايا المكونة للدم والبطانة، CD34+ وCD31+ تم بوابات الخلايا. وأخيرا، تم اختيار NG2+ وCD140b+/CD146+ الخلايا لكونها خلايا الأوعية الدموية مع التعبير عن علامات pericyte نموذجية (الشكل3). كما تم اختبار لوحة علامة على الخلايا البطانية التاجية الماوس كعنصر تحكم (الشكل التكميلي 1). فقط حوالي 1٪ من خليط الخلايا الخام تتكون من pericytes بعد الفرز.

للتحقق من أن الخلايا كانت في الواقع pericytes، ونحن تمرير الخلايا لمزيد من التوصيف. نمت الخلايا بسرعة بمجرد أن وصلت إلى P3 في قوارير T-75 دون تغييرات في الجدوى كما أصبحت أقدم (الشكلالتكميلي2). عند مقارنتها مع pericytes الدماغ البشري، كان الخلايا مورفولوجيا مماثلة (الشكل4A). عند مقارنتها مع الماوس وخلايا العضلات الملساء البشرية، كان الخلايا مورفولوجيا مختلفة (الشكل4A). كما لم تكن هناك أي تغييرات ملحوظة في المورفولوجيا أو التعبير علامة في P7 عندما ملطخة بالمناعة أو عن طريق تحليل قياس السيتومترية التدفق بعد تمرير (الشكل4B،C).

figure-results-1
الشكل 1 : الخلايا الخام مقابل الخلايا النقية. (أ) صورة برايتفيلد من خليط الخلية الخام آخر القلب كله الهضم الأنزيمي والتفكك الذي تم زرعه في قارورة T25 لمدة 14 يوما. (ب) صورة لامعة من السكان متجانسة من pericytes القلب بعد الفرز والزراعة بعد 14 يوما. شريط مقياس = 100 درجة.

figure-results-2
الشكل 2 الصور التمثيلية لتحليل FACS للخلايا غير الملطخة. التمثيل التخطيطي لاستراتيجية التجشمع المستخدمة لتنقية خليط الخلايا الخام. بوابة للخلايا التي هي واحدة، حية، CD45-، CD31-، CD34-، NG2+، CD146+، وCD140b+ . الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-3
الشكل 3 الصور التمثيلية لتحليل FACS للخلاياالخام. التمثيل التخطيطي للفرز المستخدمة للحصول على مجموعة متجانسة من pericytes القلب. ما يقرب من 1٪ من الخلايا الخام هي CD31-CD34-CD45-CD140b+NG2+CD146+ . الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-4
الشكل 4 توصيف البيريسيتات القلبية المعزولة الأولية: (أ) صور برايتفيلد للخلايا المستزرعة من الدماغ البشري (hPC) وقلوب الماوس (mPC) تظهر نفس المورفولوجيا الخلية pericyte ولكن مورفولوجيا مختلفة من خلايا العضلات الملساء البشرية hSMC) وخلايا العضلات الملساء الماوس (mSMC). شريط مقياس = 100 درجة مئوية (B) توصيف فينوتيبيك للخلايا في P7 بواسطة الكيمياء المناعية لعلامات pericyte. شريط مقياس = 100 درجة مئوية (C) تحليل عن طريق قياس التدفق للpericytes في P7 حيث تم بوابات لعلامات سلبية CD31، CD34، CD45 وعلامات إيجابية NG2، CD140b، وCD146. ولا يزال السكان متجانسين. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل التكميلي 1: الصور التمثيلية لتحليل قياس التدفق للخلايا البطانية باستخدام لوحة العلامات. تم استخدام خط الخلايا البطانية التاجية الماوس كتحكم في خصوصية ملزمة للعلامات. باستخدام نفس استراتيجية gating التي تم استخدامها في هذا النوع باستثناء بوابة إيجابية CD31 بدلاً من بوابة سلبية، كانت الخلايا البطانية سلبية لCD45، CD34، NG2، CD140b، و CD146 ولكن إيجابية CD31 كما هو متوقع. الرجاء النقر هنا لتحميل هذا الرقم.

الشكل التكميلي 2: صور تمثيلية لتحليل قياس التدفق للمقاطع المختلفة من MPC. تم زراعة pericytes القلب المعزولة الأولية ومرورها حتى مرور 12. كانت الخلايا ملطخة يوديد البربيديوم وتحليلها على مقياس التدفق. السيطرة على السكان هو مزيج من الخلايا الميتة والخلايا الحية. لم تكن هناك اختلافات كبيرة في عدد الخلايا القابلة للحياة بين الممرات. الرجاء النقر هنا لتحميل هذا الرقم.

المناقشة

وبما أن الدراسات المتعلقة بpericytes القلبية جديدة نسبياً، فإن دور البيريسيتات في علم وظائف الأعضاء القلبية الوعائية والفيزيولوجيا المرضية لم يُحدد بعد. في أجهزة أخرى، وقد ثبت أنها تلعب أدوارا رئيسية في الهومنة السفينة والتسريب1،2. بالمقارنة مع أدب pericytes من أجهزة أخرى مثل الدماغ، وهناك عدد أقل بكثير من المنشورات على pericytes القلب. إن عزل البيريسيتات القلبية أمر بالغ الأهمية لفهم خصائصها الوظيفية وآليات الإشارة. ولذلك، فإن هذا البروتوكول يوفر للمحققين طريقة أسهل للوصول إلى pericytes القلب من مصدر الأنسجة المتاحة بسهولة أكبر وتعزيز الدراسات على البيولوجيا الخاصة بهم. وسوف يساعد على الإجابة على الأسئلة حول كيفية مساهمة pericytes القلب في التوازن القلبي والفيزيولوجيا المرضية، فضلا عن التحقيق في إمكاناتها العلاجية.

السكان pericyte معزولة عن قلب المورين وتتميز CD31-CD34-CD45-CD140b+NG2+CD146+ تم تمريرعدة مرات (تصل إلى P12 وكان لا يزال قويا)، والتي لا انخفاض في القدرة على البقاء وينتشر بسرعة (الشكلالتكميلي2). كما تم تجميد الخلايا بالتبريد واستعادتها مع ما لا يقل عن 95٪ من الجدوى. ومع ذلك، نحن نفضل استخدام الخلايا P7 أو أصغر لتجاربنا. مقارنة الصور brightfield من pericytes لدينا مع pericytes الدماغ البشري، وخطوط الخلية اثنين لديها مورفولوجيا الخلية مماثلة (الشكل4A)في حين أنها تختلف في مورفولوجيا من خلايا العضلات الملساء (الشكل4A). تتميز خلايا P7 لدينا بالكيمياء المناعية لعلامات pericyte، وبعضها من لوحة FACS لدينا (NG2 و CD140b)، وعدد قليل ليس في لوحة (vimentin، desmin، αSMA) ووجدنا أن الخلايا أعرب علامات pericyte متجانسة (الشكل 4B). بالإضافة إلى ذلك، تم تحليل خلايا P7 لدينا عن طريق قياس التدفق مرة أخرى مع نفس لوحة علامة لتقييم التغييرات في التعبير علامة بسبب تمرير ووجدنا أنه لم تكن هناك تغييرات (الشكل4C). لذلك، على حد سواء فينيولاولوجيولوجي، خلايانا هي pericytes.

وقد أظهرت الدراسات التي أجراها نيس وآخرون10وAvolio وآخرون11وChen et al.12وBaily et al.13 عزلات القلب البيريسيت الناجحة. ومع ذلك، فإن استخدام المعدات المبنية حسب الطلب في المنزل لفصل البيريسيتات عن السفن الدقيقة من قبل نيس وآخرون10 ينطوي على غرفتين مع المضخات التي تغرس محلول البروتياز ذهابا وإيابا من خلال كومة شبكة الشبكة، والتي كان من الصعب تكرارها لأنها لم يقدم تخطيطية و / أو صورة للجهاز وكيف تم بناؤه. على الرغم من أن Nees وآخرون10 عزل بنجاح pericytes القلب من العديد من الأنواع، ونحن لم تكن قادرة على إعادة إنتاج طريقتهم. لدينا خطوة مفرزة pericyte في بروتوكولنا يستخدم ببساطة شاكر المدارية (لفصل جميع الخلايا) التي تتوفر في معظم، إن لم يكن كل المختبرات، مع الأنسجة ومحلول الإنزيم في أنبوب مخروطي تليها خطوة التفكك الميكانيكية. لا يوجد جهاز مخصص مطلوب. ثانيا، تنطوي البروتوكولات المتبقية على استخدام الأنسجة البشرية، وبالتالي فإن شراء الأنسجة البشرية يقتصر على المحققين. بروتوكولنا هو تعديل وتحسين البروتوكولاتالحالية 9،12 باستخدام نماذج الماوس (نوع البرية، المعدلة وراثيا، والمرضى) والمواد التي هي متاحة بسهولة لجميع المحققين.

نظرًا لأن الخلايا المحيطة بالأوعية الدموية بشكل عام حساسة، فإن بقاء الخلايا أمر بالغ الأهمية للحصول على عائد جيد. أثناء شراء أنسجة القلب وتلطيخ الخلايا، تحتاج الأنسجة / الخلايا إلى أن تبقى باردة. ثانيا، قد يتطلب الهضم الأنزيمي للأنسجة التحسين على أساس فردي. اعتمادا على وحدات النشاط على قارورة واحد من الإنزيمات، والتركيز والهضم الوقت قد تحتاج إلى الأمثل. تأكد من أن يتم إعداد الحل الأنزيمي الطازجة في كل مرة خلاف ذلك سوف ينخفض العائد. ثالثا، يحتوي الخليط الخام على الكثير من الخلايا، وبعضها ميت و/ أو يحتضر، فمن الأفضل لخفض تركيز FBS في المخزن المؤقت تلطيخ من 5٪ إلى 2٪. إذا كنت تواجه مشكلة مع الخلايا انسداد فوهة أثناء الفرز، إثراء الخلايا أولاً باستخدام مجموعة إزالة الخلايا الميتة. يمكنك أيضًا إضافة المخزن الاحتياطي EDTA/HEPES أو علاج DNase إلى فرز الخلايا المسبق لمنع تكتل الخلايا. وأخيرا، لأن لدينا لوحة من الأجسام المضادة كبيرة نوعا ما ويستخدم العديد من الفلوروفوريس، تأكد من أن يتم التحكم FMO الخاص بك وضوابط التعويض بشكل صحيح.

أحد القيود على هذه الطريقة هو كمية pericytes القلبية التي يمكن الحصول عليها لكل قلب. في حالتنا، فقط 1.1٪ من خليط نا الخام من قلب فأر واحد كانت pericytes التي هي مماثلة للنسبة المئوية في انعزالات القلب البشري، ولكن عدد الخلايا أقل بكثير بسبب كمية أنسجة القلب التي يوفرها الماوس. لأن عدد بدء الخلايا منخفضة جدا بعد FACS، سيكون من الأفضل عزل من قلوب متعددة في وقت واحد. ومع ذلك، فإن المشكلة مع ذلك هو مجرد عدد من الخلايا التي تحتاج إلى فرز من خلال في يوم واحد. إذا كان لديك أكثر من 30 مليون خلية، سيكون من الصعب الحصول من خلال هذا النوع دون التأثير على صلاحية الخلايا. إذا كان المحقق لديه عدة فرز اتّساع خلايا، فإن العزل عن قلوب متعددة في يوم واحد سيكون قابلاً للتنفيذ. قيود أخرى هي أننا لا نعرف ما إذا كان هناك مجموعات فرعية من pericytes في القلب مثل هناك العضلات الهيكلية15،16، ونحن لا نعرف ما إذا كنا القضاء على نوع فرعي في استراتيجيتنا gating. نحن في عملية وصف pericytes القلب لدينا وحتى الآن في بياناتنا غير المنشورة، فهي وظيفية مثل pericytes الأخرى في الأدب.

سيمكن بروتوكولنا المحققين من الإجابة على الأسئلة المتعلقة بخصائص القلب، والخصائص، والوظائف، والجوانب الأخرى التي من شأنها أن تساعد في تحديد مساهمتهم في التوازن القلبي وديناميكا القلب. هذه الخلايا يمكن أن يكون لها القدرة العلاجية لأمراض القلب والأوعية الدموية بمجرد فهم بيولوجيا بشكل أفضل.

الإفصاحات

وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

يود المؤلفون أن يشكروا Amgen Flow Cytometry Core على مساعدتهم في تصميم لوحة الفلوروفور، واستكشاف الأخطاء وإصلاحها، وفرز الخلايا.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
0.25٪ تريبسين-EDTAكورنينج25-053-Clمخفف مع 1x DPBS للحصول على 0.1٪
100 & mu ؛ مصفاة خلية MFisherSci22363549
15 مل أنابيب مخروطية Falcon BD352096
24 بئرCorningCLS3527
25 G إبرة فراشةFisherSci22-253-146
31 G حقنة إبرةFisherSciB328446
50 مل أنابيب مخروطية Falcon BD352098
6 آبارلوحة CorningCLS3516
مضاد للعضلات الملساء ألفا أكتين أرنب mAbabcamab32575الجسم المضاد المستخدم في ICC 1: 100 التخفيف
المضاد ل CD140b الأرنب mAbإشارات الخلية28E1الجسم المضاد المستخدم في ICC 1: 100 التخفيف
المضاد ل CD31 الأرنب pAbabcamab28364الجسم المضاد المستخدم في ICC 1: 100 التخفيف
المضاد للأرانب pAbabcamab8592الجسم المضاد المستخدم في ICC 1: 100 التخفيف
المضاد ل NG2 المقترن ب AF488MilliporeMAB5384A4الجسم المضاد المستخدم في ICC 1: 100 التخفيف
المضاد للفيمنتين الأرنب mAbabcamab92547الجسم المضاد المستخدم في ICC 1: 100 التخفيف
ArC Amine التعويض التفاعلي حبةInvitrogenA10346حبات للحياة / الميتة بالقرب من صبغة الأشعة تحت الحمراء
برايتفيلد كاميرا مجهريةمرفقة
CD140b-PE (استنساخ APB5)eBioscience12-1402-81الجسم المضاد المستخدم في تخفيف FACS 1: 100
CD146-BV605 (استنساخ ME-9F1) BD740434الجسم المضاد المستخدم في تخفيف FACS 1: 100
CD31-APC (استنساخ MEC 13.3) BD551262الجسم المضاد المستخدم في تخفيف FACS 1: 100
CD34-BV421 (استنساخ ذاكرة الوصول العشوائي 34) BD56268الجسم المضاد المستخدم في تخفيف FACS 1: 100
CD45-PE-Cy7 (استنساخ 30-F11) BD552848الجسم المضاد المستخدم في FACS 1: 100
الطرد المركزيeppendorf
Collagenase BRoche11088815001 0.226 U / mg lyo.
مجهر
DAPIThermoFisherD1306صبغة نووية
DMEM مع 4.5 جم / لتر جلوكوز ، L-glutamine وبيروفات الصوديومCorning10-013-CV500 مل
مقص DowellFST15040-11
ملحي مخزن بالفوسفات من Dulbecco (DPBS)Corning21-030-CV500 مل
محلول ملحي مخزن بالفوسفات من Dulbecco بدون Ca و Mg (CMF-DPBS)Corning21-031-CV500 مل
Dumont # 5 Fine FallpsFST11254-20
FACSAفارز الخلاياBDالليزر: 405 نانومتر 50 ميجاوات ، 488 نانومتر 100 ميجاوات ، 561 نانومتر 50 ميجاوات ، 633 نانومتر 11 ميجاوات
FACSriaBD
Falcon دائري القاع بولي بروبيلين ، 5 ملBD BD38057
أنبوب فالكون مع غطاء مصفاة خلية ، 5 ملBD08-771-23
مصل الأبقار الجنينيCorning35-015-CV500 مل
مقص ناعمFST14060-09
برنامجFlowJo FlowJo LLC
Fortessa LSR مقياس التدفق الخلويBDالليزر: 405 نانومتر 50 ميجاوات ، 488 نانومتر 100 ميجاوات ، 561 نانومتر 50 ميجاوات ، 633 نانومتر 11 ميجاوات
طلاء قائم على الجيلاتينCell Biologics6950
الماعز المضاد للأرانب IgG (H + L) الجسم المضاد الثانوي المتصاص المتقاطع، Alexa Fluor 488InvitrogenA-11008الجسم المضاد المستخدم في ICC 1: 1000 التخفيف
Graefe FulpsFST11049-10
محلول الصوديوم الهيبارينHospiraNDC 0409-2720-0210,000 وحدة USP / 10 مل ؛ من حاضنة أمعاء الخنازير
تعيين عند 37 درجة ؛ ج ، 5٪ CO2 ، 95٪ O2 & nbsp ؛
يعيش / الميت بالقرب من الأشعة تحت الحمراءالحياةالتكنولوجيات L10119
المجهر الشرائحفيشرSci12-550-343
NG2-FITCMilliporeAB5320A4الجسم المضاد المستخدم في FACS 1: 100 التخفيف
Oribital شاكرVWRداخل 37 درجة ؛ C حاضنة أو غرفة
ParaformaldehydeFisherSci50-980-487مخففة مع 1x DPBS للحصول على 4٪
البنسلين الستربتومايسينCorning30-002-CI
& nbsp ؛ طبق بتريFisherSciFB0875714
ماصة ونصائح
ProLong DiamondThermoFisherP36965وسائط التركيب
Propidum IodideThermoFisherصبغة صلاحية خلية Propidum Iodide ThermoFisher
Rabbit IgG FITCeBiosciences11-4614-80الجسم المضاد للتحكم في النمط المتشاوي - FITC
Rat IgG2a APCBiolegend400512الجسم المضاد للتحكم في النمط المتشاحي - APC
Rat IgG2a BV421Biolegend400536جسم مضاد للتحكم في النمط المتشاحي - BV421
Rat IgG2a BV605BD563144الجسم المضاد للتحكم في النمط المتشاحي - BV605
Rat IgG2a PEBiolegend400308النمط المتشاحي - PE
Rat IgG2b PE-Cy7Biolegend400617التحكم في النمط المتشاحي الأجسام المضادة - PE-Cy7
SuperBlockThermoFisher37515حجب العازلة
T75ThermoFisher156499
Triton X-100SigmaX100المنظفات ، مخفف مع x DPBS للحصول على 0.1٪
حبات UltraCompInvitrogen01-2222-42حبات تعويض
مضخة تمعجية متغيرة التدفقFisherSci13-876-1
عداد خلية ViCellBeckman
Wash المخزن1:10 من Superblock في 1x DPBS
لوحة كيت تعويض تخفيف متحد البؤر محلول برنامج أنبوب للشكل التكميلي 2 المؤقت

المراجع

  1. Armulik, A., Abramsson, A., Betsholtz, C. Endothelial/pericyte interactions. Circulation Research. 97 (6), 512-523 (2005).
  2. Armulik, A., Genove, G., Betsholtz, C. Pericytes: developmental, physiological, and pathological perspectives, problems, and promises. Developmental Cell. 21 (2), 193-215 (2011).
  3. Sengillo, J. D., et al. Deficiency in mural vascular cells coincides with blood-brain barrier disruption in Alzheimer's disease. Brain Pathology. 23 (3), 303-310 (2013).
  4. Avolio, E., Madeddu, P. Discovering cardiac pericyte biology: From physiopathological mechanisms to potential therapeutic applications in ischemic heart disease. Vascular Pharmacology. 86, 53-63 (2016).
  5. Dore-Duffy, P. Isolation and characterization of cerebral microvascular pericytes. Methods in Molecular Medicine. 89, 375-382 (2003).
  6. Bryan, B. A., D'Amore, P. A. Pericyte isolation and use in endothelial/pericyte coculture models. Methods in Enzymology. 443, 315-331 (2008).
  7. Maier, C. L., Shepherd, B. R., Yi, T., Pober, J. S. Explant outgrowth, propagation and characterization of human pericytes. Microcirculation. 17 (5), 367-380 (2010).
  8. Crisan, M., Corselli, M., Chen, W. C., Peault, B. Perivascular cells for regenerative medicine. Journal of Cellular Molecular Medicine. 16 (12), 2851-2860 (2012).
  9. Crisan, M., et al. Purification and long-term culture of multipotent progenitor cells affiliated with the walls of human blood vessels: myoendothelial cells and pericytes. Methods in Cellular Biology. 86, 295-309 (2008).
  10. Nees, S., et al. Isolation, bulk cultivation, and characterization of coronary microvascular pericytes: the second most frequent myocardial cell type in vitro. American Journal of Physiology Heart Circulatory Physiology. 302 (1), H69-H84 (2012).
  11. Avolio, E., et al. Expansion and characterization of neonatal cardiac pericytes provides a novel cellular option for tissue engineering in congenital heart disease. Journal of the American Heart Association. 4 (6), e002043(2015).
  12. Chen, W. C., et al. Human myocardial pericytes: multipotent mesodermal precursors exhibiting cardiac specificity. Stem Cells. 33 (2), 557-573 (2015).
  13. Baily, J. E., et al. Isolation of Perivascular Multipotent Precursor Cell Populations from Human Cardiac Tissue. Journal of Visualized Experiments. (116), e54252(2016).
  14. Murray, I. R., et al. Skeletal and cardiac muscle pericytes: Functions and therapeutic potential. Pharmacology & Therapeutics. 171, 65-74 (2017).
  15. Birbrair, A., et al. Role of pericytes in skeletal muscle regeneration and fat accumulation. Stem Cells Development. 22 (16), 2298-2314 (2013).
  16. Birbrair, A., et al. Skeletal muscle pericyte subtypes differ in their differentiation potential. Stem Cell Research. 10 (1), 67-84 (2013).

إعادة الطباعة والأذونات

استكشف المزيد من المقالات

تنقية FACSالهضم الإنزيميتفكيك الأنسجةقياس التدفق الخلويفرز الخلاياعلامات الخلايا الحوطيةنموذج الفأرزراعة الخلايادراسات ديناميكا الدم
عزل وتنقية البيريكيتالقلبي ة المورين
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.