مقالة منهجية

يبحث إلى الخارج: عزل البوليمرات الكربوهيدرات السيانوبكتيرية المفرج عنها والبروتينات

DOI:

10.3791/59590

⸱

مايو 27, 2019

 , 
1Bioengineering and Synthetic Microbiology Group, Instituto de Investigação e Inovação em Saude, Universidade do Porto, 2Instituto de Biologia Celular e Molecular, Universidade do Porto, 3Instituto de Ciências Biomédicas Abel Salazar, 4Departamento de Biologia, Faculdade de Ciências, Universidade do Porto

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا ، يتم وصف بروتوكولات لعزل البوليمرات الكربوهيدرات الطاردة السماوية وعزل exoproteomes الخاصة بهم. ويجسد كلا الإجراءين خطوات رئيسية للحصول على البوليمرات أو البروتينات ذات درجات النقاء العالية التي يمكن استخدامها لمزيد من التحليل أو التطبيقات. ويمكن أيضا تكييفها بسهولة وفقا لاحتياجات المستخدم محددة.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يمكن أن تفرز البكتيريا السماوية بنشاط مجموعة واسعة من الجزيئات الحيوية في البيئة خارج الخلية، مثل السكريات غير المتجانسة والبروتينات. يمكن لتحديد وتوصيف هذه الجزيئات الحيوية تحسين المعرفة حول مسارات إفرازها وتساعد على التلاعب بها. وعلاوة على ذلك، فإن بعض هذه الجزيئات الحيوية مثيرة للاهتمام أيضا من حيث تطبيقات التكنولوجيا الحيوية. هنا اثنين من بروتوكولات العزل السهل والسريع للبوليمرات الكربوهيدرات المنكتيرية المفرج عنها والبروتينات. وتستند طريقة عزل البوليمرات الكربوهيدرات الصادرة على تقنيات هطول الأمطار التقليدية من السكريات في الحلول المائية باستخدام المذيبات العضوية. تحافظ هذه الطريقة على خصائص البوليمر وتتجنب في الوقت نفسه وجود الملوثات من حطام الخلايا والثقافة المتوسطة. في نهاية العملية، البوليمر الليوفيل على استعداد لاستخدامها أو وصفها أو يمكن أن تخضع لجولات أخرى من تنقية، اعتمادا على الاستخدام النهائي المقصود. وفيما يتعلق بعزل الإكسبروتيوم السيانوبكتيري، تقوم هذه التقنية على تركيز الوسيط الخالي من الخلايا بعد إزالة الملوثات الرئيسية عن طريق الطرد المركزي والترشيح. تسمح هذه الاستراتيجية لعزل موثوق بها من البروتينات التي تصل إلى الوسط خارج الخلية عن طريق ناقلات الغشاء أو الحويصلات الغشاء الخارجي. ويمكن تحديد هذه البروتينات في وقت لاحق باستخدام تقنيات قياس الطيف الكتلي القياسية. البروتوكولات المعروضة هنا يمكن تطبيقها ليس فقط على مجموعة واسعة من البكتيريا السماوية، ولكن أيضا على سلالات البكتيرية الأخرى. وعلاوة على ذلك، يمكن أن تكون هذه الإجراءات مصممة بسهولة وفقا للاستخدام النهائي للمنتجات، ودرجة النقاء المطلوبة، والإجهاد البكتيري.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ومن المسلم به على نطاق واسع البكتيريا السماوية كمصادر وافرة من المنتجات الطبيعية مع التطبيقات الواعدة للتكنولوجيا الحيوية / الطبية الحيوية. ولذلك، فهم آليات إفراز السيانوبكتيرية وتحسين أساليب الاستخراج / الاستعادة ضرورية لتنفيذ البكتيريا السماوية كمصانع الخلايا الميكروبية فعالة.

العديد من سلالات الخلايا القادرة على إنتاج المواد البوليمرية خارج الخلية (EPS)، التي شكلت أساسا من قبل السكريات heteropolysacrides، التي لا تزال مرتبطة سطح الخلية أو يتم تحريرها في المتوسط1. هذه البوليمرات الكربوهيدرات الصادرة لها ميزات متميزة بالمقارنة مع تلك التي من البكتيريا الأخرى، والتيتجعلها مناسبة لمجموعة واسعة من التطبيقات (على سبيل المثال، مضادات الفيروسات 2، المحفزات المناعية3،مضادات الأكسدة4، المعادن- تلاوة5،استحلاب6،ووكلاء تسليم المخدرات7،8). منهجية لعزل هذه البوليمرات يساهم إلى حد كبير ليس فقط لتحسين الغلة ولكن أيضا لزيادة النقاء والخصائص الفيزيائية المحددة للبوليمر التي تم الحصول عليها9. الغالبية العظمى من هذه الأساليب لعزل البوليمرات تعتمد على استراتيجيات هطول الأمطار من وسط الثقافة التي يتم إنجازها بسهولة بسبب طبيعة البوليمر الأيونية القوية9،10. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن أن يتحقق بسرعة إزالة المذيبات المستخدمة في خطوة هطول الأمطار عن طريق التبخر و / أو الليونفيلية. اعتمادا على التطبيق المتوقع، يمكن أن يقترن خطوات مختلفة إما بعد أو قبل هطول الأمطار البوليمر من أجل تكييف المنتج النهائي، والتي تشمل حمض ثلاثي كلور والخليك (TCA) العلاج، والترشيح، أو حجم استبعاد اللونية (SEC) تنقية العمود10.

البكتيريا السماوية هي أيضا قادرة على إفراز مجموعة واسعة من البروتينات من خلال مسارات تعتمد على ناقلات الغشاء (الكلاسيكية)11 أو بوساطة الحويصلات (غير الكلاسيكية)12. ولذلك، فإن تحليل exoproteome سيانوبكتيريك يشكل أداة أساسية، سواء لفهم / التلاعب آليات إفراز البروتين السماوي وفهم وظيفة محددة خارج الخلية من هذه البروتينات. العزلة الموثوقة وتحليل exoproteomes تتطلب تركيز الوسط خارج الخلية، لأن وفرة البروتينات التفرز منخفضة نسبيا. بالإضافة إلى ذلك، قد تعمل الخطوات الفيزيائية أو الكيميائية الأخرى (مثل الطرد المركزي أو الترشيح أو هطول الأمطار البروتيني) على تحسين نوعية exoproteome التي تم الحصول عليها، مما يثري محتوى البروتين13،ويتجنب وجود الملوثات (على سبيل المثال، أصباغ، والكربوهيدرات،الخ.) 14 سنة , 15 أو غلبة البروتينات داخل الخلايا في العينات. ومع ذلك، قد تقيد بعض هذه الخطوات أيضًا مجموعة البروتينات التي يمكن اكتشافها، مما يؤدي إلى تحليل متحيز.

يصف هذا العمل بروتوكولات فعالة لعزل البوليمرات الكربوهيدرات الصادرة وexoproteomes من وسائل الإعلام ثقافة السيانوبكتريا. ويمكن تكييف هذه البروتوكولات بسهولة مع الأهداف المحددة للدراسة واحتياجات المستعملين، مع الحفاظ على الخطوات الأساسية المعروضة هنا.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. السماوية أطلقت الكربوهيدرات البوليمر العزلة

  1. عزل البوليمر وإزالة الملوثات
    1. زراعة سلالة السيانوبكتيرية في ظل ظروف قياسية [على سبيل المثال، 30 درجة مئوية تحت ضوء 12 ساعة (50 درجة مئويةم −2ق −1)/12 ح نظام الظلام، مع اهتزاز المداري في 150 دورة في الدقيقة]. قياس النمو باستخدام بروتوكولات قياسية [على سبيل المثال، الكثافة البصرية في 730 نانومتر (OD730nm)،الكلوروفيل أ، الوزن الجاف، وما إلى ذلك]، ثم قياس إنتاج السكريات الصادرة وفقا لطريقة حمض الفينول الكبريتيك16.
    2. نقل الثقافة إلى أغشية غسيل الكلى (12-14 kDa من قطع الوزن الجزيئي) وdialyze ضد ما لا يقل عن 10 مجلدات من الماء منزوع الأيونات لمدة 24 ساعة مع التحريك المستمر.
      ملاحظة: اعتمادا على حجم الثقافة إلى dialyze وتكوين المتوسطة، قد يكون من الضروري تغيير مياه غسيل الكلى.
    3. طرد مركزي للثقافة في 15،000 × ز لمدة 15 دقيقة في 4 درجة مئوية. نقل supernatant إلى قارورة جديدة وتجاهل بيليه (الخلايا).
    4. الطرد المركزي مرة أخرى في 20،000 × ز لمدة 15 دقيقة في 4 درجة مئوية لإزالة الملوثات مثل الحطام جدار الخلية أو lipopolysaccharides (LPS).
    5. نقل supernatant إلى كوب زجاجي وتجاهل بيليه.
  2. هطول الأمطار من البوليمر
    1. إضافة 2 مجلدات من الإيثانول 96٪ إلى supernatant.
    2. احتضان التعليق في 4 درجة مئوية، على الأقل بين عشية وضحاها.
    3. استعادة البوليمر
      1. بالنسبة للكميات الصغيرة أو غير المرئية من البوليمر المُعجل: الطرد المركزي للتعليق عند 13000 × ز لمدة 25 دقيقة عند درجة حرارة 4 درجة مئوية. تخلص من الـ supernatant وتعليق بيليه في 1 مل أو 2 مل من الماء منزوع الأيونات الأوتوكلاف. نقل تعليق مائي إلى قارورة.
        تحذير: يجب التخلص من supernatant بلطف، كما يمكن أن تصبح إعادة تعليقها بسهولة.
      2. لكميات مرئية / كبيرة من البوليمر عجلت: جمع البوليمر عجلت مع ملقط معدنيمع معقم إلى قارورة. ضغط البوليمر وتجاهل الإيثانول الزائد.
    4. اختياري: اعتمادا على درجة تنقية البوليمر المطلوبة، كرر خطوة هطول الأمطار مع الإيثانول 96٪ بعد إعادة تعليق البوليمرات في الماء منزوع الأيونات.
  3. [ليوفيلأيشن] من البوليمر
    1. الحفاظ على قارورة مع البوليمر عجلت في -80 درجة مئوية، على الأقل بين عشية وضحاها.
    2. تجميد الجافة (lyophilize) البوليمر لمدة 48 ساعة على الأقل (لا تدع تعليق تذويب قبل تجميد التجفيف).
    3. تخزين البوليمر المجفف في درجة حرارة الغرفة (RT) حتى مزيد من الاستخدام.
      ملاحظة: تخزين البوليمر في المجفف من المستحسن، كما أنه يمكن امتصاص المياه مع مرور الوقت.

2. عزل اكسبروتيوم سيانوبكتيريك

  1. تركيز متوسط
    1. زراعة البكتيريا السماوية في ظل ظروف قياسية [على سبيل المثال، 30 درجة مئوية تحت ضوء 12 ساعة (50 μE m−2s −1)/12 h نظام مظلم، مع اهتزاز مداري عند 150 دورة في الدقيقة]. رصد نمو السيانوباكتريوم باستخدام الإجراءات القياسية (على سبيل المثال، OD730nm،الكلوروفيل أ،الوزن الجاف، الخ).
    2. الطرد المركزي الثقافات في 4000 × ز، لمدة 10 دقائق في RT.
    3. نقل supernatant إلى قارورة وتجاهل بيليه الخلية.
    4. قم بتصفية الوسيلة المنكطة من خلال فلتر حجم المسام بـ 0.2 ميكرومتر.
      ملاحظة: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتاً هنا لفترة زمنية قصيرة، إذا تم الاحتفاظ المتوسطة عند 4 درجة مئوية.
    5. تركيز المتوسط ما يقرب من 500x (النظر في الحجم الأولي من المتوسطة المصفاة)، وذلك باستخدام المكثفات الطرد المركزي مع قطع الوزن الجزيئي الاسمي من 3 كيلودا. وينبغي تشغيل الطرد المركزي عند 000 4 x ز (الحد الأقصى 1 ساعة في جولة الطرد المركزي) عند درجة حرارة 15 درجة مئوية.
      تحذير: بالنسبة لغالبية العلامات التجارية المكثفة، يحتاج جهاز التصفية إلى شطف بواسطة الطرد المركزي بالماء النقي جداً قبل الاستخدام. بمجرد أن يكون المرشح رطبًا، لا تدعه يجف. ترك ما يكفي من السوائل على الخزان عندما لا يتم استخدام الجهاز.
      ملاحظة: قد يكون خفض درجة حرارة الطرد المركزي إلى 4 درجة مئوية مفيداً إذا كان الهدف هو دراسة نشاط البروتين، على الرغم من أنه سيزيد من الوقت اللازم لتركيز العينة. يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتاً بين خطوات الطرد المركزي لفترات زمنية قصيرة إذا تم الاحتفاظ بالوسيلة عند درجة حرارة 4 درجة مئوية.
    6. شطف جدران خزان عينة جهاز فلتر مع عينة مركزة ونقل المحتوى إلى أنبوب microcentrifuge.
    7. تنفيذ خطوة غسل إضافية من خزان عينة جهاز فلتر مع وسط الثقافة الأوتوكلاف لضمان الانتعاش exoproteome القصوى.
      ملاحظة: لتحديد النسبة المئوية للاسترداد اتبع إرشادات الشركة المصنعة المحددة.
    8. تخزين عينات exoproteome في -20 درجة مئوية حتى مزيد من الاستخدام.
      ملاحظة: ينصح بإضافة مثبطات البروتياز للتخزين على المدى الطويل.
  2. تحليل من ال [إإكسبروتيوم]
    1. قياس محتوى البروتين عن طريق تحليل البروتين BCA في لوحة 96 جيدا وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
    2. فصل البروتينات التي من قبل الصوديوم دوديسيل كبريتات-بولياكريلاميد هلام الكهربائي (SDS-PAGE)، وذلك باستخدام بروتوكولات تلطيخ القياسية (على سبيل المثال، كوماسي الأزرق، تلطيخ الفضة).
    3. قطع العصابات / هلام المناطق ذات الأهمية وجمعها في أنابيب الطرد المركزي الدقيقة المختلفة التي تحتوي على كميات مناسبة من المياه النقية جدا.
    4. المضي قدما في تحديد وتحليل البروتينات عن طريق قياس الطيف الكتلي.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويرد في الشكل 1تمثيل تخطيطي للطريقة الموصوفة لاستخراج البوليمرات الكربوهيدراتية الصادرة من الثقافات السماوية. البوليمرات المعجّلة من منتج EPS المعتدل سيانوباكتريوم سينشيوسيستينس sp. PCC 6803 ومنتج EPS الفعال Cyanothece sp. CCY 0110 مبين في الشكل 2. في الشكل 3، تظهر البوليمرات الليفيلية بدرجات مختلفة من التلوث ، مما يبرز أهمية خطوات الطرد المركزي لنقاء المنتج النهائي. يصور الشكل 4 طريقة...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لفهم آليات إفراز البكتيريا بشكل أفضل ودراسة المنتجات الصادرة، فمن الأهمية بمكان لإظهار العزلة الفعالة وتحليل الجزيئات الحيوية الموجودة في البيئة البكتيرية خارج الخلية (مثل الإفراج البوليمرات الكربوهيدرات والبروتينات).

البوليمرات الكربوهيدرات الخلوية خارج الخلية معقدة للغاية، ويرجع ذلك أساسا إلى عدد ونسبة السكريات الأحادية المختلفة التي تشكل تكوينها1. تعتمد الطرق التقليدية المستخدمة لعزل هذه المواد البوليمرية على مفهوم بسيط بأن هذه المواد الغنية بالسكر قابلة للذوبان في ح...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم تمويل هذا العمل من صناديق الصندوق الأوروبي للمشاريع الإقليمية من خلال برنامج COMPETE 2020 - Operacional للقدرة التنافسية والتدويل، البرتغال 2020، ومن الأموال البرتغالية من خلال FCT - Fundação para a Ciência e (أ) Tecnologia/Ministério da Ciência, Tecnologia e Ensino Superior in the framework of the project POCI-01-0145-FEDER-028779 and grant SFRH/BD/99715/2014 (CF).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
أغشية غسيل الكلىMedicell Membranes Ltd DTV.12000.07أنبوب فيسكينغ الحجم 7 ، ضياء 23.8 مم ، العرض 39-41 مم 30 م لفة   ؛
الإيثانول 96٪AGA - Á lcool e G & eacute; نيروس أليمنتيريس ، إس إيه4.000.02.02.00الإيثيلي التخمير 96٪ مرشح AGA
PES 0.2 & mu ؛ مفيشر العلمي ، Lda15206869حقنة مرشح البوليسترين 33 مم 0.2 & مايكرو ؛ م STR 
Amicon Ultra-15 ، Ultracel-3KMerck Millipore Ltd.UFC900324مرشحات الطرد المركزي بقطع الوزن الجزيئي الاسمي 3 كيلو دالتون
Thermo Scientific   ؛ بيرس BCA فحص البروتينفيشر العلمي ، Lda10741395كاشف فحص من الأخضر إلى الأزرق ، دقيق ، متوافق مع المنظفات لقياس إجمالي تركيز البروتين
Brillant Blue G Colloidal Concentrate   ؛سيجما ألدريتش كو & iacute; ميكا SLB2025-1EACoomassie blue 
الكحول

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Pereira, S., et al. Complexity of cyanobacterial exopolysaccharides: composition, structures, inducing factors and putative genes involved in their biosynthesis and assembly. FEMS Microbiology Reviews. 33 (5), 917-941 (2009).
  2. Kanekiyo, K., et al. Isolation of an Antiviral Polysaccharide, Nostoflan, from a Terrestrial Cyanobacterium, Nostoc flagelliforme. Journal of Natural Products. 68 (7), 1037-1041 (2005).
  3. Løbner, M., Walsted, A., Larsen, R., Bendtzen, K., Nielsen, C. H. Enhancement of human adaptive immune responses by administration of a high-molecular-weight polysaccharide extract from the cyanobacterium Arthrospira platensis. Journal of Medicinal Food. 11 (2), 313-322 (2008).
  4. Wang, H. B., Wu, S. J., Liu, D. Preparation of polysaccharides from cyanobacteria Nostoc commune and their antioxidant activities. Carbohydrate Polymers. 99, 553-555 (2014).
  5. Ozturk, S., Aslim, B., Suludere, Z., Tan, S. Metal removal of cyanobacterial exopolysaccharides by uronic acid content and monosaccharide composition. Carbohydrate Polymers. 101, 265-271 (2014).
  6. Han, P. P., et al. Emulsifying, flocculating, and physicochemical properties of exopolysaccharide produced by cyanobacterium Nostoc flagelliforme. Applied Biochemistry and Biotechnology. 172 (1), 36-49 (2014).
  7. Leite, J. P., et al. Cyanobacterium‐Derived Extracellular Carbohydrate Polymer for the Controlled Delivery of Functional Proteins. Macromolecular Bioscience. 17 (2), 1600206(2017).
  8. Estevinho, B. N., et al. Application of a cyanobacterial extracellular polymeric substance in the microencapsulation of vitamin B12. Powder Technology. 343, 644-651 (2019).
  9. Klock, J. H., Wieland, A., Seifert, R., Michaelis, W. Extracellular polymeric substances (EPS) from cyanobacterial mats: characterisation and isolation method optimisation. Marine Biology. 152 (5), 1077-1085 (2007).
  10. Delattre, C., Pierre, G., Laroche, C., Michaud, P. Production, extraction and characterization of microalgal and cyanobacterial exopolysaccharides. Biotechnology Advances. 34 (7), 1159-1179 (2016).
  11. Costa, T. R., et al. Secretion systems in gram-negative bacteria: structural and mechanistic insights. Nature Reviews Microbiology. 13 (6), 343-359 (2015).
  12. Roier, S., Zingl, F. G., Cakar, F., Schild, S. Bacterial outer membrane vesicle biogenesis: a new mechanism and its implications. Microbial Cell. 3 (6), 257-259 (2016).
  13. Sergeyenko, T. V., Los, D. A. Identification of secreted proteins of the cyanobacterium Synechocystis sp. strain PCC 6803. FEMS Microbiology Letters. 193 (2), 213-216 (2000).
  14. Oliveira, P., et al. The versatile TolC-like Slr1270 in the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803. Environmental Microbiology. 18 (2), 486-502 (2016).
  15. Flores, C., et al. The alternative sigma factor SigF is a key player in the control of secretion mechanisms in Synechocystis sp. PCC 6803. Environmental Microbiology. 21 (1), 343-359 (2018).
  16. Dubois, M., Gilles, K. A., Hamilton, J. K., Rebers, P. A., Smith, F. Colorimetric method for determination of sugars and related substances. Analytical Chemistry. 28 (3), 350-356 (1956).
  17. Parikh, A., Madamwar, D. Partial characterization of extracellular polysaccharides from cyanobacteria. Bioresource Technology. 97 (15), 1822-1827 (2006).
  18. Rühmann, B., Schmid, J., Sieber, V. Methods to identify the unexplored diversity of microbial exopolysaccharides. Frontiers in Microbiology. 6, 565(2015).
  19. Pathak, J., Rajneesh, R., Sonker, A. S., Kannaujiya, V. K., Sinha, R. P. Cyanobacterial extracellular polysaccharide sheath pigment, scytonemin: A novel multipurpose pharmacophore. Marine Glycobiology. , CRC Press. 343-358 (2016).
  20. Nguyen, A. T. B., et al. Performances of different protocols for exocellular polysaccharides extraction from milk acid gels: Application to yogurt. Food Chemistry. 239, 742-750 (2018).
  21. Jamshidian, H., Shojaosadati, S. A., Mousavi, S. M., Soudi, M. R., Vilaplana, F. Implications of recovery procedures on structural and rheological properties of schizophyllan produced from date syrup. International Journal of Biological Macromolecules. 105, 36-44 (2017).
  22. Couto, N., Schooling, S. R., Dutcher, J. R., Barber, J. Proteome profiles of outer membrane vesicles and extracellular matrix of Pseudomonas aeruginosa biofilms. Journal of Proteome Research. 14 (10), 4207-4222 (2015).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة