مقالة منهجية

تقييم تكوين الأوعية العلاجية في نموذج مورين من نقص التروية الخلفية

8.4K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/59582

⸱

يونيو 8, 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Centro Cardiovascular da Universidade de Lisboa, Lisbon School of Medicine of the Universidade de Lisboa, 2Centro Hospitalar Universitário Lisboa Norte, 3Nova Medical School/Faculdade de Ciências Médicas, Universidade Nova de Lisboa

في هذه المقالة

ملخص

هنا، يتم تقديم نموذج تجريبي نقص التروية الخلفية الحرجة تليها بطارية من الاختبارات الوظيفية والأنسجة والجزيئية لتقييم فعالية العلاجات الوعائية.

الملخص

نقص تروية الأطراف الحرجة (CLI) هو حالة خطيرة تنطوي على مخاطر عالية من بتر الأطراف السفلية. على الرغم من إعادة الأوعية الدموية كونها العلاج الذهب القياسية، وعدد كبير من المرضى CLI ليست مناسبة لإعادة الأوعية الدموية الجراحية أو داخل الأوعية الدموية. تظهر العلاجات الوعائية كخيار لهؤلاء المرضى ولكنلا حاليا قيد التحقيق. قبل التطبيق في البشر، يجب اختبار هذه العلاجات في النماذج الحيوانية ويجب أن تكون آلياتها مفهومة بوضوح. وقد تم تطوير نموذج حيواني من نقص التروية الخلفية (HLI) عن طريق ربط وختان الشرايين والأوردة الحرقفية الخارجية البعيدة في الفئران. تم تجميع فريق شامل من الاختبارات لتقييم آثار نقص التروية والعلاجات الوعائية المفترضة على المستويات الوظيفية والأنسجة والجزيئية. تم استخدام دوبلر الليزر لقياس التدفق والتقييم الوظيفي للتسريب. تم تقييم استجابة الأنسجة من خلال تحليل الكثافة الشعرية بعد تلطيخ مع الأجسام المضادة CD31 على المقاطع النسيجية من العضلات المعدية وعن طريق قياس كثافة الأوعية الجانبية بعد diaphonization. تم تحديد التعبير عن الجينات الوعائية من قبل RT-PCR التي تستهدف عوامل وعائية مختارة حصرا في الخلايا البطانية (ECs) بعد التقاط الليزر microdissection من العضلات الجهاز الهضمي الفئران. وكانت هذه الأساليب حساسة في تحديد الاختلافات بين الأطراف الإقفارية وغير الإقفارية وبين الأطراف المعالجة والأطراف غير المعالجة. ويوفر هذا البروتوكول نموذجاً للنسخ من CLI وإطاراً لاختبار العلاجات الوعائية.

المقدمة

يؤثر مرض الشرايين المحيطية (PAD) في الغالب على الأطراف السفلية. يحدث مرض التصلب المتعدد بسبب تصلب الشرايين، وهو انسداد في الشريان يمكن أن يسبب تقييدًا شديدًا لتدفق الدم في الأطراف السفلية1. العرج المتقطع هو أول مظهر من مظاهر PAD ويشير إلى ألم العضلات عند المشي. CLI هي المرحلة الأكثر شدة من PAD، ويجري تشخيصها في المرضى التي تظهر آلام الراحة الإقفارية، والقرحة أو الغرغرينا2. المرضى الذين يعانون من CLI لديهم خطر كبير من بتر، وخاصة إذا لم يعالج3. إعادة الأوعية الدموية في الأطراف السفلية (إما عن طريق الجراحة المفتوحة أو إجراء داخل الأوعية الدموية) هي حاليا الطريقة الوحيدة لتحقيق إنقاذ الأطراف. ومع ذلك، فإن حوالي 30٪ من مرضى CLI غير مناسبين لهذه الإجراءات، لأسباب تشمل موقع الآفات، ونمط انسداد الشرايين والاعتلال المشترك واسعة النطاق4،5. لذلك، هناك حاجة إلى علاجات جديدة لهؤلاء المرضى الذين لا يمكن علاجهم، مع تعزيز تكوين الأوعية الدموية هي الاستراتيجية تحت تحقيق أكثر كثافة.

قبل الاختبار في البشر، يجب النظر في فعالية وسلامة العلاجات الجديدة في الجسم الحي في النماذج الحيوانية. وقد وضعت عدة نماذج لدراسة CLI, في الغالب عن طريق تحفيز نقص التروية الخلفية (HLI) في الفئران6,7,8,9,10. ومع ذلك، فإن هذه النماذج تختلف في عدة جوانب بما في ذلك طبيعة الشرايين التي يتم ربطها و / أو مقتطعة وما إذا كانت الأوردة والأعصاب المحيطة بها يتم تشريحها وكذلك6،7،8، 9،10. إذا ما أخذت هذه الجوانب مجتمعة، سوف تؤثر على شدة إصابة نقص التروية-التسريب في كل الحيوان، مما يجعل من الصعب مقارنة النتائج. ولذلك، من الأهمية بمكان وضع بروتوكول فعال ينبغي فيه توحيد إجراء الحث على نقص التروية وتقييم مختلف الأهداف لتقييم ما إذا كان العلاج الوعائي المعطى سيكون فعالاً. ومن شأن بروتوكول تجريبي مصمم لتغطية جميع هذه الجوانب أن يوفر فهما شاملا للآليات التي تمارس بها العلاجات الوعائية آثارها ومقياسا لفعاليتها في كل من نتائجها. عملين متميزين نشرمؤخرا من قبل فريقنا هي مثال جيد11،12، التي تم فيها تقييم نهج مختلفة للحث على تكوين الأوعية العلاجية باستخدام نفس البروتوكول الذي سيتم وصفه بمزيد من التفصيل في هذا البروتوكول.

الهدف العام لهذا البروتوكول هو وصف نموذج تجريبي قابل للاستنساخ يمكن أن يحاكي آثار CLI ويضع الأساس التجريبي لتقييم شامل للآثار الوظيفية والأنسجة والجزيئية للأوعية المفترضة وكلاء.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

جميع الإجراءات الحيوانية تتفق مع التوجيه 2010/63/EU وقد تمت الموافقة عليها من قبل الهيئة المؤسسية لرعاية الحيوان ومرخصة من قبل DGAV، الهيئة البرتغالية المختصة لحماية الحيوان (رقم الترخيص 023861/2013)

تحذير: العديد من المواد الكيميائية المستخدمة في البروتوكولات سامة وضارة. يرجى استخدام جميع ممارسات السلامة المناسبة ومعدات الحماية الشخصية (القفازات، معطف المختبر، السراويل كاملة الطول، والأحذية المغلقة اصبع القدم)

1. نموذج مورين من نقص التروية الخلفية

ملاحظة: يتم إجراء جميع التجارب على الفئران الإناث C57BL/6 البالغة من العمر 22 أسبوعًا.

  1. إعداد الحلول
    1. إعداد محلول التخدير
      ملاحظة: يوفر هذا المزيج المخدر (الميدتوميدين والكيتامين) ما يصل إلى 30 دقيقة من الجمود ونافذة جراحية من 15 دقيقة. ويمكن إرجاع التأثير عن طريق إدارة atipamezole.
      1. مع حقنة نظيفة، 1CC، وسحب 1 مل من medetomidine (1 ملغ / كغ من وزن الجسم)، والقضاء على فقاعات الهواء لقياسات دقيقة، وإضافته إلى أنبوب الصقر 15 مل.
      2. مع نظيفة، 1 سم مكعب حقنة، وسحب 0.75 مل من الكيتامين (75 ملغ / كغ وزن الجسم)، والقضاء على فقاعات الهواء لقياسات دقيقة وإضافته إلى أنبوب الصقر 15 مل التي تحتوي على medetomidine.
      3. إضافة 8.25 مل من المالحة المعقمة (0.9٪ NaCl)، من أجل الحصول على 10 مل من محلول التخدير.
      4. تحديد الأنبوب مع اسم المركبات، والتاريخ مختلطة وتاريخ انتهاء الصلاحية.
      5. يُحفظ في الظلام عند درجة حرارة 4 درجات مئوية.
    2. إعداد الحل المضاد للمهدئات
      1. مع نظيفة، 1 سم مكعب حقنة، وسحب 1 مل من atipamezole (5 ملغ / كغ من وزن الجسم)، والقضاء على فقاعات الهواء لقياسات دقيقة، وإضافته إلى أنبوب الصقر 15 مل.
      2. إضافة 9 مل من المالحة المعقمة (0.9٪ NaCl)، من أجل الحصول على 10 مل من محلول الارتداد.
      3. تحديد الأنبوب مع اسم المركبات، والتاريخ مختلطة وتاريخ انتهاء الصلاحية.
      4. يُحفظ في الظلام عند درجة حرارة 4 درجات مئوية.
    3. إعداد حل التسكين بعد العملية الجراحية
      1. مع نظيفة، 1 سم مكعب حقنة، وسحب 0.5 مل من البوبرينورفين (100 درجة مئوية / 15-30 غرام من وزن الجسم)، والقضاء على فقاعات الهواء لقياسات دقيقة، وإضافته إلى أنبوب الصقر 15 مل.
      2. إضافة 9.5 مل من المالحة المعقمة (0.9٪ NaCl)، من أجل الحصول على 10 مل من محلول التسكين.
      3. تحديد الأنبوب مع اسم المركبات، والتاريخ مختلطة وتاريخ انتهاء الصلاحية.
      4. يُحفظ في الظلام عند درجة حرارة 4 درجات مئوية.
  2. الحث الجراحي لنقص تروية الطرف الخلفي
    1. الأدوات الجراحية اللازمة لهذا التدخل: ملقط مدبب، مقص الربيع، حامل إبرة العيون، مقص الجراحية وحامل إبرة. تعقيم جميع الأدوات الجراحية في الأوتوكلاف قبل الاستخدام. استخدام مسحات القطن لتشريح الدهون تحت الجلد.
    2. تحميل الحقنة مع محلول التخدير قبل عقد الماوس.
    3. كبح جماح الحيوان عن طريق تطبيق القوة وراء أذنيه ضد شبكة القفص، وعقد الجلد قدر الإمكان للحفاظ على الماوس غير متحرك.
    4. الحفاظ على الحيوان يميل مع خفض رأسه وإجراء حقن داخل الصفاق من محلول التخدير، والحفاظ على الحقنة في زاوية 45 درجة مع جسم الماوس.
    5. تحقق من عدم وجود ردود الفعل انسحاب دواسة، لتقييم عمق التخدير.
    6. إزالة الشعر من الطرف الخلفي الأيمن باستخدام حلاقة كهربائية. استخدام الكلورهيكسيدين مطهر الصابون فرك لإعداد الجلد. استخدام منشفة ورقية نظيفة لإزالة suds. تطبيق فرك الكلورهيكسيدين الجراحية وحماية منطقة الجلد مع الستائر المعقمة قبل نقل الفئران إلى جناح الجراحية المعقمة.
    7. وضع الحيوان في decubitus الظهرية وتقييده مع الأطراف الأربعة تنتشر بعيدا وتأمينها مع الشريط.
      تحذير: إجراء الإجراء على لوحة ساخنة للحفاظ على درجة حرارة جسم الحيوان مستقرة. يتم تنفيذ العملية الجراحية باستخدام مجهر تشريح في التكبير 10X أو 20x.
    8. تطبيق محلول مطهر الكلورهيكسيدين باستخدام الشاش المعقم لوضع اللمسات الأخيرة على إعداد الجلد. باستخدام شفرة مشرط الجراحية رقم 11 إجراء شق الجلد 1 سم فوق الفخذ من الطرف الخلفي الأيمن.
    9. تشريح حاد ة الدهون تحت الجلد فضح حزمة الأوعية الدموية العصبية. باستخدام الملقط المدبب، مقص الربيع وحامل إبرة العيون، وفتح غمد الإلوالفخذ يبذير لفضح الأوعية الحرقفية والفخذية الخارجية البعيدة.
    10. تشريح وفصل الأوعية (الشريان والوريد) من العصب. باستخدام خياطة البولي بروبلين غير قابلة للامتصاص 7.0 ligate الشريان الحرقفي الخارجي القابي والوريد والشريان الفخذي القاصي والوريد.
    11. قطع الجزء من الشريان الفخذي ilio والأوردة بين العقد ة البعيدة والقريبة مع مقص الربيع.
    12. أغلق الشق بخياطة قابلة للامتصاص (على سبيل المثال، 5.0 خياطة فيكريل).
    13. تحميل الحقنة مع الحل المضاد للمهدئات واستخدام نفس الطريقة المفصلة في 1.2.3 و 1.2.4 لإجراء حقن داخل الصفاق من الحل المضاد للمهدئ.
  3. الرصد بعد العملية الجراحية
    ملاحظة: يتم مراقبة الحيوانات بعناية كل 15-20 دقيقة للتأكد من أن جميع الحيوانات تتعافى بشكل جيد من المضادة للمهدئات. لا تترك الحيوانات التخدير أبدا دون مراقبة.
    1. تقييم الانتعاش من التخدير: 1) رصد معدل وعمق التنفس. 2) تقييم ردود الفعل الحيوانية (دواسة وموقف العين)
    2. إجراء حقن تحت الجلد من التسكين بعد العملية الجراحية كل 8-12 ساعة.
    3. مراقبة الحيوانات يوميا بعد الجراحة تسجيل وصفا موجزا للحالة الصحية للالحيوان ومظهر موقع الجراحة، وضمان إغلاق جميع الغرز.
    4. إعادة خياطة الشق، إذا حدث الهسق. إذا لم تنجح، وتطبيق فيلم حاجز الجلد على شق للحماية من البول، إفرازات البراز، والاحتكاك والقص من الجلد وللمساعدة في عملية الشفاء.

2. تقييم تأثير الأوعية

ملاحظة: بعد تحريض نقص التروية، وتطبيق العامل العلاجي في الدراسة وتحقيق الإجراءات التالية. وترد تفاصيل الخطوات المتخذة في نقاط زمنية أخرى في إطار الفرع المقابل.

  1. الليزر دوبلر التسريب التصوير
    1. إزالة الشعر من كل من الأطراف الخلفية قبل يوم واحد من التحليل باستخدام حلاقة كهربائية تليها كريم مزيل الشعر.
    2. تخدير الفئران باستخدام محلول التخدير.
    3. ضع الحيوان على وسادة تدفئة بزاوية 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق لضمان عدم تغير درجة الحرارة أثناء الإجراء
    4. وضع الحيوان في موقف supine مع الساقين المضمون في موقف موسع. قياس المسافة بين الساقين والقدمين اليمنى واليسرى لكل الحيوان منذ تحديد المواقع من الحيوان يجب أن تكون مماثلة كلما كان الإجراء يجب أن تتكرر من أجل متابعة التغييرات في التسريب الخلفي مع مرور الوقت.
    5. بدء الحصول على البيانات باستخدام الليزر دوبلر perfusion الصور.
    6. بعد الانتهاء من عملية الشراء، أعد التخدير مع الحل المضاد للمهدئات.
    7. افتح برنامج تحليل الصورة وارسم المنطقة ذات الأهمية (ROI) حول الطرف الخلفي الإقفاري وعائد استثمار مماثل حول الطرف الخلفي غير الإقفاري.
    8. مراقبة قيم التدفق وتحديد التسريب كنسبة من التسريب في الطرف الإقفاري إلى ذلك في الطرف غير الإقفاري. وتقاس التغيرات في نسبة التسريب مع مرور الوقت.
  2. الكيمياء المناعية وتحليل الكثافة الشعرية
    1. بعد التخدير، التضحية الفئران عن طريق خلع عنق الرحم.
    2. لحصاد العضلات المعدية المعدية لكلا الساقين، أولا، إزالة الجلد من كل من الأطراف الخلفية.
    3. حدد وتر أخيل وفصل الوتر عن العظام باستخدام مشرط 11 شفرة.
    4. عقد وتر أخيل وفصل العضلات من الساق والفيبولا حتى مفصل الركبة مع مقص الربيع.
    5. فصل العضلة ذات الرأسين femoris من العضلات المعدة.
    6. استخدام مقص الربيع لقطع الإدراج من العضلات المعدية في الركبة على مستوى مفصل الركبة.
    7. ضع عضلات الجهاز الهضمي المقطوعة في اتجاه عرضي على قرص فلين صغير بمساعدة 10٪ تراغاكانث.
    8. المفاجئة تجميد العينات في isopentane السائلة المبردة النيتروجين وتخزينها في -80 درجة مئوية حتى تقسيم.
    9. قطع 7 أقسام ميكرومتر من عينات العضلات على cryostat وجبل على الشرائح الزجاجية.
      ملاحظة: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتاً هنا.
    10. إصلاح الشرائح الزجاجية في زجاجة تحتوي على الأسيتون النقي المبرد (حوالي 50 مل) لمدة 10 دقائق، عند -20 درجة مئوية.
    11. إضافة بيروكسيداز الهيدروجين 0.3٪ المخفف في الميثانول (50 مل) لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
    12. يغسل مرتين في الفوسفات المخزنة المالحة (PBS) (50 مل) لما مجموعه 10 دقيقة.
    13. استخدام القلم الكاره للماء حول الأقسام.
      ملاحظة: يسمح استخدام قلم كارهوي لتقليل مقدار الحلول التي تم إنفاقها أثناء البروتوكول. لجميع الحضانة استخدام 100 € L من جميع الحلول، لكل قسم.
    14. تطبيق حل حجب من مصل الأرنب 5٪ في PBS لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
    15. احتضان العينات لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة مع المضادة CD31 الفئران الأجسام المضادة أحادية النسيلة المخففة في 1:500 في 1٪ ألبوم المصل البقري (BSA) في PBS.
    16. اغسل ثلاث مرات في PBS لما مجموعه 30 دقيقة.
    17. إضافة أرنب ثانوي مضاد للفئران IgG في 1:200 في 1٪ BSA في PBS و 5٪ مصل الأرنب لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
    18. غسل في PBS كما كان من قبل وإضافة المسمى avidin--مترافق مجمع بيروكسيداز لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
    19. شطف 3 مرات في PBS لمدة 5 دقائق وإضافة diaminobenzidine (DAB) بيروكسيداز الركيزة عدة لمدة 5 دقائق أخرى.
    20. مضاد وصمة عار المقاطع مع هيماتوإكسلين لمدة 10 ثوان قبل تصاعد.
    21. قياس الكثافات الشعرية باستخدام مجهر مشرق تستقيم (أي عدد من الشعيرات الدموية لكل عدد من الخلايا العضلية) في 2 أقسام مختلفة من 4 مناطق تشريحية متميزة في كل عينة.
  3. وكيل التباين التسريب
    1. تخدير الفئران باستخدام محلول التخدير.
    2. إجراء عملية استئصال البطن المتوسطة باستخدام شفرة مشرط رقم 15.
    3. كشف الشريان الأبهر البطني والوريد الكسي، بعد التراجع أفقيا الأمعاء الدقيقة واستخدام مقص الربيع.
    4. أدخل قسطرة من عيار 26 في الأبهر البطني وأخرى في الوريد الكُدفي في نفس الاتجاه.
    5. القسطرة الآمنة في مكان باستخدام خياطة الحرير 5/0 لإجراء خياطة البقاء.
    6. غسل نظام الأوعية الدموية مع محلول ملحي 37 درجة مئوية تحتوي على الهيبارين (500 وحدة / 100 مل) دفعت في الشريان الأبهر البطني باستخدام حقنة 10 مل. استمر في التسريب اللطيف حتى يُرى حل واضح يخرج من القسطرة الموضوعة داخل الوريد الكُدَي.
      ملاحظة: عادة ما تكون هناك حاجة إلى 30 إلى 40 مل من محلول ملحي مملح مُعَرَّب لشطف نظام الأوعية الدموية للجرذ البالغ.
    7. إدارة خليط من الأدينوزين (1 ملغ / لتر) وبابافيرين (4 ملغ / لتر) لمدة 2 دقيقة.
    8. حقن في القسطرة الأبهرية 10 مل من خليط من كبريتات الباريوم 50٪ و الجيلاتين 5٪.
      ملاحظة: يجب الاحتفاظ بالحل عند 60 درجة مئوية لتجنب سماكة.
    9. ترك الفئران في - 4 درجة مئوية لمدة 4 ساعة على الأقل، من أجل السماح يلقي الأوعية الدموية لتترسخ.
    10. إزالة الجلد من الجزء السفلي من الجسم من كل ماوس.
  4. ديافونيأيشن - تقنية سالتهولز
    1. إصلاح الفئران عن طريق الغمر في محلول الفورمالديهايد 10٪ لمدة 72 ساعة على الأقل.
    2. تبييض الفئران عن طريق الغمر في محلول بيروكسيد الهيدروجين 30٪ لمدة 24 ساعة.
    3. تجفيف الفئران باستخدام تقنية استبدال التجميد. تتكون هذه المنهجية من تقديم الفئران إلى الممرات المتعاقبة (في المتوسط أربعة) من الأسيتون النقي في - 20 درجة مئوية لمدة 24 ساعة لكل منهما.
    4. توضيح الفئران عن طريق غمرها في حل يحتوي على خليط من بنزوات البنزيل 100٪ و 100٪ من الساليسيلات الميثيل في نسبة 3:5 (ويعرف هذا الخليط أيضا باسم حل Spalteholz) 13.
    5. ترك الفئران مغمورة في الحل Spalteholz داخل في غرفة فراغ حتى يصبح diaphanous، والذي عادة ما يستغرق 5 إلى 7 أيام.
    6. استبدال الحل، إذا أصبح الظلام قبل أن تصبح العينة واضحة.
  5. تقدير كمية السفن الجانبية
    1. مراقبة الفئران علقت في حل Spalteholz تحت الإضاءة باستخدام مجهر مجسم. استخدام ملقط الجراحة المجهرية لفهم بلطف وتحريكه.
    2. تصوير الأطراف بأكملها باستخدام كاميرا رقمية متصلة بالمجهر.
    3. الحصول على صور الأطراف بأكملها باستخدام البرنامج المناسب.
    4. إجراء تجزئة يدوية للسفن الجانبية من خلال تسليط الضوء عليها باستخدام البرامج المناسبة.
      ملاحظة: يتم تعريف الأوعية الجانبية وفقا لتعريف لونغلاند، الجذعية المحددة، ومنتصف المنطقة، والوافد يناح مرة أخرى، مع قطر يتراوح بين 20 و 300 ميكرومتر، باستثناء الشرايين الفخذية والسافينوية والبوبليتيال وجميع الهياكل الوريدية.
    5. قم بتعريف ROIs في كل ماوس في نفس المنطقة التشريحية في المُتَوَكِّب، المحيط وتحت الانسداد الجراحي.
    6. تحديد كثافة الأوعية الجانبية (CVD) في ما يعادل ROIs المقابلة لـ 20% من إجمالي مساحة الأطراف. يتم حساب CVD كنسبة بين منطقة الأوعية الدموية ومناطق ROIs. يتم تنفيذ كافة قياسات الكثافة باستخدام برنامج ImageJ.
      ملاحظة: من المفترض أن تكون قيمة CVD للأطراف غير الإقفارية لكل فأرة متوافقة مع 100% لاستبعاد الاختلافات في إجراءات التشريح أو التسريب أو التسريب. وبالتالي، كانت النسبة المئوية للـ CVD في الطرف الإقفاري محسوبة بالنسبة إلى الشخص غير الإقفاري.
    7. تحديد النسبة المئوية لزيادة CVD كالفرق بين نسبة CVD بين الأطراف الإقفارية وغير الإقفارية.
  6. التقاط الليزر microdissection من الشعيرات الدموية
    1. بعد التخدير، التضحية الفئران عن طريق خلع عنق الرحم.
    2. لحصاد العضلات المعدية المعدية لكلا الساقين، وإزالة الجلد من الفئران على حد سواء الأطراف الخلفية.
    3. حدد وتر أخيل وفصل الوتر عن العظام باستخدام مشرط 11 شفرة.
    4. عقد وتر أخيل وفصل العضلات من الساق والفيبولا حتى مفصل الركبة مع مقص الربيع.
    5. فصل العضلة ذات الرأسين femoris من العضلات المعدة.
    6. استخدام مقص الربيع لقطع الإدراج من العضلات المعدية في الركبة على مستوى مفصل الركبة.
    7. ضع عضلات الجهاز الهضمي المقطوعة في اتجاه عرضي على قرص فلين صغير بمساعدة 10٪ تراغاكانث.
    8. المفاجئة تجميد العينات في isopentane السائلة المبردة النيتروجين وتخزينها في -80 درجة مئوية حتى تقسيم.
    9. قطع على cryostat 12 أقسام ميكرومتر من عينات العضلات وجبل على الشرائح الزجاجية.
      ملاحظة: لحماية RNA تأخذ شريحة تبريدها مسبقا ولمس الجانب الخلفي من الشريحة بإصبعك (قفازات) لتدفئة المنطقة فقط لوضع القسم. نقل القسم من سكين cryostat عن طريق لمس مع منطقة دافئة وجافة في -20 درجة مئوية في cryostat لمدة 2-3 دقيقة. يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتاً هنا.
      1. إصلاح الشرائح الزجاجية في زجاجة تحتوي على الأسيتون النقي المبرد (حوالي 50 مل) لمدة 5 دقائق عند -20 درجة مئوية وتجفيف الهواء لهم.
      2. استخدام القلم الكاره للماء حول الأقسام.
        ملاحظة: يساعد استخدام القلم الكاره للماء في تقليل مقدار الحلول التي تم إنفاقها أثناء البروتوكول. لجميع الحضانة استخدام 100 € L من جميع الحلول، لكل قسم.
      3. إعادة ترطيب مع 2 M NaCl / PBS في 4 درجة مئوية واحتضان العينات بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية مع المضادة للCD31 الفئران الأجسام المضادة أحادية النسيلة في 1:500 في 2M NaCl / PBS.
      4. غسل مرتين في 2M NaCl / PBS لما مجموعه 6 دقائق.
      5. إضافة أرنب ثانوي مضاد للفئران IgG في 1:200 في 2M NaCl /PBS و 5٪ مصل الأرنب لمدة 30 دقيقة عند 4 درجة مئوية.
      6. غسل في 2 M NaCl / PBS كما كان من قبل وإضافة المسمى مجمع بيروكسيداز أفيديدات المترافق avidin لمدة 30 دقيقة في 4 درجة مئوية.
      7. شطف وإضافة DAB بيروكسيداز الركيزة عدة لمدة 5 دقائق.
      8. تجفيف المقاطع في الجليد البارد90٪ الإيثانول تليها 100٪ الإيثانول وتركها لتجف.
      9. تشريح 10 000 الشعيرات الدموية لكل الفئران باستخدام نظام microdissection الليزر مجهزة بالليزر نبضت الحالة الصلبة 355 نانومتر الليزر والمنجنيق الشعيرات الدموية تشريح في أنبوب microfuge لاصقة كاب.
  7. استخراج الحمض النووي الريبي، تخليق cDNA، ما قبل التضخيم، وRT-PCR
    1. عزل الجيش الملكي النيبالي الكلي من الشعيرات الدموية microdissected باستخدام مجموعة مناسبة، ومجموع الحمض النووي الريبي التي تم الحصول عليها بين 1.5-3 نانوغرام / ميكرولتر.
    2. استخدام مجموعة توليف cDNA للتوليف وجولتين من ما قبل التضخيم، وذلك باستخدام المواد التمهيدية الموصوفة في الجدول1.
    3. تنفيذ RT-PCR لنفس الأهداف الموضحة في الخطوة السابقة. استخدام برنامج يتكون من خطوة denaturation الأولية في 95 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة، تليها 50 دورات في 95 درجة مئوية لمدة 15 ق و60 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

باستخدام البروتوكول الموصوف، تم اختبار الخلايا الجذعية mesenchymal الحبل السري والإشعاع المؤين جرعة منخفضة (LDIR) كعلاجات الأوعية المفترضة 11،12. تم الحصول على قراءات التسريب دوبلر الليزر قبل الحث نقص التروية وفي نقاط زمنية محددة مسبقا تتراوح من مباشرة بعد الحث نقص التروية إلى 45 يوما بعد نقص التروية. تم تسجيل قراءات التسريب الأنسجة بواسطة دوبلر الليزر كصور مرمزة بالألوان، مع عدم عرض التسريب باللون الأزرق الداكن وأعلى مستوى التسريب المعروض باللون الأحمر.  كما هو ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

وقد تألفت نماذج Murine من CLI في الغالب في ربط الشريان الفخذي فقط القاصي إلى أصل profunda femoris 4,5,6,7,8,9. وقد تبين أن هذا ترك معظم الدورة الدموية الجانبية سليمة، مما يعيد تدفق الدم إلى الطرف في غضون 7 أيام 9. يمكن إزالة السرير الجانبي عن طريق استئصال الشريان الفخذي. ومع ذلك، يمكن استعادة ما يصل إل...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

ونشكر خوسيه رينو وتانيا كارفالهو، رئيسي مرفق التصوير البيولوجي ومختبر علم الأنسجة وعلم الأمراض المقارنة التابع لمعهد الطب الجزيئي جواو لوبو أنتونس، على التوالي. ونشكر أيضا فياتشيسلاف سوشيك من قسم التشريح في كلية نوفا الطبية/فاكولادي دي سيانسياس ميديكاس، جامعة نوفا دي ليسبوا.

مرجع التمويل: مشروع ممول من UID/IC/0306/2016 Fundação para a Ciência e a Tecnologia. وتدعم بولا دي أوليفيرا زمالة (SFRH/BD/80483/2011) من مؤسسة المأكولات الخاصة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
7500 سريع في الوقت الحقيقي PCRأداة النظم
المطبقة كاشف الأسيتونميرك1000141000؛ تحذير -
كاشفالأدينوزينفالديفارم
الاشتعال أتيباميزولأوريونكاشف فارما
كبريتات الباريوم (ميكروباك)جيبرت8671404 (المرجع المزروع)كاشف
بوبرينورفينريختركاشف فارما
كارل زايس Opmi-1 FC مجهرجراحي كارل زايس المجهر المجهري ، ألمانياأداة
cDNA RT2 PreAMP cDNA Synthesis KitQiagen7335730كاشف
Cryostat Leica CMLeica Microsystems3050SInstrument
DAB بيروكسيداز الركيزةطقم DAKO ؛ مختبرات ناقلاتK3468كاشف
الهيدروجين بيروكسيدازميرك1072090250كاشف ؛ تحذير - قلم nocif
مسعوركاشف داكو411121؛ تحذير - سام
KetamidorRichterpharmaCN: 580393،7 630/01/12 Dfvfكاشف
ليزر دوبلر نضح تصوير مستنقع مورLDI2-HIRMoorLDI-V6.0 ، مور إنسترومنتس المحدودة ، أكسمنستر ، المملكة المتحدة5710أداة
Leica DM2500 تستقيم مجهر لايكامايكروسيستمزأداة
MedetorVirbac037/01/07RFVPTالكاشف
الميثانولVWRUN1230؛ تحذير - كاشف
PapaverineLabesfal
Pentano IssoMerkكاشف 1060561000؛ تحذير - قوة SYBR & reg شديدة الاشتعال
؛ GreenApplied Biosystems4309155كاشف
الفئران المنقى المضاد للفأر CD31كاشف550274Pharmingen
RNeasy Micro kitQiagen74004الكاشف
Surgic-Pro 6.0Medtronic (Coviden)VP733Xخياطة
VECTASTAIN ABC HRP KIT (PEROXIDASE ، RAT IgG) مجموعةVectastain ABC ؛ مختبرات ناقلاتPK-4004كاشف
Vicryl5.0 / Vicryl 6.0Medtronic (Covidien)UL202 / UL101خياطة
Zeiss PALM MicroBeam نظام التشريح المجهري بالليزركارل زايس المجهر ، ألمانيا1023290916أداة
مجهر تجسيميكارل زايس المجهر ، ألمانياأداة
كاميرارقمية لينكسماعون
الحيوية شديد كاشف السام والقابل للاشتعال

المراجع

  1. Becker, F., et al. Chapter I: Definitions, epidemiology, clinical presentation and prognosis. European Journal of Vascular and Endovascular Surgery. 42 Suppl 2, S4-S12 (2011).
  2. Fowkes, F. G., et al. Peripheral artery disease: epidemiology and global perspectives. Nature Reviews Cardiology. 14 (3), 156-170 (2017).
  3. Abu Dabrh, A. M., et al. The natural history of untreated severe or critical limb ischemia. Journal of Vascular Surgery. 62 (6), 1642-1651 (2015).
  4. Lejay, A., et al. A new murine model of sustainable and durable chronic critical limb ischemia fairly mimicking human pathology. European Journal of Vascular and Endovascular Surgery. 49 (2), 205-212 (2015).
  5. Sprengers, R. W., Lips, D. J., Moll, F. L., Verhaar, M. C. Progenitor cell therapy in patients with critical limb ischemia without surgical options. Annals of Surgery. 247 (3), 411-420 (2008).
  6. Lotfi, S., et al. Towards a more relevant hind limb model of muscle ischaemia. Atherosclerosis. 227 (1), 1-8 (2013).
  7. Masaki, I., et al. Angiogenic gene therapy for experimental critical limb ischemia: acceleration of limb loss by overexpression of vascular endothelial growth factor 165 but not of fibroblast growth factor-2. Circulation Research. 90 (9), 966-973 (2002).
  8. Limbourg, A., et al. Evaluation of postnatal arteriogenesis and angiogenesis in a mouse model of hind-limb ischemia. Nature Protocols. 4 (12), 1737-1746 (2009).
  9. Hellingman, A. A., et al. Variations in surgical procedures for hind limb ischaemia mouse models result in differences in collateral formation. European Journal of Vascular and Endovascular Surgery. 40 (6), 796-803 (2010).
  10. Brevetti, L. S., et al. Exercise-induced hyperemia unmasks regional blood flow deficit in experimental hindlimb ischemia. Journal of Surgical Research. 98 (1), 21-26 (2001).
  11. Ministro, A., et al. Low-dose ionizing radiation induces therapeutic neovascularization in a pre-clinical model of hindlimb ischemia. Cardiovascular Research. 113 (7), 783-794 (2017).
  12. Pereira, A. R., et al. Therapeutic angiogenesis induced by human umbilical cord tissue-derived mesenchymal stromal cells in a murine model of hindlimb ischemia. Stem Cell Research Therapy. 7 (1), 145(2016).
  13. Azaripour, A., et al. A survey of clearing techniques for 3D imaging of tissues with special reference to connective tissue. Progress in Histochemistry and Cytochemistry. 51 (2), 9-23 (2016).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

RT PCR CD31

مقالات ذات صلة