يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

عزل وثقافة الخلايا البطانية الأبهرية الأولية من الخنازير المصغرة

8.4K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/59673

⸱

أغسطس 14, 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Nephrology, Shenzhen Longhua District Central Hospital, Affiliated Central Hospital of Shenzhen Longhua District, Guangdong Medical University, 2Shenzhen Xenotransplantation Medical Engineering Research and Development Center, Shenzhen Second People's Hospital, First Affiliated Hospital of Shenzhen University, Shenzhen University School of Medicine, 3Department of Medical Laboratory, Shenzhen Longhua District Central Hospital, Affiliated Central Hospital of Shenzhen Longhua District, Guangdong Medical University, 4Department of Endocrinology, Shenzhen Longhua District Central Hospital, Affiliated Central Hospital of Shenzhen Longhua District, Guangdong Medical University, 5Xenotransplantation Program, Department of Surgery, University of Alabama at Birmingham, 6People's Hospital of Longhua

في هذه المقالة

ملخص

يتم وصف طريقة أنزيمية فعالة لعزل الخلايا البطانية الأبهرية البورسينية الأولية (pAECs) من الخنازير المصغرة. يمكن استخدام pAECs الأولية المعزولة للتحقيق في الاستجابة المناعية والتخثر في الزرع xenotransplant.

الملخص

Xenotransplant هو وسيلة واعدة لحل النقص في الأعضاء البشرية للمرضى الذين يعانون من فشل الجهاز في المرحلة النهائية، ويعتبر الخنزير كمصدر مناسب للأعضاء. رفض المناعة والتخثر هما عقبتان رئيسيتان لنجاح زرع xenotransplant. إصابة الخلايا البطانية الوعائية (EC) والخلل مهم لتطوير استجابات الالتهاب والتخثر في زرع الأكسي. وهكذا، فإن عزل الخلايا البطانية الأبهرية البورسينية (pAECs) ضروري للتحقيق في استجابات الرفض المناعي والتخثر. هنا، قمنا بتطوير نهج أنزيمي بسيط لعزل وتوصيف وتوسيع pAECs عالية النقاء من الخنازير المصغرة. أولاً، تم التخدير عن الخنزير المصغر بالكيتامين، وتم استئصال طول الأبهر. ثانيا، تعرض السطح البطانية من الأبهر إلى 0.005٪ كولاجيناز الرابع محلول هضمي لمدة 15 دقيقة، ثالثا، تم كشط سطح بطانة الأبهر في اتجاه واحد فقط مع مكشطة الخلية (<10 مرات)، ولم يتم ضغطها خلال عملية الغاء. وأخيراً، تم تحديد pAECs معزولة من اليوم 3، وبعد مرور 1 والممر 2، عن طريق قياس التدفق مع الأجسام المضادة CD31. وكانت النسب المئوية للخلايا الإيجابية CD31 97.4٪ ± 1.2٪، 94.4٪ ± 1.1٪، و 92.4٪ ± 1.7٪ (يعني ± SD)، على التوالي. تركيز Collagenase الرابع، والوقت الهضمي، واتجاه، وتواتر وكثافة كشط حاسمة لخفض التلوث الليفي والحصول على عالية النقاء وعدد كبير من ECs. في الختام، لدينا طريقة الأنزيمية هي طريقة عالية الفعالية لعزل ECs من الأبهر الخنزير مصغرة، ويمكن توسيع الخلايا في المختبر للتحقيق في استجابات المناعة والتخثر في الزرع xenotransplant.

المقدمة

نقص الأعضاء المتاحة للزرع هو مشكلة المعلقة في جميع أنحاء العالم1. ووفقا لجمعية الصليب الأحمر الصينية، لم يتلق سوى عدد قليل من المرضى الذين يعانون من فشل في الأعضاء في المرحلة النهائية جهازا مناسبا في الصين في عام 2018.

زرع Xenotransplant هو وسيلة واعدة لحل مشكلة نقص الأعضاء. وتعتبر أجهزة الخنزير لتكون الأجهزة الأكثر ملاءمة للبشر بسبب التشابه التشريحي والفيزيولوجي2،3. يرتبط فشل xenograft خنزير إلى حد كبير إلى رفض المناعة الرئيسيات والاستجابات التخثر. الخلايا البطانية البورسينية (ECs) حاسمة لأن هذه الخلايا هي الأولى للتفاعل مع الجهاز المناعي الرئيسي، والذي يتضمن الأجسام المضادة، تكملة، السيتوكينات، والخلايا المناعية (على سبيل المثال، الخلايا T، الخلايا B، والضامة)4،5. Porcine ECs تلعب دورا حيويا في عضو الخنزير وislet xenotransplant6,7. وهكذا، ECs هي خلايا هامة للتحقيق في ردود الرفض والتخثر لطعم الخنزير. مطلوب عزل عالية الجودة من الخنازير ECs لبحوث الزرع xenotransplant.

في محاولات لعزل ECs من أجهزة مختلفة (على سبيل المثال، القلب والكلى والكبد والأبهر)، تم الإبلاغ عن العديد من البروتوكولات في إعداد xenotransplant8،9،10،11،12. ومع ذلك، فإن الحفاظ على ثقافة فائقة النقاء للمركبات الإلكترونية المعزولة يمثل مشكلة بارزة في البروتوكولات القياسية. زيادة تركيز الحل المهضوم، ووقت الهضم غير المناسب وكثافة كشطقد تسهم في زيادة التلوث الليفي في الدراسات الحالية 8،10،13. إلى جانب ذلك، فإن طريقة pAECs معزولة من الخنازير مصغرة هو أقل دراسة. هنا، نقوم بوصف طريقة أنزيمية محسنة لعزل pAECs عالية النقاء من الخنازير المصغرة (Wuzhishan أو Bama). وقد تم تصميم عدة خطوات في البروتوكول للحد من التلوث الليفي والحصول على ECs عالية النقاء.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

وقد وافقت لجنة مراجعة الأخلاقيات بمستشفى شنتشن الشعبى الثانى على استخدام الحيوانات وفقا لمبادئ رعاية الحيوان .

1. إعداد الحيوانات والمتوسطة والمخازن المؤقتة

  1. جهز الخنزير المصغر
    ملاحظة: كانت جميع الخنازير المصغرة خنازير ووزيشان الصينية أو الباما (ذكر). وكان عمر ووزن الخنازير 100 يوم ± 8 أيام و 5.7 كجم ± 1.0 كجم (متوسط ± SD، ن = 3)، على التوالي.
  2. إعداد وسط الثقافة: متوسطة الخلايا البطانية (ECM) مع 10٪ (v/v) الحرارة المعطلة مصل البقر الجنيني (FBS)، 1٪ (V / V) البنسلين / العقديات (P / S) و 1٪ (V / V) ملحق نمو الخلايا البطانية (ECGS).
  3. إعداد المخزن المؤقت للغسيل: 1x حل PBS (pH 7.4) مع 1٪ (v/v) P/S.
  4. إعداد 0.005٪ كولاجيناز الرابع حل الجهاز الهضمي: 1 ملغ من مسحوق الكولاجين الرابع في 20 مل من محلول PBS. قبل تسخين محلول الكولاجين الهضمي عند 37 درجة مئوية قبل الهضم.
  5. إعداد العازلة وقف: دولبيكو تعديل النسر المتوسطة (DMEM) تستكمل مع 10٪ الحرارة المعطلة FBS و 1٪ P / S.

2. الجراحة والتحضير لعزل الخلايا الأبهرية الأبهرية

  1. تطهير غرفة العمليات مع ضوء الأشعة فوق البنفسجية لمدة ساعة واحدة ومطهر طبي 84 السائل (محتوى الكلور المتاحة هو 4.0٪ - 5.0٪، جدولالمواد) قبل إجراء الجراحة.
  2. بعد أن تلقى الخنزير المصغر حقنة عضلية مكونة من 15 ملغم/كغم من الكيتامين، و15 ملغم/كغم من هيدروكلوريد إكسلازين و0.05 ملغم/كغم من هيدروكلوريد فيناسيتين (الأحجام: 100 درجة مئوية/كغم، جدولالمواد) (الشكل1A)،تأكيد هيدروكلوريد الحيوان حالة التخدير مع فحص المحفزات المؤلمة (على سبيل المثال، قرصة أذن واحدة أو هز طرف واحد) ومؤشر الفسيولوجية (على سبيل المثال ضغط الدم والقلب ومعدل الجهاز التنفسي).
    ملاحظة: يمكن إعطاء حقن نصف جرعة أخرى للخنزير إذا كان يظهر علامات الاستيقاظ.
  3. قطع البطن مع مشرط، وفضح الوريد الأجوف السفلي وبالتالي حقن الصوديوم الهيبارين (5000 U، جدولالمواد) في الوريد الأجوف السفلي مع حقنة 5 مل.
  4. بعد خمس دقائق، أدخل قسطرة إلى الشريان الأبهري البطني إلى الدم، وقطع جلد الصدر وتقطيع الحجاب الحاجز مع مشرط ثم قطع البطين الأيسر قبالة.
    ملاحظة: تأكد من أن يتم قتل الخنزير عن طريق التحقق من نبض الأبهر بعد الدم وقطع القلب.
  5. استئصال الأضلاع بملقطالعظام (جدول المواد)، وفضح القلب والرئتين. العثور على الأبهر الخلفي إلى القلب والرئتين والمشبك طرفي. غسل الأبهر مرة واحدة مع قبل تبريد العازلة الغسيل (الشكل1B،C).
  6. قطع الأبهر مع مقص والحفاظ على الأبهر فرضت في كل نهاية. مكوس الأنسجة الزائدة حول الأبهر مع ملقط معقمة ومقص. وضع الأبهر في أنبوب الطرد المركزي 50 مل، وغسل الأبهر مع العازلة الغسيل المبردة مسبقا 3X (30 مل لكل غسل)، ونقل الأبهر إلى المختبر (الشكل1D).

3. عزل الخلايا الأبهرية الأبهرية

  1. في ظل الظروف العقيمة، وإزالة الأبهر الخنزير من العازلة الغسيل، ووضعها على طبق بيتري 150 ملم (الشكل2A).
  2. قطع بلطف طرفي الأبهر والمكوس الأنسجة الزائدة حول الأبهر مع ملقط معقمة ومقص مرة أخرى (الشكل2B). اغسل الجزء الخارجي والداخلي من الأبهر (فوق طبق الثقافة في درجة حرارة الغرفة) بسعة 20-50 مل من مخزن الغسيل المؤقت.
    ملاحظة: حاول فقط قطع المنطقة التي تم وضع المشابك أثناء الجراحة منذ تلف بعض ECs في هذه المنطقة، وإزالة الأنسجة الزائدة والفروع الجانبية الشريانية.
  3. تمرير خياطة جراحية من خلال الأبهر ثم ربط نهاية واحدة من الأبهر باستخدام خياطة الجراحية (5-0، 90cm، جدولالمواد). الحفاظ على خياطة الجراحية في داخل الأبهر (الشكل2C،D).
  4. إصلاح بلطف الأبهر بالقرب من نهاية مرتبطة مع ملقط، ومن ثم سحب خياطة الجراحية ببطء لعكس الأبهر حتى يتعرض سطح بطانة من الأبهر (الشكل2E-G).
    ملاحظة: تأكد من إصلاح الأبهر بالقرب من نهاية مرتبطة ولا إصلاح الأبهر بإحكام، وإلا لا يمكن عكس الأبهر عن طريق سحب خياطة الجراحية.
  5. اغسل السطح البطانية للأبهر مع مخزن الغسيل المؤقت 3x (10 مل لكل غسل)، ثم تجاهل هذا الحل. وضع الأبهر في أنبوب الطرد المركزي 15 مل، وتغطية الأبهر مع 10 مل من 0.005٪ كولاجيناز الرابع حل الجهاز الهضمي في الأنبوب (الشكل2H).
    ملاحظة: قبل تسخين 0.005٪ كولاجيناز الرابع حل الجهاز الهضمي في 37 درجة مئوية قبل الهضم.
  6. قم بالحضانة عند درجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة، ضع الأبهر المهضوم والحل الهضمي في طبق ثقافة 100 مم وأوقف آثار الكولاجين الرابع بنسبة 0.005% بإضافة 10-15 مل من حاجز التوقف المبرد مسبقًا.
    ملاحظة: وقت الهضم الموصى به بين 10 و 20 دقيقة. تأكد من تغطية السطح البطانية للأبهر بواسطة المخزن المؤقت للتوقف.
  7. كشط بلطف pAECs قبالة السطح الداخلي للأبهر باستخدام مكشطة الخلية (الشكل2I). اغسل الأبهر الكشط 3x مع مخزن الغسيل (5 مل في الوقت الواحد). وضع الحل من طبق الثقافة في أنبوب الطرد المركزي 50 مل. غسل الجزء السفلي من طبق الثقافة 2X مع العازلة الغسيل (5 مل في الوقت)، ووضع الحل في أنبوب الطرد المركزي 50 مل مرة أخرى.
    ملاحظة: كشط في اتجاه واحد بلطف ولا ضغط. لا تلمس الأنسجة بالقرب من الحواف والثقوب. يوصى بكشط 5-8x.
  8. الطرد المركزي الأنبوب في 600 × ز لمدة 6 دقائق في 4 درجة مئوية. تخلص من الـ supernatant واترك 10 مل من الحل في الجزء السفلي من أنبوب الطرد المركزي 50 مل. إضافة 20 مل من العازلة الغسيل إلى أنبوب الطرد المركزي 50 مل، وإعادة تعليق الكريات. تجنب فقاعات خلال هذه الخطوة.
  9. الطرد المركزي في 600 × ز لمدة 6 دقائق في 4 درجة مئوية. تجاهل ببطء supernatant. إعادة تعليق الكريات الخلية مع 1 مل من وسط الثقافة وتخلط جيدا.
    ملاحظة: متوسط عدد الـ ECs لكل سم من الأبهر هو 1.9 × 105 ± 1.4 × 104 (متوسط ± SD، n = 3).
  10. عد الخلايا مع عداد خلية. لوحة وثقافة الخلايا في وعاء دون طلاء أي مواد وفقا لرقم الخلية. إذا كان رقم الخلية أقل من أو يساوي 1.0 × 106، خلايا الثقافة في قارورة 25 سم2. إذا كان رقم الخلية أكبر من 1.0 × 106، خلايا الثقافة في عدة قوارير2 2 سم (1.0 × 106 خلايا لكل قارورة). ضع القارورة في حاضنة (دون اهتزاز) عند درجة حرارة 37 درجة مئوية مع 5% من ثاني أكسيد الكربون2 واستبدل الوسيط كل 2-3 أيام.
    ملاحظة: تلف بعض الخلايا بواسطة مكشطة الخلية. ووجد اختبار صلاحية الخلية أن النسبة المئوية للخلايا الحية 95.7٪ ± 1.7٪ (متوسط ± SD، ن = 3). تبلغ مدة مضاعفة الخلايا المعزولة حوالي يوم أو يومين.

4. حصاد وتوصيف الخلايا البطانية النقية

  1. اترك الخلايا تنمو لمدة 4-5 أيام تقريبًا. عندما تصل الخلايا إلى التقاء 80٪ (الشكل3A)،هضم الخلايا مع 0.25٪ التربسين ومرور الخلايا. ثم، جمع بعض الخلايا المعزولة (اليوم 3، الممر 1 والممر 2) وتحديد عن طريق قياس التدفق (مع الأجسام المضادة للCD31).
  2. تسمية pAECs معزولة (رقم الخلية: 1 × 105)(اليوم 3، الممر 1 والممر 2) مع المضادة للبورسيني CD31-fluorescein isothiocyanate (FITC) جسم مضاد مترافق (10 ميكرولتر الأجسام المضادة لكل 100 خلايا مئوية، ملطخة لمدة 30 دقيقة في 4 درجة مئوية) لتحليل تدفق قياس الخلايا.
  3. بوابة إجمالي السكان الخلية الحية مع مؤامرة متناثرة إلى الأمام، عينة غير ملطخة كسيطرة سلبية. ثم تقديم الخلايا الإيجابية CD31 من الخلايا المسورة مع الرسم البياني.
    ملاحظة: فعالية الخلايا الإيجابية CD31 هي 97.4٪ ± 1.2٪ (اليوم 3)، 94.4٪ ± 1.1٪ (P1) و 92.4٪ ± 1.7٪ (P2) (متوسط ± SD)، على التوالي (الشكل3B).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

تهدف طريقتنا إلى توفير طريقة فعالة لعزل الـ ECs عالية النقاء عن الأبهر من الخنازير المصغرة. تظهر عملية جراحة الأبهر في الشكل 1. الخطوة الأولى هي أن يتم استئصال الأبهر كله من الخنزير. منع تلوث الخلايا أو البكتيريا الأخرى مهم جداً. وبالتالي، لا تصيب الأعضاء أو الأنسجة الأخرى في حالة الخلايا غير المستهدفة أو البكتيريا تلوث الأبهر، وغسل الأبهر مع الغسيل قبل تبريد العازلة 3X (الشكل1B-D). خطوة حاسمة أخرى للحفاظ على صلاحية الخلية هي تقليل الفترة الزمني...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

وتستخدم الخلايا البطانية عادة في البحوث من خلل الأوعية الدموية, مرض السكري, تجديد الأنسجة, زرع, والسرطانات14,15,16,17,18. لفهم وتوصيف البيولوجيا ووظيفة ECs في هذه الأمراض، تم الإبلاغ عن العديد من الطرق لعزل ECs من مختلف الأجهزة المريضة أو الأنسجة8،19،20،

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

تم دعم العمل بمنح من مؤسسة العلوم الطبيعية في مقاطعة قوانغدونغ، منحة / جائزة رقم: 2016A030313028؛ مؤسسة البحوث العلمية الطبية في مقاطعة قوانغدونغ، منحة / جائزة رقم: B2018003؛ مؤسسة شنتشن للعلوم والتكنولوجيا، منحة / رقم الجائزة: JCYJ20180306172449376، JCYJ20180306172459580, JCJY20202920484975, GJHZ20170314171357556, JCYJ20160425103000011 و JCYJ201604288142040404045; شنتشن لونغهوا منطقة مؤسسة العلوم والتكنولوجيا، منحة / جائزة رقم: 2017013؛ البرنامج الوطني لمفاتيح R&D في الصين، منحة / جائزة رقم: 2017YFC1103704؛ مشروع سانمينغ للطب في شنتشن، منحة / جائزة رقم: SZSM201412020؛ صناديق خاصة لبناء مستشفيات عالية المستوى في مقاطعة قوانغدونغ (2019)؛ صندوق للانضباط الطبي العالي المستوى بناء شنتشن، منحة / جائزة رقم: 2016031638؛ مؤسسة شنتشن للصحة وتنظيم الأسرة لجنة، منحة / جائزة رقم: SZXJ2017021 وSZXJ2018059. نشكر هانتشنغ تشانغ وزيتشنغ زو من جامعة شنتشن على مساعدتهما فى اعداد المخطوطة .

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
BD FACSAria IIBD العلوم
Boneforcepsبكين HeLi KeChuang التكنولوجيا تطوير المحدودة الصينHL-YGQ   
حقنة يمكن التخلص منها BOON (10 مل)شركة Jiangsu Yile Medical Article Co.، Ltd. الصين
CD31-FITC الأجسام المضادةBio-RadMCA1746F
مكشطةالخلية Corning   ؛3010 #
كولاجيناز الرابعسيجما ألدريتشC5138 # -1G
حقن الكيتامين المركب   ;مصنع الأدوية البيطرية في شنيانغ ، الصينهيدروكلوريد الكيتامين ، 0.3 جم / 2 مل ، زيلازين هيدروكلوريد: 0.3 جم / 2 مل ، هيدروكلوريد فيناسيتين ، 1 مجم / 2 مل
DAPI (4 '، 6-Diamidino-2-Phenylindole ، ثنائي هيدروكلوريد) LifeTechnologiesD1306 #
DMEMLife Technologies11965118 #
ECMSciencell1001 #
ECGSSciencell1052 #
Eppendorf Snap-Cap Microtube (1.5 مل)   ؛AXYGENMCT-150-C #
Falcon 100mm طبق ثقافة الخلاياCorning353003#
مصل الأبقار الجنينيGIBCO10270-106 #
Flowjo v10.0
ملقط   ؛ShangHai الأدوات الطبية المحدودة الصين
الهيبارين الصوديومجيانغسو وانبانغ المستحضرات الصيدلانية الحيوية المحدودة الصين
اليودقويلين LiFeng اللوازم الطبية المحدودة الصين
خنزير مصغر (باما أو Wuzhishan)كانغ يي الزراعة البيئية المحدودة ، الصين
مجهر Mshot   ؛قوانغتشو مايكرو بالرصاص التكنولوجيا المحدودةأطباق بتري M152
(150 × 15 مم)Biologixgroup66-1515 #
Penicillin / StreptomycinLife Technologies15070063 #
قارورة ثقافة خلايا العنق المستطيلة مع غطاء تنفيس؟ تي 25؟كورنينج 3289 #
مقصShangHai الأدوات الطبية المحدودة الصين
ماصات النقل المصلي (10 مل)JET BiofilGSP010010 # 
معقمة باستور ماصةGeneBrickGY0025 #
فلتر حقنة معقمة (0.22 & micro; م)MilliporeSLGV033RS #
مشرط جراحيShangHai الأدوات الطبية المحدودة الصين22 #
خياطة جراحيةشنغهاي بودونغ جينهوان للمستلزمات الطبية المحدودة5-0 #
حقنة؟Shengguang Medical Instrument Co.، Ltd.China
Trypsin-EDTA (0.25٪) ، الفينول الأحمرGIBCO25200056 #
75٪ الكحولالطبي Guilin LiFeng Medical Supplies Co.، Ltd.China
20 × محلول PBS (درجة الحموضة 7.4 ، خالية من النوكليز)Sangon BiotechB540627 #
مطهر طبي 84 سائلمقاطعة سيتشوان Yijieshi Medical Technology Co. ، المحدودة450 مل / زجاجة
الحيوية صبغة

المراجع

  1. Zhang, G. Y., Liao, T., Fu, X. B., Li, Q. F. Organ transplantation in China: concerns remain. Lancet. 385 (9971), 854-855 (2015).
  2. Ekser, B., et al. Clinical xenotransplantation: the next medical revolution? Lancet. 379 (9816), 672-683 (2012).
  3. Cooper, D. K., Ekser, B., Ramsoondar, J., Phelps, C., Ayares, D. The role of genetically engineered pigs in xenotransplantation research. The Journal of Pathology. 238 (2), 288-299 (2016).
  4. Pober, J. S., Sessa, W. C. Evolving functions of endothelial cells in inflammation. Nature Reviews Immunology. 7 (10), 803-815 (2007).
  5. McGill, S. N., Ahmed, N. A., Christou, N. V. Endothelial cells: role in infection and inflammation. World Journal of Surgery. 22 (2), 171-178 (1998).
  6. Ekser, B., Cooper, D. K. Overcoming the barriers to xenotransplantation: prospects for the future. Expert Review of Clinical Immunology. 6 (2), 219-230 (2010).
  7. Yeom, H. J., et al. Porcine aortic endothelial cell genes responsive to selected inflammatory stimulators. The Journal of Veterinary Medical Science. 71 (11), 1499-1508 (2009).
  8. Beigi, F., et al. Optimized method for isolating highly purified and functional porcine aortic endothelial and smooth muscle cells. Journal of Cellular Physiology. 232 (11), 3139-3145 (2017).
  9. Jansen of Lorkeers, S. J., et al. Xenotransplantation of Human Cardiomyocyte Progenitor Cells Does Not Improve Cardiac Function in a Porcine Model of Chronic Ischemic Heart Failure. Results from a Randomized, Blinded, Placebo Controlled Trial. PLOS One. 10 (12), e0143953(2015).
  10. Zhang, J., et al. Potential Antigens Involved in Delayed Xenograft Rejection in a Ggta1/Cmah Dko Pig-to-Monkey Model. Scientific Reports. 7 (1), 10024(2017).
  11. Paris, L. L., et al. ASGR1 expressed by porcine enriched liver sinusoidal endothelial cells mediates human platelet phagocytosis in vitro. Xenotransplantation. 18 (4), 245-251 (2011).
  12. Paris, L. L., Chihara, R. K., Sidner, R. A., Tector, A. J., Burlak, C. Differences in human and porcine platelet oligosaccharides may influence phagocytosis by liver sinusoidal cells in vitro. Xenotransplantation. 19 (1), 31-39 (2012).
  13. Bernardini, C., et al. Heat shock protein 70, heat shock protein 32, and vascular endothelial growth factor production and their effects on lipopolysaccharide-induced apoptosis in porcine aortic endothelial cells. Cell Stress & Chaperones. 10 (4), 340-348 (2005).
  14. Endemann, D. H., Schiffrin, E. L. Endothelial dysfunction. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 15 (8), 1983-1992 (2004).
  15. Graupera, M., Claret, M. Endothelial Cells: New Players in Obesity and Related Metabolic Disorders. Trends in Endocrinology and Metabolism: TEM. 29 (11), 781-794 (2018).
  16. Kawamoto, A., Asahara, T., Losordo, D. W. Transplantation of endothelial progenitor cells for therapeutic neovascularization. Cardiovascular Radiation Medicine. 3 (3-4), 221-225 (2002).
  17. Rafii, S., Lyden, D. Therapeutic stem and progenitor cell transplantation for organ vascularization and regeneration. Nature Medicine. 9 (6), 702-712 (2003).
  18. Jain, R. K., et al. Endothelial cell death, angiogenesis, and microvascular function after castration in an androgen-dependent tumor: role of vascular endothelial growth factor. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (18), 10820-10825 (1998).
  19. Pratumvinit, B., Reesukumal, K., Janebodin, K., Ieronimakis, N., Reyes, M. Isolation, characterization, and transplantation of cardiac endothelial cells. BioMed Research International. 2013, 359412(2013).
  20. Crouch, E. E., Doetsch, F. FACS isolation of endothelial cells and pericytes from mouse brain microregions. Nature Protocols. 13 (4), 738-751 (2018).
  21. Nakano, H., Nakano, K., Cook, D. N. Isolation and Purification of Epithelial and Endothelial Cells from Mouse Lung. Methods in Molecular Biology. 1799, 59-69 (2018).
  22. Naschberger, E., et al. Isolation of Human Endothelial Cells from Normal Colon and Colorectal Carcinoma - An Improved Protocol. Journal of Visualized Experiments. (134), e57400(2018).
  23. Yu, S., et al. Isolation and characterization of endothelial colony-forming cells from mononuclear cells of rat bone marrow. Experimental Cell Research. 370 (1), 116-126 (2018).
  24. Chi, L., Delgado-Olguin, P. Isolation and Culture of Mouse Placental Endothelial Cells. Methods in Molecular Biology. 1752, 101-109 (2018).
  25. Hawthorne, W. J., Lew, A. M., Thomas, H. E. Genetic strategies to bring islet xenotransplantation to the clinic. Current Opinion in Organ Transplantation. 21 (5), 476-483 (2016).
  26. Yi, E., et al. Mechanical Forces Accelerate Collagen Digestion by Bacterial Collagenase in Lung Tissue Strips. Frontiers in Physiology. 7, 287(2016).
  27. Masson-Pevet, M., Jongsma, H. J., De Bruijne, J. Collagenase- and trypsin-dissociated heart cells: a comparative ultrastructural study. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 8 (10), 747-757 (1976).
  28. Yonenaga, K., et al. Optimal conditions of collagenase treatment for isolation of articular chondrocytes from aged human tissues. Regenerative Therapy. 6, 9-14 (2017).
  29. French, M. F., Mookhtiar, K. A., Van Wart, H. E. Limited proteolysis of type I collagen at hyperreactive sites by class I and II Clostridium histolyticum collagenases: complementary digestion patterns. Biochemistry. 26 (3), 681-687 (1987).
  30. Hara, H., et al. In vitro investigation of pig cells for resistance to human antibody-mediated rejection. Transplant International: Official Journal of the European Society for Organ Transplantation. 21 (12), 1163-1174 (2008).
  31. Takashima, A. Establishment of fibroblast cultures. Current Protocols in Cell Biology. Chapter 2, 2.1.1-2.1.12 (2001).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

IV CD31
عزل وثقافة الخلايا البطانية الأبهرية الأولية من الخنازير المصغرة
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.