نحن نقدم بروتوكولا لدراسة قواعد الترجمة mRNA في الخلايا المصابة بفيروس الإيدز باستخدام في المختبر المستندة إلى الجيش النيبالي الريبي القائم علي فحص المخبر. ويمكن استخدام الفحص لدراسة تنظيم الترجمة من قبل رابطه الدولالمستقلة-عناصر من mrna ، بما في ذلك 5 '-المنطقة غير المترجمة (utr) و 3 '-utr. يمكن أيضا فحص أوضاع بدء الترجمة المختلفة باستخدام هذه الطريقة.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
في المختبر المستندة إلى الجيش النيبالي الريبي القائم علي الفحص التشخيصي لدراسة تنظيم الترجمة في الخلايا المصابة Poxvirus
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
كل mrna الفيروسه الجدريه المنسوخة بعد الفيروسية الحمض النووي النسخ المتماثل لديه المحافظة علي التطور ، غير--templated 5 '--بولي (A) زعيم في 5 '-utr. لتشريح دور 5 '-بولي (A) الرائدة في الترجمة mrna اثناء العدوى الفيروسه الجدريه وضعنا في المختبر المستندة إلى الجيش النيبالي الريبي علي أساس الفحص الصحفي لوسيفيراز. هذا الفحص الصحفي يتكون من أربع خطوات أساسيه: (1) PCR لتضخيم قالب الحمض النووي للنسخ في المختبر. (2) في النسخ الأنبوبي لتوليد mRNA باستخدام T7 الجيش النيبالي الريبي البوليميريز; (3) الانتقال إلى إدخال في المختبر كتبت mRNA في الخلايا ؛ (4) الكشف عن نشاط لوسيفيراز كمؤشر للترجمة. فحص المخبر لوسيفيراز المستندة إلى الجيش النيبالي الريبي وصفت هنا القضايا من النسخ المتماثل البلازميد في الخلايا المصابة poxvirus والنسخ خفي من البلازميد. ويمكن استخدام هذا البروتوكول لتحديد تنظيم الترجمة من قبل عناصر رابطه الدولالمستقلة في mrna بما في ذلك 5 '-utr و 3 '-utr في أنظمه أخرى غير الخلايا المصابة بفيروسات. وعلاوة علي ذلك ، يمكن التحقيق في طرق مختلفه لبدء الترجمة مثل الاعتماد علي الغطاء ، والغطاء المستقل ، وأعاده البدء ، والبدء الداخلي باستخدام هذه الطريقة.
المقدمة
وفقا ل العقيدة مركزيه, يتدفق معلومة وراثيه من [دنا] إلى [رنا] وبعد ذلك أخيرا إلى بروتين1,2. وينظم هذا التدفق من المعلومات الوراثية للغاية علي العديد من المستويات بما في ذلك mrna الترجمة3,4. ومن شان تطوير اختبارات المراسلين لقياس تنظيم التعبير الجيني ان ييسر فهم أليات التنظيمية المعنية بهذه العملية. هنا نحن وصف بروتوكول لدراسة mrna الترجمة باستخدام في المختبر المستندة إلى الجيش الريبي النيبالي القائم علي فحص المخبر لوسيفيراز في الخلايا المصابة poxvirus.
وتشمل الفيروسات العديد من مسببات الامراض البشرية والحيوانية خطيره جدا
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1. اعداد قالب الحمض النووي من قبل PCR للنسخ في المختبر
- لاعداد قالب الحمض النووي من قبل PCR ، تصميم الإشعال. عند تصميم الإشعال النظر في الخصائص الحاسمة مثل طول التمهيدي ، ودرجه الحرارة الصلب (Tm) ، GC المحتوي ، 3 ' نهاية مع G أو C الخ.
ملاحظه: تناقشت [أين دتيل] في هذا أدب25,26,27. - تصميم الإشعال لتوليد PCR السعه التي تحتوي علي العناصر التالية في 5 ' إلى 3 ' الاتجاه: T7-المروج ، بولي (a) زعيم ، اليراع لوسيفيراز ORF والذيل بولي (a) المشار اليها فيما يلي باسم T7_12A-fluc. تصميم الإشعال (إلى الامام والخلف) لتشمل جم....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
الخطوات الأربع من في المختبر التي كتبها الحمض النووي الريبي القائم علي الفحص الصحفي لوسيفيراز: PCR لتوليد قالب DNA للنسخ في المختبر ، في النسخ الأنبوبي لتوليد mrna ، نقل mrna ، وقياس لوسيفيراز ، يمكن ان ينظر اليه في الرسم التخطيطي ( الشكل 1). ويتضح تصميم الإشعال لكل من قوالب الحمض النووي (Fluc و Rluc) والمخطط العام لامتداد النتوء PCR في الرسم التخطيطي (الشكل 2 ا). بعد PCR ، تم الكشف عن المنتج PCR الحجم الصحيح من قبل تاي اجنشا هلا.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
جميع الخطوات الاربعه الاساسيه هي حاسمه لنجاح في المختبر المستندة إلى الحمض الريبي النيبالي القائم علي الفحص الصحفي لوسيفيراز. وينبغي إيلاء اهتمام خاص لتصميم التمهيدي ، وخاصه بالنسبة للتسلسل المروج T7. T7 [رنا] [بولمرس] يبدا نسخ من ال يؤكد اولي [غ] ([غ] [ز-5 '-UTR-أب-]) في T7 مروج يضيف قبل ال [5 '-utr] تسلسل. علي الرغم من ان بدء النسخ الموقع (خدمات التشغيل التقني) يبدا من G الاولي في 5 ' نهاية ، وانخفاض عدد من G في اقل من ثلاثه في T7 منطقه المروج انخفض العائد RNA/الناتج من النسخ في المختبر. خلال التجربة ، لاحظنا ان.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ولا يرغب أصحاب البلاغ في إعلان اي مصلحه مالية متنافسة.
شكر وتقدير
تم تمويل المشروع من قبل المعاهد الوطنية للصحة (AI128406 www.nih.gov) إلى ZY وجزئيا من قبل مركز جونسون لأبحاث السرطان (http://cancer.k-state.edu) في شكل راتب الصيف طالب الدراسات العليا إلى PD.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| 2X-Q5 Master mix | New England Biolabs | M0492 | بوليميراز الحمض النووي عالي الدقة المستخدم في PCR |
| 3 ´ ؛ -O-Me-m7G (5') ppp (5') G RNA Cap Structure التناظرية | نيو إنجلاند Biolabs | S1411L | التناظرية التناظرية أو ARCA |
| Corning 96 بئر نصف منطقة بيضاء مسطحة القاع البوليسترين ميكروبليت | كورنينج | 3693 | غير شفاف الجدران 96 صفيحة بيضاء جيدة مع قاع |
| صلبنظام فحص مراسل لوسيفيراز المزدوج | Promega | E1960 | مجموعة فحص لوسيفيراز مزدوجة (DLAK) |
| E.Z.N.A. دورة طقم نقية | OMEGA BIO-TEK | D6492 | PCR طقم تنقية |
| GloMax Navigator Microplate Luminometer | Promega | GM2010 | يشار إليه باسم مقياس الإضاءة لقارئ الألواح متعدد الأوضاع |
| HiScribe T7 طقم تخليق الحمض النووي الريبي السريع عالي الإنتاجية | نيو إنجلاند Biolabs | E2050S | في طقم النسخ المختبري |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher Scientific | 11668019 | كاشف تعداء الدهون الموجبة |
| NanoDrop2000 | Thermo Fisher Scientific | ND-2000 | يستخدم لقياس تركيز الحمض النووي الريبي |
| Opti-MEM | Thermo Fisher Scientific | 31985070 | وسائط مصل مخفضة |
| Purelink RNA Mini | Kit Thermo Fisher Scientific | 12183018A | طقم تنقية الحمض النووي الريبي |
| نظام السد للقاحات | نظام السد نيو إنجلاند Biolabs | M2080 |
المراجع
- Crick, F. H. On protein synthesis. Symposia of the Society for Experimental Biology. 12, 138-163 (1958).
- Crick, F. Central Dogma of Molecular Biology. Nature. 227, 561-563 (1970).
- Sonenberg, N., Hinnebusch, A. G.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
