هنا، يتم تقديم نموذج تجريبي نقص التروية الخلفية الحرجة تليها بطارية من الاختبارات الوظيفية والأنسجة والجزيئية لتقييم فعالية العلاجات الوعائية.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
تقييم تكوين الأوعية العلاجية في نموذج مورين من نقص التروية الخلفية
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
نقص تروية الأطراف الحرجة (CLI) هو حالة خطيرة تنطوي على مخاطر عالية من بتر الأطراف السفلية. على الرغم من إعادة الأوعية الدموية كونها العلاج الذهب القياسية، وعدد كبير من المرضى CLI ليست مناسبة لإعادة الأوعية الدموية الجراحية أو داخل الأوعية الدموية. تظهر العلاجات الوعائية كخيار لهؤلاء المرضى ولكنلا حاليا قيد التحقيق. قبل التطبيق في البشر، يجب اختبار هذه العلاجات في النماذج الحيوانية ويجب أن تكون آلياتها مفهومة بوضوح. وقد تم تطوير نموذج حيواني من نقص التروية الخلفية (HLI) عن طريق ربط وختان الشرايين والأوردة الحرقفية الخارجية البعيدة في الفئران. تم تجميع فريق شامل من الاختبارات لتقييم آثار نقص التروية والعلاجات الوعائية المفترضة على المستويات الوظيفية والأنسجة والجزيئية. تم استخدام دوبلر الليزر لقياس التدفق والتقييم الوظيفي للتسريب. تم تقييم استجابة الأنسجة من خلال تحليل الكثافة الشعرية بعد تلطيخ مع الأجسام المضادة CD31 على المقاطع النسيجية من العضلات المعدية وعن طريق قياس كثافة الأوعية الجانبية بعد diaphonization. تم تحديد التعبير عن الجينات الوعائية من قبل RT-PCR التي تستهدف عوامل وعائية مختارة حصرا في الخلايا البطانية (ECs) بعد التقاط الليزر microdissection من العضلات الجهاز الهضمي الفئران. وكانت هذه الأساليب حساسة في تحديد الاختلافات بين الأطراف الإقفارية وغير الإقفارية وبين الأطراف المعالجة والأطراف غير المعالجة. ويوفر هذا البروتوكول نموذجاً للنسخ من CLI وإطاراً لاختبار العلاجات الوعائية.
المقدمة
يؤثر مرض الشرايين المحيطية (PAD) في الغالب على الأطراف السفلية. يحدث مرض التصلب المتعدد بسبب تصلب الشرايين، وهو انسداد في الشريان يمكن أن يسبب تقييدًا شديدًا لتدفق الدم في الأطراف السفلية1. العرج المتقطع هو أول مظهر من مظاهر PAD ويشير إلى ألم العضلات عند المشي. CLI هي المرحلة الأكثر شدة من PAD، ويجري تشخيصها في المرضى التي تظهر آلام الراحة الإقفارية، والقرحة أو الغرغرينا2. المرضى الذين يعانون من CLI لديهم خطر كبير من بتر، وخاصة إذا لم يعالج3. إعادة الأوعية الدموية في الأطراف السفلية (إما عن طريق الجراحة المفتوحة أو إجراء داخل الأوعية الدموية) هي حاليا الطريقة الوحيدة لتحقيق إنقاذ الأطراف. ومع ذلك،....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
جميع الإجراءات الحيوانية تتفق مع التوجيه 2010/63/EU وقد تمت الموافقة عليها من قبل الهيئة المؤسسية لرعاية الحيوان ومرخصة من قبل DGAV، الهيئة البرتغالية المختصة لحماية الحيوان (رقم الترخيص 023861/2013)
تحذير: العديد من المواد الكيميائية المستخدمة في البروتوكولات سامة وضارة. يرجى استخدام جميع ممارسات السلامة المناسبة ومعدات الحماية الشخصية (القفازات، معطف المختبر، السراويل كاملة الطول، والأحذية المغلقة اصبع القدم)
1. نموذج مورين من نقص التروية الخلفية
ملاحظة: يتم إجراء جميع التجارب على الفئران الإناث C57BL/6 البالغة من العمر 22 أسبوعًا.
- إعداد الحلول
- <....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
باستخدام البروتوكول الموصوف، تم اختبار الخلايا الجذعية mesenchymal الحبل السري والإشعاع المؤين جرعة منخفضة (LDIR) كعلاجات الأوعية المفترضة 11،12. تم الحصول على قراءات التسريب دوبلر الليزر قبل الحث نقص التروية وفي نقاط زمنية محددة مسبقا تتراوح من مباشرة بعد الحث نقص التروية إلى 45 يوما بعد نقص التروية. تم تسجيل قراءات التسريب الأنسجة بواسطة دوبلر الليزر كصور مرمزة بالألوان، مع عدم عرض التسريب باللون الأزرق الداكن وأعلى مستوى التسريب المعروض باللون الأحمر. كما هو .......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
وقد تألفت نماذج Murine من CLI في الغالب في ربط الشريان الفخذي فقط القاصي إلى أصل profunda femoris 4,5,6,7,8,9. وقد تبين أن هذا ترك معظم الدورة الدموية الجانبية سليمة، مما يعيد تدفق الدم إلى الطرف في غضون 7 أيام 9. يمكن إزالة السرير الجانبي عن طريق استئصال الشريان الفخذي. ومع ذلك، يمكن استعادة ما يصل إل.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.
شكر وتقدير
ونشكر خوسيه رينو وتانيا كارفالهو، رئيسي مرفق التصوير البيولوجي ومختبر علم الأنسجة وعلم الأمراض المقارنة التابع لمعهد الطب الجزيئي جواو لوبو أنتونس، على التوالي. ونشكر أيضا فياتشيسلاف سوشيك من قسم التشريح في كلية نوفا الطبية/فاكولادي دي سيانسياس ميديكاس، جامعة نوفا دي ليسبوا.
مرجع التمويل: مشروع ممول من UID/IC/0306/2016 Fundação para a Ciência e a Tecnologia. وتدعم بولا دي أوليفيرا زمالة (SFRH/BD/80483/2011) من مؤسسة المأكولات الخاصة.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| 7500 سريع في الوقت الحقيقي PCR | أداة النظم | ||
| المطبقة كاشف الأسيتون | ميرك | 1000141000 | ؛ تحذير - |
| كاشف | الأدينوزين | فالديفارم | |
| الاشتعال أتيباميزول | أوريونكاشف فارما | ||
| كبريتات الباريوم (ميكروباك) | جيبرت | 8671404 (المرجع المزروع) | كاشف |
| بوبرينورفين | ريختركاشف فارما | ||
| كارل زايس Opmi-1 FC مجهر | جراحي كارل زايس المجهر المجهري ، ألمانيا | أداة | |
| cDNA RT2 PreAMP cDNA Synthesis Kit | Qiagen | 7335730 | كاشف |
| Cryostat Leica CM | Leica Microsystems | 3050S | Instrument |
| DAB بيروكسيداز الركيزة | طقم DAKO ؛ مختبرات ناقلات | K3468 | كاشف |
| الهيدروجين بيروكسيداز | ميرك | 1072090250 | كاشف ؛ تحذير - قلم nocif |
| مسعور | كاشف داكو | 411121 | ؛ تحذير - سام |
| Ketamidor | Richterpharma | CN: 580393،7 630/01/12 Dfvf | كاشف |
| ليزر دوبلر نضح تصوير مستنقع مورLDI2-HIR | MoorLDI-V6.0 ، مور إنسترومنتس المحدودة ، أكسمنستر ، المملكة المتحدة | 5710 | أداة |
| Leica DM2500 تستقيم مجهر لايكا | مايكروسيستمز | أداة | |
| Medetor | Virbac | 037/01/07RFVPT | الكاشف |
| الميثانول | VWR | UN1230 | ؛ تحذير - كاشف |
| Papaverine | Labesfal | ||
| Pentano Isso | Merk | كاشف 1060561000 | ؛ تحذير - قوة SYBR & reg شديدة الاشتعال |
| ؛ Green | Applied Biosystems | 4309155 | كاشف |
| الفئران المنقى المضاد للفأر CD31 | كاشف | 550274 | Pharmingen |
| RNeasy Micro kit | Qiagen | 74004 | الكاشف |
| Surgic-Pro 6.0 | Medtronic (Coviden) | VP733X | خياطة |
| VECTASTAIN ABC HRP KIT (PEROXIDASE ، RAT IgG) مجموعة | Vectastain ABC ؛ مختبرات ناقلات | PK-4004 | كاشف |
| Vicryl5.0 / Vicryl 6.0 | Medtronic (Covidien) | UL202 / UL101 | خياطة |
| Zeiss PALM MicroBeam نظام التشريح المجهري بالليزر | كارل زايس المجهر ، ألمانيا | 1023290916 | أداة |
| مجهر تجسيمي | كارل زايس المجهر ، ألمانيا | أداة | |
| كاميرا | رقمية لينكس | ماعون |
المراجع
- Becker, F., et al. Chapter I: Definitions, epidemiology, clinical presentation and prognosis. European Journal of Vascular and Endovascular Surgery. 42 Suppl 2, S4-S12 (2011).
- Fowkes, F. G., et al. Per....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
