بروتوكاتيتشواتي 3, 4-ديوكسيجيناسي (PCD) يمكن انزيمي أزاله الأكسجين ثنائي الذرة الحرة من نظام مائي باستخدام الركيزة بروتوكاتيتشويك حمض (PCA). يصف هذا البروتوكول التعبير ، وتنقيه ، وتحليل النشاط لهذا الانزيم الكسح الأوكسجين.
مقالة منهجية
بروتوكاتيتشواتي 3, 4-ديوكسيجيناسي (PCD) يمكن انزيمي أزاله الأكسجين ثنائي الذرة الحرة من نظام مائي باستخدام الركيزة بروتوكاتيتشويك حمض (PCA). يصف هذا البروتوكول التعبير ، وتنقيه ، وتحليل النشاط لهذا الانزيم الكسح الأوكسجين.
ويستخدم المجهر جزيء واحد (SM) في دراسة التفاعلات الجزيئية الديناميكية من فلوكوفيري المسمية الجزيئات الحيوية في الوقت الحقيقي. ومع ذلك ، فان الفلوروبيورس عرضه لفقدان الاشاره عن طريق الرشح بواسطة الأكسجين المذاب (O2). لمنع الارتشاح الضوئي وأطاله عمر الفلوفيبيوم ، يتم استخدام أنظمه المسح بالأكسجين (OSS) لتقليل O2. وقد تكون البرمجيات المتاحة تجاريا ملوثه بالأحماض النووية التي تلحق ضررا أو تحللا ، وتفسر النتائج التجريبية تفسيرا محيرا. هنا نقوم بالتفصيل بروتوكول للتعبير وتنقيه الزائفة النشطة للغاية putida بروتوكاتيتشواتي-3 ، ديوكسيجيناسي (PCD) مع عدم وجود تلوث النواز قابل للكشف. يمكن PCD أزاله بكفاءة O2 الأنواع التفاعلية عن طريق تحويل الركيزة حمض بروتوكاتيتشويك (PCA) إلى 3-كربوكسي كومنولث الدول المستقلة ، وحمض كومنولث الدول المستقلة-muconic. ويمكن استخدام هذا الأسلوب في اي نظام مائي حيث O2 يلعب دورا ضارا في الحصول علي البيانات. هذا الأسلوب هو فعال في إنتاج النشطة للغاية ، النواز الحرة PCD بالمقارنة مع PCD المتاحة تجاريا.
جزيء واحد (SM) الفيزياء الحيوية هو حقل ينمو بسرعة تغيير الطريقة التي ننظر فيها إلى الظواهر البيولوجية. هذا المجال لديه القدرة الفريدة لربط القوانين الاساسيه للفيزياء والكيمياء إلى علم الاحياء. المجهر الفلوري هو الطريقة البيوفيزيائية واحده التي يمكن ان تحقق حساسية SM. يستخدم الفلوري للكشف عن الجزيئات الحيوية عن طريق ربطها بالفلور العضوية الصغيرة أو النقاط الكمية1. هذه الجزيئات يمكن ان تنبعث منها الفوتونات عندما متحمس باشعه الليزر قبل التسرب الضوئي لا رجعه فيه2. يحدث الرشح الضوئي عندما تخضع الملصقات الفلورية للضرر الكيميائي الذي يدمر قدرتها علي الاثاره عند الموجه الموجية المطلوبة2،
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
1. الحث علي التعبير PCD في e. كولاي
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المتاحة تجاريا الأوكسجين الزبال PCD غالبا ما تكون ملوثه بنواه الحمض النووي. تلوث النشاط النيوداز يمكن ان يؤدي إلى نتائج زائفه في الدراسات الفلورية ، وخاصه الدراسات التي تحلل الحمض النووي أو الحمض النووي التفاعل البروتينات. وقد وجدنا ان PCD المؤتلف ، وهو مغاير من hexahistidine الموسومة pcaH و pcaG ، يمكن التعبير عنها في كولاي (الشكل 1). يتم تنقيته المتغايرة أولا بواسطة اللوني تقارب النيكل (الشكل 2). يتم التملص من PCD في خطوتين من .......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
وعاده ما يتم تضمين أنظمه المسح الأوكسجين في جزيء واحد المجهر المجهري للحد من التصوير الضوئي3,7,8. وغالبا ما تستخدم هذه التقنيات المجهرية لمراقبه الأحماض النووية أو تفاعلات البروتين مع الأحماض النووية1،13،14. قد يؤدي تلوث الملوثات المستنفدة للأوزون مع النوكليسيس إلى نتائج زائفه.
وقد ثبت ان الأصول المتاحة تجاري.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
وليس لدي المؤلفين ما يفصحون عنه.
وقد تم دعم هذا العمل من قبل المعاهد القومية للصحة GM121284 و AI126742 إلى KEY.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | & beta ؛ ME |
| 30٪ محلول أكريلاميد وثنائي أكريلاميد ، 29: 1 | Bio-Rad | 161-0156 | |
| حمض الخليك ، ACS | Fisherl Chemical | A38C-212 | |
| Agar ، محبب | BD Biosciences | DF0145-17-0 | |
| نظام AKTA FPLC | GE Healthcare Life Sciences | AKTA جهاز تنقية: Box-900 و pH / C-900 و UV-900 و P-900 و Frac-920 | |
| وحدة تصفية الطرد المركزي Amicon Ultra-2 | EMD Millipore | UFC201024 | 10 كيلو دالتون MWCO |
| كبريتات الأمونيوم الحديد (II) سداسي هيدرات | Sigma | F-2262 | |
| أقراص بيرسلفات الأمونيوم (APS) أقراص | Amresco | K833-100TABS | |
| أمبيسلين | أمريسكو | 0339-25G | |
| باكتو تريبتون | BD Biosciences | DF0123173 | |
| مادة مضافة لوسائط الثقافة المجففة BD Bacto: مستخلص الخميرة الزجاجية | VWR | 90004-092 | |
| BIS-TRIS البروبان ، > = 99.0٪ (معايرة بالتحليل الحجمي) | Sigma-Aldrich | B6755-500G | |
| بروموفينول الأزرق | سيجما-ألدريتش | B0126-25G | |
| Coomassie Brilliant Blue | Amresco | 0472-50G | |
| Costar 96 & ndash ؛ حسنا مسطحة – لوحة EIA السفلية | Bio-Rad | 2240096EDU | |
| DTT | P212121 | SV-DTT | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 500ML | Sigma-Aldrich | D8537-500ML | PBS |
| Ethidium bromide | Thermo Fisher Scientific | BP1302 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | G37-20 | |
| Granulated LB Broth Miller | EMD العلوم البيولوجية | 1.10285.0500 | |
| عالية الدقة قياسية Agarose | AGTC | AG500D1 | |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | I0250-250G | |
| IPTG | Goldbio | I2481C25 | |
| Leupeptin | Roche | 11017128001 | |
| Lysozyme من بياض بيض الدجاج | Sigma-Aldrich | L6876-1G | |
| الصغير من كلوريد المغنيسيوم من كلوريد | 0288-1 كجم | ||
| ، مع قدرة اللحاف | Thermo Fisher | ND-2000C | |
| NaCl | P212121 | RP-S23020 | |
| Ni-NTA Superflow (100 مل) | Qiagen | 30430 | |
| Novagen BL21 الخلايا المختصة | EMD Millipore | 69-449-3 | وسائط SOC متضمنة |
| أورانج جي | فيشر ساينتفيك | 0-267 | |
| بيبستاتين | جولد التكنولوجيا الحيوية | P-020-25 | |
| PMSF | أمريسكو | 0754-25G | |
| حمض بروتوكاتشويك | فيشر العلمي | ICN15642110 | PCA |
| كبريتات دوديسيل الصوديوم | P212121 | CI-00270-1KG | |
| SpectraMax M2 Microplate Reader | الآلات الجزيئية | ||
| وحدات تصفية معقمة يمكن التخلص منها مع غشاء PES > 250 مل | Thermo Fisher Scientific | 09-741-04 | |
| وحدات تصفية معقمة يمكن التخلص منها مع غشاء PES > 500 مل | Thermo Fisher Scientific | 09-741-02 | |
| Superose 12 10/300 GL | GE Healthcare Life | Sciences 17517301 | |
| TEMED | Amresco | 0761-25ML | |
| Tris Ultra Pure | Gojira Fine Chemicals | UTS1003 | |
| Typhoon 9410 جهاز تصوير الفلورسنت متغير | الوضع GE Healthcare Life Sciences | ||
| UltraPure EDTA | Invitrogen / Gibco | 15575 | |
| ZnCl2< / sub> | Sigma-Aldrich | 208086 |
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه
طلب إذن