Method Article

عزل وتقدير كمية لفيروس زيكا من أجهزة متعددة في الماوس

DOI:

10.3791/59632

⸱

August 15th, 2019

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular Microbiology and Immunology, Saint Louis University, 2School of Veterinary Medicine University of California Davis

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

والهدف من البروتوكول هو إظهار التقنيات المستخدمة للتحقيق في الأمراض الفيروسية عن طريق عزل وقياس فيروس زيكا، من أجهزة متعددة في فأر ة بعد العدوى.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وتبين الأساليب المعروضة الإجراءات المختبرية لعزل الأعضاء عن الحيوانات المصابة بفيروس زيكا والتحديد الكمي للحمولة الفيروسية. والغرض من هذا الإجراء هو قياس التلكرات الفيروسية في المناطق الطرفية والجهاز العصبي المركزي للماوس في نقاط زمنية مختلفة بعد العدوى أو في ظل ظروف تجريبية مختلفة لتحديد العوامل الفيرولوجية والمناعية التي تنظم عدوى فيروس زيكا. تسمح إجراءات عزل الأعضاء التي تم إظهارها لكل من التركيز على تشكيل القياس الكمي والتقييم الكمي لـ PCR للأجهزة التيتريافية. تم تصميم تقنيات عزل الأعضاء السريعة للحفاظ على جهاز نقل الفيروس. يسمح التحديد الكمي للبنفسمن من خلال التركيز على تشكيل اختبار تقييم الإنتاجية السريع لفيروس زيكا. وفائدة التركيز على تشكيل التقييم هي تقييم الفيروس المعدي، والحد من هذا التقييم هو احتمال سمية الأعضاء مما يقلل من حد الكشف. يتم الجمع بين تقييم التتر فيروسي مع PCR الكمي، ويتم تقييم استخدام نسخة الحمض النووي الريبي المؤتلف التحكم في عدد الجينوم الفيروسي داخل الجهاز مع الحد المنخفض للكشف. عموما هذه التقنيات توفر طريقة سرعة سرعة سرعة الإنتاجية لتحليل التوتير الفيروسية زيكا في محيط والجهاز العصبي المركزي للالحيوانات المصابة بفيروس زيكا ويمكن تطبيقها على تقييم titers الفيروسية في أجهزة الحيوانات المصابة بمعظم مسببات الأمراض، بما في ذلك فيروس حمى الضنك.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

فيروس زيكا (ZIKV) هو فيروس أربو ينتمي إلى عائلة فلافيريدي، والذي يتضمن مسببات الأمراض البشرية العصبية الغازية الهامة مثل فيروس بواسان (POWV)، وفيروس التهاب الدماغ الياباني (JEV)، وفيروس غرب النيل (WNV)1. بعد عزلها وتحديدها، كانت هناك تقارير دورية عن العدوىالبشرية ZIKV في أفريقيا وآسيا 2،3،4،5،والأوبئة داخل أمريكا الوسطى والجنوبية (استعرضت في المرجع6). ومع ذلك، لم يكن حتى وقت قريب أن ZIKV كان يعتقد أن يسبب مرض شديد7. الآن هناك الآلاف من حالات الأمراض العصبية والعيوب الخلقية المرتبطة بعدوى ZIKV. وقد أثار الظهور السريع لـ ZIKV العديد من الأسئلة المتعلقة بما يلي: لماذا هناك زيادة في شدة المرض، وما هي الاستجابة المناعية للعدوى ZIKV، وهناك أمراض فيروسية و/أو مناعية مرتبطة بزيادة في العصبية المظاهر والعيوب الخلقية. هناك الآن الاندفاع لفهم الجهاز العصبي المركزي (CNS) الأمراض ذات الصلة المرتبطة ZIKV، فضلا عن الحاجة إلى اختبار سريع لفعالية مضادات الفيروسات واللقاحات ضد ZIKV. وفي ظل هذه الخلفية، قمنا بتطوير أساليب للتحليل السريع لأجهزة التتيكون ZIKV في كل من المحيط والجهاز العصبي الكندي باستخدام تركيز خاص بـ ZIKV يشكل اختبارًا (FFA).

النماذج الحيوانية الصغيرة مهمة لفهم تطور المرض وللتقييم المبكر لللقاحات والعلاج ومضادات الفيروسات. لقد أنشأنا نماذج حيوانية صغيرة لدراسة مرض arbovirus باستخدام سلالات الماوس المختلفة لنموذج العدوى البشرية والحماية من مسببات الأمراض الفيروسية8،9،10،11، 12,13,14,15,16,17,18,19,20, 21،22. باستخدام هذه التجربة السابقة، بدأنا في تعديل التقنيات المستخدمة لتقييم فيروس WNV وحمى الضنك، وهو فيروس فلافي ذات الصلة لتقييم تيتر ZIKV في كل من الأجهزة الطرفية، فضلا عن الجهاز العصبي المركزي21،23، 24- ومزايا هذه الأساليب على الاختبارات الأخرى هي: (1) أنها تجمع بين القدرة على جمع الأجهزة الطرفية والجهاز العصبي المركزي على حد سواء لأغراض التحليل؛ (2) أن هذه الأساليب تجمع بين القدرة على جمع الأجهزة الطرفية والجهاز العصبي المركزي على حد سواء من أجل التحليل؛ (2) أن هذه الأساليب تجمع بين القدرة على جمع الأجهزة الطرفية والجهاز العصبي المركزي على حد سواء من أجل التحليل. 2) الطرق قابلة للتكيف لتدفق قياس الخلايا، لقياسات الاستجابات المناعية الفطرية والتكيفية، جنبا إلى جنب مع titers الفيروسية على نفس الحيوان في نفس الجهاز؛ 3) تقنية الحصاد قابلة للتكيف للتحليل النسيجي؛ 4) وFFA ZIKV هو طريقة سرعة الإنتاجية عالية لتحليل التتر الفيروسية؛ و5) يمكن تطبيق هذه الأساليب على تقييم التيتفيات الفيروسية في أجهزة الحيوانات المصابة بمعظم مسببات الأمراض25.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وتتفق جميع إجراءات هذه الدراسة مع المبادئ التوجيهية التي وضعتها لجنة رعاية الحيوانات واستخدامها في جامعة سانت لويس. SLU معتمدة بالكامل من قبل جمعية تقييم واعتماد المختبرات الدولية لرعاية الحيوانات (AAALAC).

1. عزل الأعضاء

ملاحظة: الفيروس غير مستقر في درجة حرارة الغرفة (RT) لذلك يجب تخطيط عدد الحيوانات التي يتم حصادها في وقت واحد بعناية للحفاظ على titers الفيروسية.

  1. تصيب الفئران باستخدام الجرعة والطريق المختارين، استنادا ً إلى النمط الظاهري المطلوب. لهذا البروتوكول، تصيب 8-10 أسابيع من العمر الذكور والإناث نوع الأول مستقبلات الإنترفيرون ناقص (Ifnar1-/-) C57BL/6 الفئران.
    1. التخدير Ifnar1-/- الفئران مع كوكتيل من الكيتامين (90 ملغ / كغ) وXylazine (10 ملغ / كغ). اختبار رد الفعل دواسة من قبل قرصة اصبع القدم شركة لتأكيد التخدير. إدارة 1 × 105 وحدات تشكيل التركيز (FFU) من ZIKV في 50 ميكرولتر تحت الجلد (SC) عن طريق لوحة القدم.
  2. إعداد جميع المواد اللازمة للحصاد في اليوم السابق: 2 مقص، ملقط و 20 مل من الإيثانول 70٪ (EtOH) في مخروطية 50 مل لتطهير الأدوات.
    1. إعداد المحاقن والإبر: حقنة 20 مل للتسريب، 23 G الإبر (حوالي 1 لكل قفص) و 1 مل حقنة مع إبرة 25 G (1 لكل 3-5 ماوس). قبل أنابيب وزنها، إضافة الخرز الصلب (في غطاء محرك السيارة) إلى 1.5 مل O-الدائري أنابيب غطاء المسمار (واحد لكل جهاز). يجب أن تكون الأنابيب مناسبة للتجانس.
  3. إعداد يوم الحصاد المواد اللازمة لضخ وتجميد الأعضاء.
    1. ملء دلو الثلج مع الجليد الجاف و 70٪ EtOH لجعل حمام الجليد. إعداد الفوسفات المعقم المخزنة المالحة (PBS) على افتراض أن 25-30 مل لكل فأر من PBS لكل ضخ مطلوب 5-10 مل للحبل الشوكي). الحصول على التخدير، وكوكتيل من الكيتامين وXylazine، ونفترض 300 درجة مئوية لكل فأر. وضع جميع المواد وأي أنابيب إضافية مطلوبة لتدفق قياس السيتومترية، وما إلى ذلك، في حاوية ثانوية لنقلها إلى مرفق الحيوان.
  4. اتبع جميع الإجراءات اللازمة للدخول بما في ذلك التبرع وdoffing معدات الحماية الشخصية أثناء الدخول والخروج إلى منشأة الحيوان.
    تحذير: ومن المقرر تنفيذ جميع الإجراءات في خزانة معتمدة للسلامة الأحيائية داخل مرفق مختبر للسلامة الأحيائية من المستوى 2 ( BSL-2).
  5. إعطاء التخدير، 200-500 درجة مئوية، داخل اكلوى اعتمادا على حجم ووزن الحيوان. إذا كنت تعمل وحدها، وإدارة التخدير لحيواني واحد في وقت واحد لتجنب قتل الحيوانات قبل حصاد الأعضاء.
    1. تأكد من جرعة التخدير عن طريق الضغط على اصبع القدم مع ملقط لتقييم رد الفعل دواسة. لا تستمر إلا إذا لم يستجب تماما. استخدام دبابيس لتأمين الماوس إلى لوحة الشمع. عند هذه النقطة، قم باستعمال الماوس في الإيثانول بنسبة 70% لتجنب تلوث الشعر في إجراء حصاد الأعضاء
  6. ينزف بشكل نهائي بثقب القلب.
    1. باستخدام المقص وملقط، فتح الحيوان من خلال تجويف الصدر لفضح القلب. جمع الدم عن طريق ثقب القلب (~ 800 درجة مئوية)، وهذا يمكن استخدامها لاختبارات متعددة بما في ذلك الكيمياء السريرية، أمراض الدم، تدفق قياس السيتومتريللكشف عن استجابات محددة مستضد، وفي الوقت الحقيقي PCR الكمية (qRT-PCR) لتحليل عدد النسخ الفيروسية.
    2. لتحليل الحمض النووي الريبي الفيروسي عن طريق qRT-PCR، جمع الدم في أنبوب EDTA إذا استخراج من الدم كله أو في أنبوب الطرد المركزي الدقيق إذا استخراج من المصل. (للمصل، تدور أنبوب في أقصى سرعة في الطرد المركزي، درجة حرارة الغرفة، لمدة 20 دقيقة وإزالة المصل إلى أنبوب منفصل). إضافة polyacrylamide خطي كحامل إلى عينة المصل بعد الانتهاء. ويمكن بعد ذلك تحليل الحمض النووي الريبي أو تخزينه عند -80 درجة مئوية لمزيد من العملية في وقت لاحق.
  7. ملء حقنة 20 مل مع PBS، في درجة حرارة الغرفة (أو 37 درجة مئوية)، وperfuse الفئران عن طريق إدخال إبرة فراشة في البطين الأيسر. ثقب الأذين الأيمن للسماح للدم وPBS للخروج. إدارة ببطء PBS في حين التحقق من لون الكبد للتأكد من أن الحيوان هو perfused تماما. يجب أن يتغير الكبد من الأحمر العميق إلى لون السلمون الوردي.
    1. إذا إعداد الأعضاء لعلم الأنسجة، وترك إبرة فراشة في مكان ثم perfuse مع 20 مل من الجليد البارد 4٪ paraformaldehyde. إذا كان الأمر كذلك، فمن المريح أن يكون حقنة متصلة stopcock 3-way مع كل من المحاقن تعلق عليه، وتحول صمام على وإيقاف كبديل واحد بين PBS وPFA.
  8. حصاد الأعضاء إلى أنابيب مُصنّفة وتزن. بالنسبة للأعضاء الطرفية، اتبع أمرًا ثابتًا للحصاد: الكبد والطحال والكلى والرئتين.
    1. تأخذ فص واحد فقط من الكبد. لا يهم أي واحد، ولكن لجميع التجارب دائما في محاولة لاتخاذ نفس الفص مع نفس حجم قطعة. وبالمثل، بالنسبة للكلى والرئتين، خذ نفس الكلى والرئة. إذا كان تدفق قياس السيتومترية هو أيضا أن تكتمل، يمكن خفض أي جهاز إلى النصف. تخزين النصف لاستخدامها في قياس الخلايا في روزويل بارك معهد ميموريال معهد المتوسطة (RPMI) في درجة حرارة الغرفة حتى اكتمال الحصاد.
    2. مباشرة بعد الحصاد، ووضع كل عضو في أنبوب المسمى ووضعها في حمام الجليد الجاف. الفيروس titer يقلل مع مرور الوقت في درجة حرارة الغرفة، وبالتالي فإن مقدار الوقت الذي يستغرقه لحصاد الأعضاء مهم للغاية. يجب أن يكون هناك اتساق بين الفئران، لذلك بعد السلامة، والأولوية التالية هي السرعة.
      ملاحظة: إذا كان حصاد الأعضاء لtiters الفيروسية، فمن المفيد جدا أن يكون حصاد الفرد الثاني في الدماغ في هذه المرحلة، للحفاظ على titers الفيروسية.
  9. إزالة الأعضاء المتبقية من تجويف الجسم الماوس للوصول إلى العمود الفقري والجمجمة.
    1. إزالة الماوس من المجلس وإزالة بيلت، تليها إزالة الذراعين والساقين.
      إزالة رأس الماوس مع قطع الرأس، مقص حادة أو الجراحية لحصاد الدماغ عن طريق قطع الجمجمة مع مقص لاغرانج مسننة من خلال ماغنوم foramen. ثم، قشر قبالة الجمجمة مع ملقط ومغرفة من الدماغ مع ملعقة.
    2. باستخدام مقص قوي، حاد، وإزالة الأضلاع والعظام الأخرى المحيطة العمود الفقري. ثم، قطع عبر عظم الحوض، وفضح اللعفة الفقرية على مستوى قطني. يجب أن يكون الطرف الصغير من الحبل الشوكي مرئيًا عند هذه النقطة.
    3. استخدام حقنة 10 مل مليئة PBS وإبرة 18 G لطرد الحبل الشوكي عن طريق "مسح" الحبل من أسفل الظهر إلى العمود الفقري العنقي على طبق بيتري.
    4. بعناية، ضع طرف الإبرة المنقطع داخل الفقرية، وتجنب الضغط المفرط لمنع الإبرة من التعدي على الجسم الفقري. عقد بقوة لممارسة الضغط على الجسم الفقري والإبرة واضغط على الغطاس حقنة لطرد الحبل. نقل على الفور الحبل الشوكي في أنبوب المسمى ومكان في حمام الجليد الجاف.
  10. كرر الإجراء مع جميع الحيوانات حتى يتم الانتهاء من الحصاد. وضع أدوات الحصاد في الإيثانول 70٪ بين الحيوانات. التركيز على الاتساق والسرعة. طول الوقت بين كل حصاد الأعضاء يجب أن تبقى متسقة حتى لا التحيز نتائج titer الفيروسية.
  11. عند الانتهاء، تطهير مجلس الوزراء السلامة البيولوجية وجميع المواد قبل إزالته من منشأة الحيوان.
  12. إزالة كل أنبوب من حمام الجليد وتزن أنابيب لتحديد وزن الأعضاء. لتحديد وزن الأعضاء ، طرح وزن الأنبوب الفارغ من وزن الجهاز الذي يحتوي على أنبوب.
    ملاحظة: عند هذه النقطة يمكن تجميد الأعضاء في -80 درجة مئوية لمزيد من العملية في وقت لاحق أو يمكن أن تكون متجانسة الأجهزة مباشرة قبل تجميد aliquots الفردية. تجميد عينات ذوبان عدة مرات يقلل من titer الفيروسية. لذلك، من المهم القيام بنفس الإجراء لكافة التجارب داخل مشروع واحد.

2- تجانس الأعضاء

  1. إعداد 3 المسمى، 1.5 مل المفاجئة متوج أنابيب لكل عضو أن تكون متجانسة.
  2. إذا لم يتم تجانس العينات مباشرة بعد الحصاد، قم بإزالة الأنابيب من -80 درجة مئوية. العينات لا تحتاج إلى إذابة لتجانس.
  3. وضع العينات على الجليد للحفاظ عليها الباردة للحد من فقدان التتر الفيروسية. ثم، إضافة 1 مل من DMEM الباردة التي تحتوي على 5٪ FBS إلى كل جهاز يحتوي على أنبوب.
  4. فاز على الفور أنابيب في الخافق حبة وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. تجانس جميع الأجهزة مع الخرز الصلب في أداة حبة المجانسة. تحقق للتأكد من أن كل عضو قد تم تجانسها تماما.
  5. تدور أسفل حطام الجهاز في microfuge في 12،000 × ز لمدة 5 دقائق في ميكروفوج التي تم تبريدها إلى 8 درجة مئوية. ثم اعادة الأنابيب إلى دلو الثلج. في مجلس الوزراء السلامة البيولوجية، عينات aliquot في أنابيب للفحص اللازمة. ثم اعادة الأنابيب إلى دلو الثلج.
  6. للتركيز على تشكيل التحقيق، aliquot 500 درجة مئوية في أنبوب المسمى. ثم وضع أنابيب في الرف على دلو الجليد. Aliquot 50 ميكرولتر في أنبوب لRNA لRT-PCR الكمية الفلورية (qRT-PCR) لقياس عدد نسخة الجينوم الفيروسي.
  7. عزل مجموع الحمض النووي الريبي من أجهزة الحيوانات المصابة باستخدام مجموعة العزل RNA التجارية. تحديد اللافيفيروس الفيروسي RNA باستخدام التحقيق التمهيدي مجموعات محددة لZIKV، الذي يعترف تسلسل فريدة من نوعها في كل جينوم فيروس فلافي. تحديد رقم النسخة الفيروسية باستخدام بلازميد التحكم في نسخة تحتوي على RNA إيجابية محددة واحدة تقطعت بهم السبل ولدت في المختبر باستخدام بوليميراز T7 تحتوي على التسلسل المستهدف ZIKV.
  8. Aliquot العينة المتبقية، والتي هي ما يقرب من 300 درجة مئوية، في الأنبوب الثالث وتخزينها في -80 درجة مئوية إذا لزم الأمر.
    ملاحظة: إذا لم تكن العينات مجمدة من قبل، تجميد في -80 درجة مئوية. إذا كانت العينات قد جمدت سابقا، استمر في التركيز على تشكيل فحص و / أو عزل الحمض النووي الريبي قبل التوقف.

3. زيكا فيروس التركيز تشكيل اختبار26

ملاحظة: من المهم تضمين عدم التحكم في الفيروسات والسيطرة الإيجابية. السيطرة الإيجابية هي سلسلة تخفيف من مخزون الفيروس مع تركيز معروف. لا تحتاج جميع الضوابط إلى أن تكون على نفس اللوحة، ولكن عندما يصبح التسياق أكبر من 5 لوحات، ينبغي إضافة المزيد من الضوابط، وتنتشر بين لوحات. الحرص على عدم خدش الطبقة الأحادية مع نصائح الأنابيب أو عن طريق الغسيل القوي. يمكن أن يتم التملّف على أجهزة متعددة في نفس اليوم أو في أيام مختلفة. ولكن لا ينبغي أن يكون الجهاز الفردي titered على مدى عدة أيام لأن ظروف الفحص المختلفة يمكن أن تؤثر على titer الفيروسية. ينصح بشدة لتشغيل جهاز فردي في يوم واحد.

  1. قبل يوم من التبيّاق، قم بإعداد الخلايا والكواشف اللازمة للتركيز على تشكيل التبيّاسي.
    1. إعداد وسائل الإعلام النمو التي تحتوي على 500 مل من DMEM مع 5 مل من HEPES و 25 مل من FBS. هل تنمو خلايا منظمة الصحة العالمية في وسائل الإعلام للنمو عند درجة حرارة 37 درجة مئوية، أي 5%من ثاني أكسيد الكربون قبل بدء التبيّن. لا ينبغي أن تكون خلايا فيرو ممر عالية أو نمت من أي وقت مضى أكثر من 100٪ الملاءمة قبل بدء التبيّن.
    2. إعداد 500 مل من محلول ميثيل سيلولوز 2٪ عن طريق الأوتوكلاف زجاجة وسائل الإعلام 1 L مع 10 غرام من ميثيل سيلولوز وبار ضجة كبيرة وزجاجة منفصلة 1 L وسائل الإعلام الزجاج مع 500 مل من H2O. إذا كانت المياه الأوتوكلاف قد تبريد إعادة تسخين في الميكروويف حتى زجاجة ساخنة لمسة، ولكن ليس الغليان.
    3. صب بلطف الماء الدافئ / الساخن في زجاجة من ميثيل سيلولوز بينما في غطاء محرك السيارة ثقافة الأنسجة. غطاء جزئيا زجاجة ويحرك على الهوت بلوت حتى ميثيل سيلولوز هو في الحل (1-4 ح). Aliquot حل ميثيل سيلولوز 2٪ في أنبوب مخروطي معقمة 50 مل. 2٪ ميثيل سيلولوز يمكن تخزينها في 4 درجة مئوية حتى الحاجة.
    4. إعداد 5٪ محلول بارافورمالدهايد في PBS لإصلاح لوحات وتخزينها في 4 درجة مئوية حتى الحاجة. إعداد 1X التركيز تشكيل اختبار غسل العازلة عن طريق إضافة 0.05٪ تريتون X-100 إلى PBS وتخزينها في RT. إعداد 1X FFA تلطيخ العازلة عن طريق إضافة 1 ملغ / مل الصابونين إلى PBS وتخزينها في 4 درجة مئوية حتى الحاجة. ويمكن إعداد هذه قبل أسبوع أو أسبوعين.
  2. حساب عدد من أسفل شقة 96 لوحات جيدا اللازمة للفحص بحيث يتم مطلي كل جهاز في ثلاثة أضعاف. تضمين ما يكفي من الآبار الإضافية للضوابط الإيجابية والسلبية.
    1. تنمو ما يكفي من خلايا فيرو في وسائل الإعلام النمو لإكمال التصاق مصممة. اختبار خلايا فيرو وحساب لهم إعادة تعليقها في 1.5 × 105 خلايا لكل مل في وسائل الإعلام النمو. خلايا لوحة فيرو في 96 لوحات مسطحة القاع جيدا في 3.0 × 104 خلايا Vero-WHO / جيدا في وسائل الإعلام النمو عن طريق إضافة 200 درجة مئوية لكل بئر.
    2. لوحات الحضانة في 37 درجة مئوية في 5٪ CO2 بين عشية وضحاها، تأكد من لوحات هي مستوى في الحاضنة بحيث يتم توزيع الخلايا بالتساوي داخل البئر.
      ملاحظة: كل مختبر ينمو خلايا فيرو بشكل مختلف قليلا. الهدف هو 90-95٪ من طبقة أحادية المناضدة في كل بئر في يوم اختبار فيروس زيكا.
  3. عينات فيروس زيكا المخفف في يوم من اختبار. إذا كانت عينات الأعضاء قد تم تجانسها من قبل، قم بإزالة عينات من الفريزر -80 درجة مئوية والسماح لها بالذوبان قبل وضع العينات على الجليد لإجراء فحص.
    1. على الجليد، وإعداد جولة أسفل 96 لوحة جيدا عن طريق إضافة 180 درجة مئوية من وسائل الإعلام النمو البارد إلى الصفوف B من خلال H ترك الصف فارغة. إضافة 150 درجة مئوية من كل عينة الجهاز متجانسة إلى الصف A من لوحة أسفل جولة.
    2. إعداد تخفيف المسلسل 10 أضعاف من كل عينة، وذلك باستخدام ماصة متعددة القنوات. تمييع العينات في أسفل جولة 96 لوحة جيدا عن طريق إضافة 20 درجة مئوية من العينة في 180 درجة مئوية من وسائل الإعلام النمو، وتغيير نصائح ماصة بين كل تخفيف.
  4. إعداد لوحة تشكيل التركيز عن طريق إزالة وسائل الإعلام من لوحة مسطحة القاع 96 جيدا تغطي خلايا فيرو. القيام بذلك على الفور قبل إضافة عينات الفيروس لمنع الطبقة الأحادية من الجفاف.
    1. إضافة 100 درجة مئوية من تخفيف الفيروس إلى كل بئر في لوحة فيرو. إضافة عينة باستخدام نفس مجموعة من النصائح عن طريق الانتقال من أدنى إلى أعلى تركيز. لوحات الصخور جنبا إلى جنب 2-4 مرات الحرص على عدم دوامة.
    2. الحضانة في 37 درجة مئوية، 5٪ CO2 لمدة 1-2 ح. تأكد من أن لوحات هي مستوى داخل الحاضنة. خلال الحضانة الاحماء 2٪ ميثيل سيلولوز إلى RT.
    3. تخفيف 2٪ ميثيل سيلولوز الحل في وسائل الإعلام النمو. يجب أن يكون التخفيف بنسبة حوالي 2:1 من 2٪ ميثيل سيلولوز إلى وسائل الإعلام النمو. الاحتفاظ في درجة حرارة الغرفة حتى حان الوقت لاستخدامه. إضافة 1-2 قطرات / جيدا (تعيين pipet إلى 125 درجة مئوية) من ميثيل سيلولوز: وسائل الإعلام النمو إلى كل بئر من لوحة الآبار 96.
    4. حضانة 32-40 ساعة في 37 درجة مئوية، 5٪ CO2. كما تنمو خلايا فيرو الجميع بشكل مختلف قليلا والعوامل بما في ذلك الملاءمة الخلية وسلالة من فيروس زيكا يمكن أن تغير وقت الحضانة.
  5. إصلاح خلايا فيرو باستخدام الحل البارافورماليدهايد أعدت 5٪.
    1. إضافة 50 درجة مئوية من 5٪ بارافورمالدهايد إلى كل جيدا على الجزء العلوي من طبقة ميثيل سيلولوز في مجلس الوزراء السلامة البيولوجية. حضانة لمدة 60 دقيقة في RT. إصلاح يمكن أن تذهب بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية ولكن تغطية لوحة مع parafilm للحد من التبخر.
    2. تفريغ تراكب والوسائط قبالة الخلايا في حاوية التخلص داخل مجلس الوزراء السلامة البيولوجية. يغسل بلطف مع PBS، 150 درجة مئوية / جيدا. إزالة PBS من لوحات وإزالة لوحة من BSL-2.
    3. كرر غسل PBS 2X إضافة 150 درجة مئوية / جيدا. ثم قم بإزالة PBS. إضافة 150 درجة مئوية / جيدا 1X FFA غسل العازلة والسماح الجلوس لمدة 5-10 دقيقة في RT لpermeabilize الخلايا الثابتة.
  6. الكشف عن العدوى باستخدام الأجسام المضادة زيكا الأولية. إعداد الأجسام المضادة الأولية 4G2 (D1-4G2-4-15) بتركيز 1 ملغ / مل في FFA تلطيخ العازلة. إعداد ما يكفي من الأجسام المضادة للحصول على كامل التبيّس.
    ملاحظة: الابتعاد عن حفاضات المختبر أو غيرها من المواد ماصة عالية الوبر كما الألياف سوف تؤثر سلبا على تصوير البؤر.
    1. قم بإزالة المخزن المؤقت لغسل FFA من اللوحات. إضافة 50 درجة مئوية / جيدا من الأجسام المضادة الأولية في المخزن المؤقت تلطيخ FFA. ختم لوحات مع parafilm وحضانة بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية على منصة هزاز. ويمكن إجراء الفحص مع حضانة لمدة 2 ساعة في RT.
  7. تصور العدوى عن طريق إضافة جسم مضاد مترافق HRP الثانوية. إعداد الثانوية الماعز المضادة للماوس HRP المسمى الأجسام المضادة بتركيز 1:5,000 في FFA تلطيخ العازلة. إعداد ما يكفي من الأجسام المضادة للحصول على كامل التبيّس.
    1. غسل الخلايا 3X مع FFA غسل العازلة، وإزالة المخزن المؤقت غسل عن طريق النقر في الحوض في كل مرة. وصمة عار الخلايا مع الأجسام المضادة الثانوية في FFA تلطيخ العازلة في 50 درجة مئوية / جيدا. احتضان 1-2 ح في RT.
    2. غسل الخلايا 3X مع FFA غسل العازلة، وإزالة المخزن المؤقت غسل عن طريق النقر في الحوض في كل مرة. إضافة 50 درجة مئوية / جيدا من الركيزة تروبلو.
    3. مشاهدة لوحات بعناية، والانتظار 2-15 دقيقة حتى يتم تعريف البقع تماما والحد الأدنى من الخلفية. بعد أن تكون البقع مرئية، يغسل بلطف بالماء، وذلك باستخدام يد لحماية الطبقة الأحادية من قوة المياه الجارية. اضغط على المناشف الورقية الجافة (NOT DIAPERS) والصورة في أقرب وقت ممكن.
    4. يمكن حساب البقع يدويًا أو باستخدام عداد موضعي تلقائي. إذا تم عدها يدويًا، يمكن استخدام نطاق تشريح للمساعدة في التصور.
    5. لكل عينة، حدد تخفيف مع بؤر مميزة بسهولة (على سبيل المثال، 20 إلى 200 لكل بئر) وحساب titer في وحدات تشكيل التركيز لكل مل (FFU/ml)، وذلك باستخدام متوسط الآبار المكررة: FFU / مل = (متوسط البؤر / جيدا) × (عامل التخفيف) - (mL inoculum).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لتقييم titers ZIKV باستخدام البروتوكول المذكور أعلاه Ifnar1-/- تم إصابة الفئران مع ZIKV (PRVABC59) عن طريق حقن تحت الجلد (SC) إلى لوحة القدم. هنا، فإن إدارة 1 × 105 FFU من ZIKV إلى 8-12 أسبوع من العمر Ifnar1-/- الفئران SC ليست قاتلة ولكن الفيروس يمكن تكرارها في كل من محيط والجهاز العصبي المركز. وتستخدم هذه الجرعة والطريق لدراسة الاستجابات المناعية المسببة للأمراض المضيفة ومسببات الأمراض. إدارة 1 × 105 FFU من ZIKV إلى 8-12 أسبو...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

عدوى ZIKV يمكن أن يسبب مرض عصبي وبالتالي فإن النماذج الحيوانية الحالية لدراسة مسببات الأمراض، والاستجابات المناعية والفعالية الوقائية من اللقاحات ومضادات الفيروسات تحتاج إلى التركيز على السيطرة الفيروسية داخل الجهاز العصبي الوطني. أحد التحديات في التركيز على مرض الجهاز العصبي المركزي هو أنه غالبا ما يأتي على حساب دراسة العدوى الطرفية. تركز أساليب عزل الأعضاء المقترحة هنا على الحاجة إلى التقييم السريع لعدوى زيكف في كل من المحيط والجهاز العصبي الوطني من أجل تقييم الأمراض المرتبطة بـ ZIKV بوساطة الجهاز العصبي الوطني ووضع نم...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أصحاب البلاغ ليس لديهم ما يكشفون عنه

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتم تمويل الدكتور بينتو من منحة البذور من كلية الطب بجامعة سانت لويس وصناديق بدء التشغيل من كلية الطب بجامعة سانت لويس. يتم تمويل الدكتور برين من قبل K22AI104794 جائزة المحقق المبكر من NIAID NIH، فضلا عن منحة البذور من مدرسة جامعة سانت لويس. وبالنسبة لجميع الأفراد الممولين، لم يكن للممولين أي دور في تصميم الدراسة، وجمع البيانات وتحليلها، أو اتخاذ قرار بنشر المخطوطة أو إعدادها.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1-برومو -3-كلوروبروبان (BCP)جين MRCBP151
10 سم مكعب حقنةثيرمو فيشر العلميBD 309642
18 جرام إبرةثيرمو فيشر Scientific22-557-145
1 سم مكعب حقنة تيرابايتثيرمو فيشر ساينتفيك14-823-16H
20 سم مكعب حقنةثيرمو فيشر العلمية05-561-66
24 أنبوب مطحنةThermo Fisher Scientific15 340 163
3.2 مم حبات الفولاذ المقاومThermo Fisher Scientific
37 & deg; حاضنة ثقافة الأنسجة CNuair5800
4G2 الجسم المضادفي المنزل
96 لوحة قاع مسطحة بئرMidsciTP92696
96 لوحة قاع مستديرة جيداMidsciTP92697
Basix 1.5 مل أنابيب eppendorfThermo Fisher Scientific02-682-002
التبييض المركزة المبيدات للجراثيم30966CT
CTL S6 محللCTLCTL S6 محلل عالمي
مقص قطع منحنيأدوات العلوم الدقيقة14061-11
Dulbecco ' s النسر المعدل s جلوكوز متوسط - مرتفع مع 4،500 مجم / لتر جلوكوزMilliporeSigmaD5671
الإيثانول (درجة البيولوجيا الجزيئية)MilliporeSigmae7023
مصل الأبقار الجنينيMilliporeSigmaF0926-500ML
ملقطأدوات العلوم الدقيقة11036-20
حمض الخليك الجليديMilliporeSigma537020
الماعز الأجسام المضادة المضادة ل HRP المسمىMilliporeSigma8924
HEPES 1 MMilliporeSigmaH3537-100ML
Isopropanol (درجة البيولوجيا الجزيئية)MilliporeSigmaI9516
كوكتيل الكيتامين / الزيلازينالطب
L-glutamineMilliporeSigmag7513
Magmax RNA طقم تنقيةThermo Fisher ScientificAM1830
MethylcelluloseMilliporeSigmaM0512
MicrocentrifugeEpendorf5424R
MiniCollect 0.5 مل أنابيب EDTABio-one450480
أنابيب O الدائريةThermo Fisher Scientific21-403-195
خطوة واحدة q RT-PCR مزيجثيرمو فيشر Scientific4392938
ParaformaldehydeThermo Fisher ScientificEMS- 15713-S
فوسفات مخزن محلول ملحيMilliporeSigmad8537-500ml
ماصات Proline متعددة القنواتSartorius72230/72240
ماصات Proline أحادية القناةSartorius728230
RNAse مياه خاليةالحرارة فيشر ساينتفيك10-977-023
RNAzol BDMRC الجينRB192
منصة هزازثيرمو فيشر العلمية11-676-333
RPMI 1640فيشرMT10040CV
سابونينميليبورسيجماs7900
ملعقة / ملعقةأدوات العلوم الدقيقة10090-17
مستقيم مقص القطعأدوات العلوم الدقيقة14060-11
Triton X-100MilliporeSigmat8787
الركيزة الزرقاء الحقيقيةVWR95059-168
TrypsinMilliporeSigmaT3924-100ML
للصدأ NC9084634 دبابيسالمقارن من

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lazear, H. M., Diamond, M. S. Zika Virus: New Clinical Syndromes and Its Emergence in the Western Hemisphere. Journal of Virology. 90 (10), 4864-4875 (2016).
  2. Simpson, D. I. Zika Virus Infection in Man. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 58, 335-338 (1964).
  3. Fagbami, A. Epidemiological investigations on arbovirus infections at Igbo-Ora, Nigeria. Tropical and Geographical Medicine. 29 (2), 187-191 (1977).
  4. McCrae, A. W., Kirya, B. G. Yellow fever and Zika virus epizootics and enzootics in Uganda. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 76 (4), 552-562 (1982).
  5. Rodhain, F., et al. Arbovirus infections and viral haemorrhagic fevers in Uganda: a serological survey in Karamoja district, 1984. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 83 (6), 851-854 (1984).
  6. Wikan, N., Smith, D. R. Zika virus: history of a newly emerging arbovirus. Lancet Infect Dis. 16 (7), e119-e126 (2016).
  7. Zika virus outbreaks in the Americas. The Weekly Epidemiological Record. 90 (45), 609-610 (2015).
  8. Brien, J. D. Immunological basis of age-related vulnerability to viral infection. , Oregon Health & Science University. (2007).
  9. Brien, J. D., Uhrlaub, J. L., Nikolich-Zugich, J. West Nile virus-specific CD4 T cells exhibit direct antiviral cytokine secretion and cytotoxicity and are sufficient for antiviral protection. Journal of Immunology. 181 (12), 8568-8575 (2008).
  10. Brien, J. D., Uhrlaub, J. L., Hirsch, A., Wiley, C. A., Nikolich-Zugich, J. Key role of T cell defects in age-related vulnerability to West Nile virus. Journal of Experimental Medicine. 206 (12), 2735-2745 (2009).
  11. Brien, J. D., et al. Genotype-specific neutralization and protection by antibodies against dengue virus type 3. Journal of Virology. 84 (20), 10630-10643 (2010).
  12. Shrestha, B., et al. The development of therapeutic antibodies that neutralize homologous and heterologous genotypes of dengue virus type 1. PLoS Pathogens. 6 (4), e1000823(2010).
  13. Brien, J. D., et al. Interferon regulatory factor-1 (IRF-1) shapes both innate and CD8(+) T cell immune responses against West Nile virus infection. PLoS Pathogens. 7 (9), e1002230(2011).
  14. Pinto, A. K., et al. A temporal role of type I interferon signaling in CD8+ T cell maturation during acute West Nile virus infection. PLoS Pathogens. 7 (12), e1002407(2011).
  15. Brien, J. D., Lazear, H. M., Diamond, M. S. Propagation, quantification, detection, and storage of West Nile virus. Current Protocols in Microbiology. 31, 11-15 (2013).
  16. Brien, J. D., et al. Protection by immunoglobulin dual-affinity retargeting antibodies against dengue virus. Journal of Virology. 87 (13), 7747-7753 (2013).
  17. Messaoudi, I., et al. Chikungunya virus infection results in higher and persistent viral replication in aged rhesus macaques due to defects in anti-viral immunity. PLoS Neglected Tropical Diseases. 7 (7), e2343(2013).
  18. Pinto, A. K., et al. A hydrogen peroxide-inactivated virus vaccine elicits humoral and cellular immunity and protects against lethal West Nile virus infection in aged mice. Journal of Virology. 87 (4), 1926-1936 (2013).
  19. Sukupolvi-Petty, S., et al. Functional analysis of antibodies against dengue virus type 4 reveals strain-dependent epitope exposure that impacts neutralization and protection. Journal of Virology. 87 (16), 8826-8842 (2013).
  20. Pinto, A. K., et al. Deficient IFN signaling by myeloid cells leads to MAVS-dependent virus-induced sepsis. PLoS Pathogens. 10 (4), e1004086(2014).
  21. Pinto, A. K., et al. Defining New Therapeutics Using a More Immunocompetent Mouse Model of Antibody-Enhanced Dengue Virus Infection. MBio. 6 (5), (2015).
  22. Pinto, A. K., et al. Human and Murine IFIT1 Proteins Do Not Restrict Infection of Negative-Sense RNA Viruses of the Orthomyxoviridae, Bunyaviridae, and Filoviridae Families. Journal of Virology. 89 (18), 9465-9476 (2015).
  23. Hassert, M., et al. CD4+T cells mediate protection against Zika associated severe disease in a mouse model of infection. PLoS Pathog. 14 (9), e1007237(2018).
  24. Pinto, A. K., et al. Deficient IFN signaling by myeloid cells leads to MAVS-dependent virus-induced sepsis. PLoS Pathog. 10 (4), e1004086(2014).
  25. Brien, J. D., Lazear, H. M., Diamond, M. S. Propagation, quantification, detection, and storage of West Nile virus. Curr Protoc Microbiol. 31, (2013).
  26. Hassert, M., et al. CD4+T cells mediate protection against Zika associated severe disease in a mouse model of infection. PLoS Pathogens. 14 (9), e1007237(2018).
  27. Fuchs, A., Pinto, A. K., Schwaeble, W. J., Diamond, M. S. The lectin pathway of complement activation contributes to protection from West Nile virus infection. Virology. 412 (1), 101-109 (2011).
  28. Lazear, H. M., Pinto, A. K., Vogt, M. R., Gale, M., Diamond, M. S. Beta interferon controls West Nile virus infection and pathogenesis in mice. Journal of Virology. 85 (14), 7186-7194 (2011).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Zika Virus IsolationViral Titer QuantificationFocus Forming AssayQuantitative PCROrgan HarvestingSpinal Cord ExtractionViral Load AnalysisMouse Infection ModelFlavivirus DetectionViral Pathogenesis

Related Articles