هنا، نقدم بروتوكول لمعالجة نخاع العظم الطازج (BM) معزولة عن الماوس أو الإنسان لالكتلة عالية الأبعاد الخلايا (الخلايا من قبل وقت الرحلة، CyTOF) تحليل الخلايا العدلية النسب.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
إعداد نخاع العظام كله لتحليل الكتلة الخلايا من الخلايا العدلية النسب
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
في هذه المقالة، نقدم بروتوكول احسن للحفاظ على الخلايا العدلية النسب في BM الطازجة لتحليل كامل BM CyTOF. لقد استخدمنا لوحة ثلاثية الأبعاد ثلاثية الأبعاد للأجسام المضادة ثلاثية الأبعاد لتقييم نظام الخلايا الدموية مع التركيز على خلايا العدلات السلالة باستخدام هذا البروتوكول. تم تحليل نتيجة CyTOF مع خوارزمية الحد من الأبعاد مفتوحة المورد، viSNE، وقدمت البيانات لإظهار نتيجة هذا البروتوكول. لقد اكتشفنا مجموعات خلايا جديدة على أساس هذا البروتوكول. هذا البروتوكول من إعداد BM كاملة جديدة يمكن استخدامها ل1)، وتحليل CyTOF لاكتشاف مجموعات الخلايا غير معروف من BM كله، 2)، والتحقيق في عيوب BM كاملة للمرضى الذين يعانون من اضطرابات الدم مثل سرطان الدم، 3)، والمساعدة في تحسين الفلورسنت تنشيط تدفق البروتوكولات السيتوميالتي تستخدم BM كامل الطازجة.
المقدمة
في العقود القليلة الماضية، كانت أساليب القياس السيتومي أداة قوية للتحقيق في نظام المكون ة في BM. وتشمل هذه الأساليب الفلورسنت تنشيط تدفق السيل والطريقة الجديدة من CyTOF باستخدام الأجسام المضادة الثقيلة التي تحمل علامات المعادن. وقد أدت إلى اكتشافات العديد من أنواع الخلايا في عينة بيولوجية غير متجانسة عن طريق تحديد ملامح التعبير فريدة من نوعها علامة السطح. يؤدي تداخل الطيف المتزايد المرتبط بالمزيد من القنوات إلى عدم دقة البيانات في تطبيقات قياس الدفق الفلوري. لذلك، تتم إزالة الخلايا غير المرغوب فيها بشكل روتيني من أجل إثراء مجموعات الخلايا ذات الأهمية لتحليل الخلايا المتدفقة المنشط الفلورسنت. على سبيل المثال، تعتبر Ly6G (أو Gr-1) و CD11b علامات الخلايا النخاعية الناضجة....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
اتبعت جميع التجارب المبادئ التوجيهية المعتمدة من معهد لا جولا للحساسية والمناعة لجنة رعاية الحيوانات واستخدام، وتم الحصول على الموافقة على استخدام القوارض من معهد لا جولا للحساسية والمناعة وفقا للمعايير المبينة في دليل رعاية واستخدام الحيوانات المختبرية من المعاهد الوطنية للصحة.
1. حصاد النخاع العظمي للفأر (BM)
- شراء الفئران C57BL/6J من بائع تجاري. تغذية النظام الغذائي القوارض حساء القياسية والمنزل في أقفاص microisolator في منشأة خالية من مسببات الأمراض.
- استخدام الفئران الذكور، 6-10 أسابيع من العمر، لأغراض تجريبية. الاستئصال الرحيم عن طريق استنشاق ثاني أكسيد الكربون 2 يليه خلع عنق الرحم.
- ضع الماوس على....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
الشكل 1 هو عرض كمثال على ذلك من تجارب CyTOF. على هذه المؤامرة tSNE تم تجميع الخلايا عبر أنسجة الماوس متعددة في مجموعات فرعية استناداً إلى تشابه ملامح التعبير علامة السطح قياسها بواسطة لوحة CyTOF 33 معلمة. تم تجميع الخلايا ذات الخصائص المشابهة بشكل تلقائي معًا مثل العدلات أو الضامة أو وحدات DCs استنادًا إلى تعبير العلامات الـ 33 على كل خلية.
الشكل 2 هو عرض كمثال على نتيجة للفأر ة BM CyTOF التجربة باستخدام البروتوكول المقدم في هذه الدرا.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
في العقود الماضية، تم استخدام الفلورية القائمة على الخلايا تدفق كوسيلة رئيسية لدراسة السلالات الخلوية والتباين1،2،3. وعلى الرغم من أن قياس التدفق السيتومتري قد وفر بيانات متعددة الأبعاد، فإن هذه الطريقة محدودة بخيارات البارامترات والتداخل الطيفي. للتغلب على ضعف قياس تدفق الخلايا استغلنا CyTOF، الذي يستخدم نظائر المعادن الثقيلة بدلا من الفلوروفورس لتسمية الأجسام المضادة التي تزيل الكلام المتبادل بين قنوات الكشف أو الفلور التلقائي.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.
شكر وتقدير
نود أن نشكر النواة LJI تدفق الCytometry للمساعدة في إجراء قياس السيل الشامل. وقد دعم هذا العمل من قبل المعاهد القومية للصحة منح R01HL134236، P01HL136275، و R01CA202987 (جميعها إلى C.C.H) و ADA7-12-MN-31 (04) (إلى C.C.H. و Y.P.Z).
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| <قوي > CyTOF الأجسام المضادة (الماوس) < / قوي > | |||
| مضاد للفأر CD45 (استنساخ 30-F11) -89Y | Fluidigm | Cat # 3089005B | |
| مضاد للإنسان / ماوس CD45R / B220 (استنساخ RA36B2) -176Yb | Fluidigm | Cat # 3176002B | |
| مضاد للفأر CD105 (استنساخ MJ7 / 18) - منقى | Biolegend | Cat # 120402 ؛ RRID: AB_961070 | |
| مضاد للفأر CD115 (CSF-1R) (استنساخ AFS98) - منقى | Biolegend | Cat # 135502 ؛ RRID: AB_1937293 | |
| مضاد للفأر CD117 / c-kit (استنساخ 2B8) -166Er | Fluidigm | Cat # 3166004B | |
| مضاد للفأر CD11a (استنساخ M17 / 4) - منقى | Biolegend | Cat # 101101 ؛ RRID: AB_312774 | |
| مضاد للفأر CD11b (استنساخ M1 / 70) -148Nd | Fluidigm | Cat # 3148003B | |
| مضاد للفأر CD11c (استنساخ N418) -142Nd | Fluidigm | Cat # 3142003B | |
| مضاد للفأر CD127 (IL-7R &alpha ؛) (استنساخ A7R34) -MaxPar Ready | Biolegend | Cat # 133919 ؛ RRID: AB_2565433 | |
| مضاد للفأر CD150 (استنساخ TC1512F12.2) -167Er | Fluidigm | Cat # 3167004B | |
| مضاد للفأر CD16.2 (FC & gamma; RIV) (استنساخ 9E9) - نقية | Biolegend | Cat # 149502 ؛ RRID: AB_2565302 | |
| مضاد للفأر CD162 (استنساخ 4RA10 (RUO)) - منقى | BD Biosciences | Cat # 557787 ؛ RRID: AB_647340 | |
| مضاد للفأر CD169 (Siglec-1) (استنساخ 3D6.112) - منقى | Biolegend | Cat # 142402 ؛ RRID: AB_10916523 | |
| مضاد للفأر CD182 (CXCR2) (استنساخ SA044G4) - منقى | Biolegend | Cat # 149302 ؛ RRID: AB_2565277 | |
| مضاد للفأر CD183 (استنساخ CXCR3-173) - منقى | Biolegend | Cat # 126502 ؛ RRID: AB_1027635 | |
| مضاد للفأر CD335 (NKp46) (استنساخ 29A1.4) - MaxPar Ready | Biolegend | Cat # 137625 ؛ RRID: AB_2563744 | |
| مضاد للفأر CD34 (استنساخ MEC14.7) - منقى | Biolegend | Cat # 119302 ؛ RRID:AB_345280 | |
| مضاد للفأر CD41 (استنساخ MWReg30) -MaxPar جاهز | Biolegend | Cat # 133919; RRID: AB_2565433 | |
| مضاد للفأر CD43 (استنساخ S11) -146Nd | Fluidigm | Cat # 3146009B | |
| مضاد للفأر CD48 (استنساخ HM48.1) -156Gd | Fluidigm | Cat # 3156012B | |
| مضاد للفأر CD62L (استنساخ MEL-14) - MaxPar جاهز | ThermoFisher | Cat # 14-1351-82 ؛ RRID: AB_467481 | |
| مضاد للفأر CD71 (استنساخ RI7217) - منقى | Biolegend | Cat # 113802 ؛ RRID: AB_313563 | |
| مضاد للفأر CD90 (استنساخ G7) - منقى | Biolegend | Cat # 105202 ؛ RRID: AB_313169 | |
| مضاد للماوس F4 / 80 (استنساخ BM8) -159Tb | Fluidigm | Cat # 3159009B | |
| مضاد للماوس FC & epsilon ؛ RI & alpha ؛ (استنساخ MAR-1) - MaxPar جاهز | Biolegend | Cat # 134321 ؛ RRID: AB_2563768 | |
| مضاد للفأر GM-CSF (MP1-22E9 (RUO)) - منقى | BD Biosciences | Cat # 554404 ؛ RRID: AB_395370 | |
| مضاد للفأر I / I-E (استنساخ M5 / 114.15.2) -174Yb | Fluidigm | Cat # 3174003B | |
| مضاد للماوس Ki67 (استنساخ B56 (RUO)) - منقى | BD Biosciences | Cat # 556003 ؛ RRID: AB_396287 | |
| مضاد للفأر Ly-6A / E (Sca-1) (استنساخ D7) -169Tm | Fluidigm | Cat # 3169015B | |
| مضاد للفأر Ly6B (استنساخ 7/4) - منقى | أبكام القط # ab53457 ؛ RRID: AB_881409 | ||
| مضاد للفأر Ly-6G (استنساخ 1A8) - MaxPar جاهز | Biolegend | Cat # 127637 ؛ RRID: AB_2563784 | |
| مضاد للفأر NK1.1 (استنساخ PK136) -165Ho | Fluidigm | Cat # 3165018B | |
| مضاد للفأر Siglec-F (استنساخ E50-2440 (RUO)) - منقى | BD Biosciences | Cat # 552125 ؛ RRID:AB_394340 | |
| مكافحة الماوس TCR&بيتا; (استنساخ H57-597) -143Nd | Fluidigm | (استنساخ H57-597) -143Nd | |
| مضاد للفأر TER-119 / خلايا الكريات الحمراء (استنساخ TER-119) -MaxPar جاهز | Biolegend | Cat # 116241 ؛ RRID: AB_2563789 | |
| < قوي > المواد الكيميائية والببتيدات والبروتينات المؤتلفة < / قوي > | |||
| الأجسام المضادة | كاندور بيوساينس | كات # 130050 | |
| ألبومين مصل الأبقار | سيجما ألدريتش | القط # A4503 | |
| سيسبلاتين -194Pt | Fluidigm | Cat # 201194 | |
| eBioscience 1x RBC Lysis Buffer | ThermoFisher | Cat # 00-4333-57 | |
| eBioscience Foxp3 / مجموعة العازلة لتلطيخ عامل النسخ | ThermoFisher | Cat # 00-4333-57 | |
| EQ حبات معايرة أربعة | عناصر Fluidigm | Cat # 201078 | |
| حمض الإيثيلين ديامين تترا أسيتيك (EDTA) | ThermoFisher | Cat # AM9260G | |
| مصل الأبقار الجنيني | أوميغا القط العلمي | # FB-02 | |
| محلول ملحي مخزن من HyClone Phosphate | GE Lifesciences | Cat # SH30256.01 | |
| Intercalator-Ir | Fluidigm | Cat # 201192B | |
| MAXPAR مجموعات وضع العلامات على الأجسام المضادة | Fluidigm | http://www.dvssciences.com/product-catalog-maxpar.php | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | Cat # 158127 | |
| أزيد | الصوديومسيجما ألدريتش | القط# S2002 | |
| تريتون X-100 | Sigma-Aldrich | Cat # X100 | |
| Trypsin EDTA 1x | Corning | Cat # 25-053-Cl | |
| النموذج التجريبي: الكائن الحي / السلالات < / قوي > | |||
| الفأر: C57BL / 6J | رقم مخزون مختبر جاكسون | : 000664 | |
| <قوي> برنامج Alogrithm< / قوي> | |||
| Normalizer Finck | et al. القائم على الخرزة ، 2013 | https://med.virginia.edu/flow-cytometry-facility/wp-content/uploads/sites/170/2015/10/3_Finck-Rachel_CUGM_May2013.pdf | |
| Cytobank | Cytobank | https://www.cytobank.org/ | |
| Cytofkit v1.r.0 | Chen et al. ، 2016 | https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/cytofkit.html | |
| t-SNE | van der Maaten و هينتون ، 2008 | https://cran.r-project.org/web/packages/Rtsne/index.html | |
المراجع
- Akashi, K., Traver, D., Miyamoto, T., Weissman, I. L. A clonogenic common myeloid progenitor that gives rise to all myeloid lineages. Nature. 404, 193-197 (2000).
- Iwasaki, H., Akashi, K. Myeloid lineage commitment from the hematopoietic stem cell. Immunity. 26....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
الوسوم
