والهدف من البروتوكول هو إظهار التقنيات المستخدمة للتحقيق في الأمراض الفيروسية عن طريق عزل وقياس فيروس زيكا، من أجهزة متعددة في فأر ة بعد العدوى.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
عزل وتقدير كمية لفيروس زيكا من أجهزة متعددة في الماوس
* These authors contributed equally
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
وتبين الأساليب المعروضة الإجراءات المختبرية لعزل الأعضاء عن الحيوانات المصابة بفيروس زيكا والتحديد الكمي للحمولة الفيروسية. والغرض من هذا الإجراء هو قياس التلكرات الفيروسية في المناطق الطرفية والجهاز العصبي المركزي للماوس في نقاط زمنية مختلفة بعد العدوى أو في ظل ظروف تجريبية مختلفة لتحديد العوامل الفيرولوجية والمناعية التي تنظم عدوى فيروس زيكا. تسمح إجراءات عزل الأعضاء التي تم إظهارها لكل من التركيز على تشكيل القياس الكمي والتقييم الكمي لـ PCR للأجهزة التيتريافية. تم تصميم تقنيات عزل الأعضاء السريعة للحفاظ على جهاز نقل الفيروس. يسمح التحديد الكمي للبنفسمن من خلال التركيز على تشكيل اختبار تقييم الإنتاجية السريع لفيروس زيكا. وفائدة التركيز على تشكيل التقييم هي تقييم الفيروس المعدي، والحد من هذا التقييم هو احتمال سمية الأعضاء مما يقلل من حد الكشف. يتم الجمع بين تقييم التتر فيروسي مع PCR الكمي، ويتم تقييم استخدام نسخة الحمض النووي الريبي المؤتلف التحكم في عدد الجينوم الفيروسي داخل الجهاز مع الحد المنخفض للكشف. عموما هذه التقنيات توفر طريقة سرعة سرعة سرعة الإنتاجية لتحليل التوتير الفيروسية زيكا في محيط والجهاز العصبي المركزي للالحيوانات المصابة بفيروس زيكا ويمكن تطبيقها على تقييم titers الفيروسية في أجهزة الحيوانات المصابة بمعظم مسببات الأمراض، بما في ذلك فيروس حمى الضنك.
المقدمة
فيروس زيكا (ZIKV) هو فيروس أربو ينتمي إلى عائلة فلافيريدي، والذي يتضمن مسببات الأمراض البشرية العصبية الغازية الهامة مثل فيروس بواسان (POWV)، وفيروس التهاب الدماغ الياباني (JEV)، وفيروس غرب النيل (WNV)1. بعد عزلها وتحديدها، كانت هناك تقارير دورية عن العدوىالبشرية ZIKV في أفريقيا وآسيا 2،3،4،5،والأوبئة داخل أمريكا الوسطى والجنوبية (استعرضت في المرجع6). ومع ذلك، لم يكن حتى وقت قريب أن ZIKV كان يعتقد أن يسبب مرض شديد7. الآن هناك الآلاف من حالات الأمراض العصبية والعيوب الخلق....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
وتتفق جميع إجراءات هذه الدراسة مع المبادئ التوجيهية التي وضعتها لجنة رعاية الحيوانات واستخدامها في جامعة سانت لويس. SLU معتمدة بالكامل من قبل جمعية تقييم واعتماد المختبرات الدولية لرعاية الحيوانات (AAALAC).
1. عزل الأعضاء
ملاحظة: الفيروس غير مستقر في درجة حرارة الغرفة (RT) لذلك يجب تخطيط عدد الحيوانات التي يتم حصادها في وقت واحد بعناية للحفاظ على titers الفيروسية.
- تصيب الفئران باستخدام الجرعة والطريق المختارين، استنادا ً إلى النمط الظاهري المطلوب. لهذا البروتوكول، تصيب 8-10 أسابيع من العمر الذكور والإناث نوع الأول مستقبلات الإنترفيرون ناقص (Ifnar1-/-) C57BL/6 الفئران.....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
لتقييم titers ZIKV باستخدام البروتوكول المذكور أعلاه Ifnar1-/- تم إصابة الفئران مع ZIKV (PRVABC59) عن طريق حقن تحت الجلد (SC) إلى لوحة القدم. هنا، فإن إدارة 1 × 105 FFU من ZIKV إلى 8-12 أسبوع من العمر Ifnar1-/- الفئران SC ليست قاتلة ولكن الفيروس يمكن تكرارها في كل من محيط والجهاز العصبي المركز. وتستخدم هذه الجرعة والطريق لدراسة الاستجابات المناعية المسببة للأمراض المضيفة ومسببات الأمراض. إدارة 1 × 105 FFU من ZIKV إلى 8-12 أسبو.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
عدوى ZIKV يمكن أن يسبب مرض عصبي وبالتالي فإن النماذج الحيوانية الحالية لدراسة مسببات الأمراض، والاستجابات المناعية والفعالية الوقائية من اللقاحات ومضادات الفيروسات تحتاج إلى التركيز على السيطرة الفيروسية داخل الجهاز العصبي الوطني. أحد التحديات في التركيز على مرض الجهاز العصبي المركزي هو أنه غالبا ما يأتي على حساب دراسة العدوى الطرفية. تركز أساليب عزل الأعضاء المقترحة هنا على الحاجة إلى التقييم السريع لعدوى زيكف في كل من المحيط والجهاز العصبي الوطني من أجل تقييم الأمراض المرتبطة بـ ZIKV بوساطة الجهاز العصبي الوطني ووضع نم.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
أصحاب البلاغ ليس لديهم ما يكشفون عنه
شكر وتقدير
يتم تمويل الدكتور بينتو من منحة البذور من كلية الطب بجامعة سانت لويس وصناديق بدء التشغيل من كلية الطب بجامعة سانت لويس. يتم تمويل الدكتور برين من قبل K22AI104794 جائزة المحقق المبكر من NIAID NIH، فضلا عن منحة البذور من مدرسة جامعة سانت لويس. وبالنسبة لجميع الأفراد الممولين، لم يكن للممولين أي دور في تصميم الدراسة، وجمع البيانات وتحليلها، أو اتخاذ قرار بنشر المخطوطة أو إعدادها.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| 1-برومو -3-كلوروبروبان (BCP) | جين MRC | BP151 | |
| 10 سم مكعب حقنة | ثيرمو فيشر العلمي | BD 309642 | |
| 18 جرام إبرة | ثيرمو فيشر Scientific | 22-557-145 | |
| 1 سم مكعب حقنة تيرابايت | ثيرمو فيشر ساينتفيك | 14-823-16H | |
| 20 سم مكعب حقنة | ثيرمو فيشر العلمية | 05-561-66 | |
| 24 أنبوب مطحنة | Thermo Fisher Scientific | 15 340 163 | |
| 3.2 مم حبات الفولاذ المقاوم | Thermo Fisher Scientific | ||
| 37 & deg; حاضنة ثقافة الأنسجة C | Nuair | 5800 | |
| 4G2 الجسم المضاد | في المنزل | ||
| 96 لوحة قاع مسطحة بئر | Midsci | TP92696 | |
| 96 لوحة قاع مستديرة جيدا | Midsci | TP92697 | |
| Basix 1.5 مل أنابيب eppendorf | Thermo Fisher Scientific | 02-682-002 | |
| التبييض المركزة المبيدات للجراثيم | 30966CT | ||
| CTL S6 محلل | CTL | CTL S6 محلل عالمي | |
| مقص قطع منحني | أدوات العلوم الدقيقة | 14061-11 | |
| Dulbecco ' s النسر المعدل s جلوكوز متوسط - مرتفع مع 4،500 مجم / لتر جلوكوز | MilliporeSigma | D5671 | |
| الإيثانول (درجة البيولوجيا الجزيئية) | MilliporeSigma | e7023 | |
| مصل الأبقار الجنيني | MilliporeSigma | F0926-500ML | |
| ملقط | أدوات العلوم الدقيقة | 11036-20 | |
| حمض الخليك الجليدي | MilliporeSigma | 537020 | |
| الماعز الأجسام المضادة المضادة ل HRP المسمى | MilliporeSigma | 8924 | |
| HEPES 1 M | MilliporeSigma | H3537-100ML | |
| Isopropanol (درجة البيولوجيا الجزيئية) | MilliporeSigma | I9516 | |
| كوكتيل الكيتامين / الزيلازين | الطب | ||
| L-glutamine | MilliporeSigma | g7513 | |
| Magmax RNA طقم تنقية | Thermo Fisher Scientific | AM1830 | |
| Methylcellulose | MilliporeSigma | M0512 | |
| Microcentrifuge | Ependorf | 5424R | |
| MiniCollect 0.5 مل أنابيب EDTA | Bio-one | 450480 | |
| أنابيب O الدائرية | Thermo Fisher Scientific | 21-403-195 | |
| خطوة واحدة q RT-PCR مزيج | ثيرمو فيشر Scientific | 4392938 | |
| Paraformaldehyde | Thermo Fisher Scientific | EMS- 15713-S | |
| فوسفات مخزن محلول ملحي | MilliporeSigma | d8537-500ml | |
| ماصات Proline متعددة القنوات | Sartorius | 72230/72240 | |
| ماصات Proline أحادية القناة | Sartorius | 728230 | |
| RNAse مياه خالية | الحرارة فيشر ساينتفيك | 10-977-023 | |
| RNAzol BD | MRC الجين | RB192 | |
| منصة هزاز | ثيرمو فيشر العلمية | 11-676-333 | |
| RPMI 1640 | فيشر | MT10040CV | |
| سابونين | ميليبورسيجما | s7900 | |
| ملعقة / ملعقة | أدوات العلوم الدقيقة | 10090-17 | |
| مستقيم مقص القطع | أدوات العلوم الدقيقة | 14060-11 | |
| Triton X-100 | MilliporeSigma | t8787 | |
| الركيزة الزرقاء الحقيقية | VWR | 95059-168 | |
| Trypsin | MilliporeSigma | T3924-100ML |
المراجع
- Lazear, H. M., Diamond, M. S. Zika Virus: New Clinical Syndromes and Its Emergence in the Western Hemisphere. Journal of Virology. 90 (10), 4864-4875 (2016).
- Simpson, D. I. Zika Virus Infection in Man. Transactions of the Royal Society of Tr....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
الوسوم
