مقالة منهجية

استخدام مجهرية القوة الذرية لقياس الخصائص الميكانيكية وضغط التورغور للخلايا النباتية والأنسجة النباتية

11.3K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/59674

⸱

يوليو 15, 2019

 ,  , 
1SFR Biosciences, Université de Lyon, 2Laboratoire de Reproduction et Développement des Plantes, Université de Lyon, ENS de Lyon, UCBL, INRA, CNRS

في هذه المقالة

ملخص

هنا، نقدم مجهرية القوة الذرية (AFM)، تعمل كأداة المسافات البادئة نانو والدقيقة على الخلايا والأنسجة. تسمح الأداة بالحصول في وقت واحد على طوبوغرافيا سطح 3D للعينة وخصائصها الميكانيكية، بما في ذلك معامل جدار الخلية يونغ، فضلا عن ضغط التورغور.

الملخص

نقدم هنا استخدام مجهرية القوة الذرية لأنسجة النبات المسافة البادئة واستعادة خصائصه الميكانيكية. باستخدام اثنين من المجاهر المختلفة في وضع المسافة البادئة، ونحن نعرض كيفية قياس معامل مرنة واستخدامها لتقييم خصائص جدار الخلية الميكانيكية. وبالإضافة إلى ذلك، ونحن أيضا شرح كيفية تقييم ضغط التورغور. المزايا الرئيسية للميكروسكوب القوة الذرية هي أنه غير الغازية، سريع نسبيا (5 ~ 20 دقيقة)، وأنه يمكن تحليل أي نوع تقريبا من الأنسجة النباتية الحية التي هي مسطحة سطحيا دون الحاجة إلى العلاج. القرار يمكن أن تكون جيدة جدا، اعتمادا على حجم طرف وعلى عدد القياسات لكل منطقة وحدة. أحد قيود هذا الأسلوب هو أنه يعطي فقط الوصول المباشر إلى طبقة الخلية السطحية.

المقدمة

ينتمي الفحص المجهري للقوة الذرية (AFM) إلى عائلة الفحص المجهري للمسبار المسحي (SPM)، حيث يقوم طرف بنصف قطر يبلغ عادة بضعة نانومترات بمسح سطح العينة. لا يتم الكشف عن سطح عن طريق الأساليب البصرية أو المستندة إلى الإلكترون، ولكن عن طريق قوى التفاعل بين الطرف وسطح العينة. وبالتالي، فإن هذه التقنية لا تقتصر على التوصيف الطبوغرافي لسطح العينة (دقة ثلاثية الأبعاد يمكن أن تنخفض إلى بضعة نانومترات)، بل تسمح أيضا بقياس أي نوع من قوى التفاعل مثل الكهروستاتيكي، فان دير والز أو قوى الاتصال. وعلاوة على ذلك، يمكن استخدام الطرف لتطبيق القوى على سطح عينة بيولوجية وقياس التشوه الناتج، ما يسمى "المسافة البادئة"، من أجل تحديد خصائصه الميكانيكية (على سبيل المثال، معامل يونغ، خصائص لزجة).

الخصائص الميكانيكية لجدران الخلايا النباتية ضرورية يجب أخذها فيالاعتبار عند محاولة فهم الآليات الكامنة وراء العمليات التنموية 1،2،3. في الواقع، يتم التحكم في هذه الخصائص بإحكام أثناء التنمية، لا سيما منذ تليين جدار الخلية مطلوب للسماح للخلايا بالنمو. يمكن استخدام AFM لقياس هذه الخصائص ودراسة الطريقة التي تتغير بين الأعضاء والأنسجة أو مراحل النمو.

في هذه الورقة، ونحن نصف كيف نستخدم AFM لقياس كل من خصائص جدار الخلية الميكانيكية والضغط turgor. يتم عرض هذين الطلبين على اثنين من المجاهر AFM مختلفة ومفصلة هنا بعد.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1. قياس الخصائص الميكانيكية جدار الخلية

ملاحظة: يتم تقديم مثال على تطور gynoecium من أرابيدوبسي.

  1. إعداد العينات البيولوجية
    1. جمع برعم زهرة مغلقة في المرحلة 9 إلى 10 (حوالي 0.5 ملم طويلة) وفقا للمراحل المنشورة تحديد لArabidopsis4. تحت منظار، وذلك باستخدام ملاقط غرامة، وفتح بعناية برعم للتحقق من مرحلة التنمية وجمع gynoecium تقع في وسط زهرة.
    2. وضع gynoecium على شريط جانبي مزدوج وضعت في وسط غطاء طبق بيتري صغير (قطرها 5 سم).
      ملاحظة: وكبديل لذلك، يمكن أيضا استخدام الغراء المتوافق بيولوجيا لشل قدرأكبر من الكفاءة للعينة عند المسافة البادئة.
    3. إضافة الماء بسرعة حتى يتم تغطية العينة تماما. هذا يتجنب الجفاف ويقلل من التصاق الطرف إلى العينة. بدلا من ذلك، غمر العينة في وسط السائل، مثلأرابيدوبس قمة الثقافة المتوسطة 5.
  2. معايرة AFM
    1. تعيين الكانتيلفر الربيع ثابت ك عالية بما فيه الكفاية للسماح تشوه سطح العينة تصل إلى المسافة البادئة المطلوبة، ولكن ليس عالية جدا لتجنب فقدان الحساسية.
      ملاحظة: كقاعدة تقريبية من الإبهام، إذا كان من المعروف معامل يونغ من العينة، يمكن اختيار ترتيب حجم ثابت الربيع كما ك-E * δ، حيث δ هو المسافة البادئة المطلوبة.
    2. استخدم R = 400 نانومتر رأس كروية منتهية مع مسافة 15 ميكرومتر tip-cantilever.
      ملاحظة: يرتبط نصف قطر الطرف مباشرة بالدقة الجانبية. عموما، للمسافة البادئة على المواد البيولوجية، واختيار نصائح مدورة(R أكبر من 10-20 نانومتر) أو تحقيقات الغروية. قد تكون المسبارات الغروية الصغيرة صعبة الاستخدام بسبب المسافة الصغيرة بين نهاية الطرف والشمعدانات التي يمكن أن تلمس سطح العينة.
    3. قم بتشغيل البرنامج ووضع الرأس أفقياً على الأقل 2-3 ساعة قبل التجربة: وهذا سيسمح للرأس بالحرارة وسوف يتجنب الحركات النسبية التي يسببها الكانتيلفير بالحرارة. إذا تم تجهيز المجهر مع وحدة CellHesion (توسيع نطاق Z بيزو المتاحة إلى 100 ميكرومتر بدلا من 15 م)، التبديل على وحدة التحكم الخاصة به أولا ثم حدد وضع CellHesion عند بدء تشغيل البرنامج.
    4. جبل cantilever على كتلة زجاجية وجبل كتلة على الرأس. وضع قطرة من عدد قليل من ميكرولتر من المياه فائقة النقاء على طرف لتجنب تشكيل فقاعات الهواء عندما يتم غمس غيض في الماء.
    5. ضع عينة صلبة (الشريحة الزجاجية النظيفة أو الياقوت) وإضافة 30-50 درجة مئوية من الماء النقي.
      ملاحظة: إجراء المعايرة الموضح هنا هو معايرة الاتصال التي تسمى في بعض الأحيان. أولا، يتم إجراء منحنى قوة على سطح صلب ومسطح ومن ثم يتم تسجيل الطيف التذبذب من cantilever متحمس حراريا من أجل حساب ثابت الربيع. توجد بروتوكولات معايرة أخرى وسيتم وصفها بإيجاز في فقرة المناقشة.
    6. وضع الرأس على خشبة المسرح (كن حذرا لرفع المحركات Z عالية بما فيه الكفاية). استخدام الصورة البصرية لوضع الليزر تقريبا على cantilever.
      1. نقل الليزر على طول المحور الرئيسي للcantilever رصد إشارة مجموع على الصمام الضوئي.
        ملاحظة: عند استخدام cantilevers القياسية، يجب الحصول على مبلغ أكبر من 0.5 V.
      2. نقل الليزر على طول الاتجاه الآخر وتعظيم إشارة مجموع من أجل وضع الليزر في منتصف cantilever. وهذا سوف يقلل من الحديث المتبادل بين الانحراف الجانبي والرأسي.
    7. قياس حساسية الانحراف
      ملاحظة: ويقرأ الصمام الضوئي الإزاحة بالليزر ويوفر إشارة في فولت. ولكي تكون قادرة على قياس الانحراف في الوحدة المترية، يجب قياس حساسية الانحراف.
      1. تعيين الصك في الاتصال → قوة مطياف. تعيين setpoint النسبية إلى 2 V، Z طول إلى 0.5 ميكرومتر، وتمديد السرعة إلى 2 ميكرومتر / ثانية (معدل العينة إلى 10000 هرتز) وحدد Z حلقة مغلقة.
      2. افتح مدير المعايرة وحدد جزء الاتصال من منحنى القوة (الذي يجب أن يكون خطيًا) لجعل الاحتواء الخطي: يعطي معكوس المنحدر حساسية الانحراف. يتم الآن معايرة قراءة الصمام الضوئي في وحدة مترية.
    8. تحديد ثابتالربيع. في مدير المعايرة،حدد ثابت الربيع لتشغيل اكتساب الطيف الحراري. لمتوسط الإشارة لفترة أطول، حدد الرمز . قد يظهر طيف الطاقة من cantilever متحمس حراريا عدة قمم; رسم مجموعة مختارة حول واحد وضعت في أدنى تردد لتناسب ذلك.
      ملاحظة: إذا تم تنفيذ اللحن الحراري في السائل، فإن ذروة الرنين تكون أوسع وترددها خفضت بالمقارنة مع واحد الاسمية.
  3. إعداد تجربة التحليل الطيفي للقوة واكتسابها
    1. وضع العينة على مرحلة AFM ووضع الرأس فوق العينة.
      ملاحظة: تأكد من أن الرأس قد تراجع بما فيه الكفاية لتجنب اتصال الثابت بين الطرف وسطح العينة.
    2. دع الكانتيلفير يُهمر ّ لبضع دقائق.
    3. في وضع QI، نهج مع قوة Setpoint من 50 nN.
    4. تعيين طول Z من 4 ميكرومتر ومنطقة المسح الضوئي إلى 80 × 80 ميكرومتر2 مع عدد من بكسل من 40 × 40. في لوحة إعدادات التصوير المتقدمة، قم بتعيين الوضع إلى سرعة ثابتة. قم بتعيين سرعة التمدد والتراجع إلى 200 درجة مئوية/ثانية ومعدلات العينة إلى 25 كيلوهرتز.
    5. ابدأ المسح الضوئي واستخدم هذا المسح السريع المنخفض القوة للتحقق مما إذا كانت العينة تتحرك. تحقق من أن المنطقة الممسوحة ضوئيًا خالية من الحطام أو الخلايا المنحرفة وتحديد موقع منطقة ذات أهمية ممكنة لإجراء القياسات.
      ملاحظة: من أجل تقدير الميل عينة حقيقية، يجب تعيين تسوية خط إلى إيقاف أو إلى ثابت. زاوية الميل المفرط بين محور المسافة البادئة والسطح سيكون لها تأثير على معامل الشباب قياس5.
    6. بمجرد تحديد موقع منطقة اهتمام، حدد منطقة من 40 × 40 إلى 60 × 60 ميكرومتر2 حولها وزيادة عدد بكسل لتصل إلى 2 بكسل / ميكرومتر. ضبط هذه القيمة، إذا لزم الأمر، في بداية التجربة. تقليل طول Z إلى 2 ميكرومتر.
    7. بدء المسح الضوئي وحفظ الإخراج (يتكون بشكل عام من صورة وملف بيانات).
    8. في نهاية يوم القياس، قم بإزالة حامل الطرف واشطفه بلطف بالماء النقي و70% EtOH.
    9. تجفيف وإزالة العلبة. لمزيد من التجارب مع نفس الطرف، والنظر في تنظيفه مع بروتوكول التنظيف الرطب، وإذا كان ذلك ممكنا، متابعة البلازما O2 العلاج. لا تدع الماء يجف على الكانتيلف و / أو حامل طرف لتجنب تبلور الملح.
  4. تحليل البيانات (لإصدار برنامج معالجة البيانات 6.x)
    1. افتح برنامج معالجة البيانات واحمّل ملف البيانات.
    2. انقر على استخدام هذه الخريطة لزر معالجة الدفعات من أجل استخدام نفس معلمات التحليل على جميع منحنيات الخريطة.
    3. في عملية التحميل المعرفة مسبقًا، حدد Hertz fit.
    4. استخدم علامة التبويب الأولى للتحقق من معلمات المعايرة أو تغييرها.
    5. في علامة التبويب الثانية، قم بإزالة إزاحة (أو إزاحة بالإضافة إلى إمالة) من الأساس لتعيين متوسط القيمة إلى 0.
    6. في علامة التبويب الثالثة، قم بتقدير موضع نقطة الاتصال (POC) من خلال اعتبارها النقطة الأولى التي تعبر القوة 0 عند النزول من قيمة نقطة البداية على طول منحنى التمدد.
    7. يقوم موضع الطرف العمودي بحساب حركة التعام عن طريق طرح انحراف الكانتليفيمن عن الارتفاع المقاس. في هذه الخطوة، استخدم الارتفاع غير الملساء (البيانات الخام) للاحتواء التالي، عن طريق التحقق من خانة الاختيار المقابلة.
    8. في علامة التبويب تناسب المرونة، حدد نموذج الملاءمة المناسب. إذا لم يكن التصاق أو ضعيف مرئيعلى منحنيات التراجع (المقابلة لأقل من 10% من قوة نقطة الضبط أو الحد الأقصى لمتوسط القوة في عمق المسافة البادئة المحدد)، يجب تعيين نوع الطراز إلى Hertz/Sneddon ويجب استخدام منحنى التمدد. في حالة التصاق أقوى، يجب تفضيل نموذج DMT، الذي يرمز إلى نموذج Derjaguin-Muller-Toporov، وينبغي أن يؤديها تناسب على منحنيات التراجع (راجع دليل للحصول على تفاصيل حول نماذج الاتصال المتاحة والصيغ ذات الصلة).
      1. تعيين المعلمات الهندسية تلميح على أساس شكل تلميح الاسمية. هنا، شكل تلميح هو المجال وتلميح نصف قطرها هو 400 نانومتر.
      2. تعيين نسبة بواسون إلى 0.5 كما يتم ذلك تقليديا للمواد البيولوجية (المقابلة للمواد غير قابلة للضغط).
    9. احتواء المسافة البادئة المحددة. بشكل افتراضي، يتم تنفيذ الاحتواء عبر المنحنى بأكمله. إذا كان يجب أن يتم الاحتواء حتى مسافة بادئة معينة، فتحقق أولاً من خانة الاختيار Shift Curve; سيؤدي ذلك إلى تحويل أصل المنحنى استنادًا إلى قيم خط الأساس وPOC المحددة حديثًا.
      1. إضافة روتين مرونة الثاني تناسب عن طريق النقر على أيقونة على النافذة الرئيسية.
      2. تعيين مرة أخرى كافة المعلمات تناسب وتحديد في X دقيقة المسافة البادئة المطلوبة. إضافة العديد من الخطوات اللازمة (2 إلى 3 خطوات ينبغي أن تكون كافية) من أجل صقل تحديد موقف POC وبعد ذلك عمق المسافة البادئة المحسوبة. يمكن حفظ العملية عند هذه النقطة.
    10. انقر على الاحتفاظ وتنطبق على الجميع لتكرار الخطوات السابقة على جميع منحنيات الخريطة.
    11. حفظ النتائج. سيتم الحصول على صورة وملفات .tsv.

2. قياس الضغط التورغور

ملاحظة: يتم تقديم مثال على الإزهار الذي يعالج من الأوريزالين من أرابيدوبسي.

  1. إعداد عينة بيولوجية
    1. جمع الإزهار العربي (IM) تعامل مع microtubule depolymerizing المخدرات oryzalin من النباتات في المختبر نمت على المتوسطة التي تحتوي على مثبطات نقل أوكسين القطبية 1-N-Naphthylphthalamic حمض (NPA) بعد طريقة نشرت 6.
    2. تركيب عينة IM بعد أحد الخيارين
      1. للرصد على المدى الطويل: قم بتركيب العينة في طبق بيتري يحتوي على ثقافة أرابيدوبسي قمة متوسطة (ACM)7و8 و 0.1% خليط الحفاظ على النباتات (PPM)، لمنع التلوث. تعليق طرف IM فوق سطح ACM ودعم قاعدة IM مع انخفاض من 2٪ agarose.
      2. للقياس مع التغيرات الحل السريع: جبل العينة في طبق بيتري عقد قطعة صغيرة من المصطكي لاصقة، وختم بسرعة الفجوة بين المصطكي وقاعدة العينة مع الغراء الحيوي متوافق. انتظر الغراء لتترسخ (أقل من 2 دقيقة)، ثم غمر العينة في ACM السائل الذي يحتوي على 0.1٪ PPM.
        ملاحظة: تأكد من أن سطح العينة غير مغطى بأجاروز أو الغراء عند تحديد قاعدة العينة. يتطلب قياس AFM لضغط التورغور تركيب العينة بشكل كبير، وتوفر أساليب التركيب السابقة استقرارًا مقبولًا. اعتمادا على العينة، يمكن استخدام أساليب التركيب الأخرى، مثل الشريط على الوجهين، بولي يسين، الخ.
  2. معايرة AFM
    1. قم بتشغيل برنامج اكتساب AFM واختر وضع قياس PeakForce QNM (سعة كبيرة).
    2. إجراء المعايرة باتباع نفس المبدأ الموضح في الخطوات من 2.1 إلى 2.6.
    3. في الإطار "التحقق من المعلمات"، قم بتعيين حجم المسح الضوئي إلى 0. في إطار المنحدر، تعيين حجم المنحدر بين 200 نانومتر و 500 نانومتر، عتبة Trig بين 2 V و 5 V وعدد العينات إلى 2048 أو أعلى.
    4. قم بمحاذاة طرف الكانتيلفير مع عينة المعايرة وانقر على نهج.
    5. عند الاتصال، انتقل إلى نافذة المنحدر وانقر على زر المنحدر المستمر. على النظام الخطي للمنحنى، حدد الميل بالنقر فوق الزر تحديث الحساسية. كرر قياس حساسية الانحراف عدة مرات وتحديث المعايرة يدويًا بمتوسط القياس عن طريق فتح كاشف الجدولة من معايرةالقائمة .
    6. سحب رأس AFM وإزالة عينة المعايرة.
      ملاحظة: ويقترح لسحب تماما رئيس AFM عن طريق اختيار علامة التبويب المرحلة → تهيئة لمنع الاتصال الثابت عرضي على تغيير العينة.
  3. إعداد تجربة التحليل الطيفي للقوة واكتسابها
    1. إذا لم يتم غمر العينة حتى الآن، غمرها مع ACM السائل الذي يحتوي على PPM.
    2. في برنامج الاقتناء، حدد معلمات القياس على النحو التالي:
      1. في نافذة المعلمة Check، قم بتعيين ثابت الربيع إلى ثابت الربيع المصنع في cantilever أو ثابت الربيع المحدد كما هو الحال في الخطوة 2.8. في هذا المثال، يتم تعيينه في 42 N/m.
      2. تعيين دائرة نصف قطر تلميح إلى 400 نانومتر في هذا المثال.
      3. تعيين نسبة بواسون عينة إلى 0.5، منذ الماء يساهم أساسا في ضغط التعكر.
      4. تعيين عينة / خط إلى 128 لضمان اكتساب سريع.
      5. تعيين معدل المسح الضوئي إلى 0.2 هرتز.
      6. تعيين حجم المسح الضوئي إلى 1 ميكرومتر.
        ملاحظة: قد يؤدي تعيين معدل المسح الضوئي وحجم المسح الضوئي الصغير إلى منع تلف العينة الذي يتم تشغيله بالمسح الضوئي AFM بشكل فعال. من المستحسن تقليل هذه المعلمات اثنين على أي تغيير عينة.
      7. في نافذة المنحدر، تعيين حجم المنحدر إلى 5 ميكرومتر.
        ملاحظة: فمن الأفضل وضع حجم المنحدر أكبر من عمق المسافة البادئة المقصود للحصول على خط الأساس أفضل.
      8. تعيين عتبة Trig إلى أقصى حد.
      9. تعيين عدد العينات إلى 4608.
      10. اختياريا، في المجهر → علامة التبويب معلمات المشاركة، والحد من المعلمات التالية لمنع ضرر عينة قوية الناجمة عن الاتصال. تعيين نقطة تعيين مشاركة قوة الذروة إلى 0.3 V (الافتراضي 0.5 V). تعيين كسب المشاركة int. إلى 0.5 (الافتراضي 0.75). تعيين SPM خطوة إشراك إلى 4 ميكرومتر (الافتراضي 15 ميكرومتر).
    3. وضع ومحاذاة العينة تحت رأس AFM، ونهج حتى يتم غمر cantilever ولكن ليس في اتصال مع سطح العينة.
      ملاحظة: أثناء الاقتراب، ضربة طفيفة على سطح السائل ACM حتى يتم تشكيل جسر سائل بين cantilever والسطح السائل. هذا عادة ما يمنع الاتصال الثابت.
    4. مع الرعاية، نهج يدويا نحو العينة. عندما يكون المسبار قريبًا نسبيًا من سطح العينة، انقر فوق نهج.
    5. عند الاتصال، قم بزيادة حجم المسح الضوئي و/أو معدل المسح الضوئي تدريجيًا حتى يتم تحقيق التوازن المطلوب دون الإضرار بالعينة و/أو العلبة.
      ملاحظة: يقتصر حجم المسح الضوئي من خلال انحناء السطح وخشونة العينة. في حالة IM المعالجة أوريزالين، يمكن تحقيق 50 × 50 ميكرومتر2 منطقة المسح الضوئي مع معدل المسح الضوئي من 0.3 هرتز.
    6. أثناء المسح الضوئي، حدد ما إذا كانت منطقة القياس على النحو المطلوب. نقل إذا لزم الأمر. عندما راض، انقر فوق زر نقطة واطلاق النار لبدء نقطة واطلاق النار نافذة.
    7. قبل تسجيل الفحص، اختر قناة صورة مناسبة قد تسهل التعرف الواضح على ملامح الخلية. في كثير من الأحيان، خطأ قوة الذروة، DMT معامل، LogDMT معامل أو تبديد هو مناسب. حدد حفظ الدليل واسم الملف. ثم انقر فوق منحدر على المسح الضوئي المقبل لبدء التسجيل.
      ملاحظة: سيتم إضافة سلسلة من نقطة وثلاثة أرقام تلقائياً بعد اسم الملف المعين (مثل .000). يزيد هذا الرقم تلقائيًا بمقدار 1 عند كل تكرار مسح محفوظ.
    8. عند اكتمال الفحص، سيتم إعادة توجيه واجهة البرنامج تلقائيًا إلى نافذة Ramp. انقر على الصورة الممسوحة ضوئيًا لتحديد المواضع التي يتم تحديدمسافة بادئة.
      ملاحظة: قبل تسجيل المسافات البادئة، فمن الأفضل اختيار العديد من المعالم لتنفيذ المسافات البادئة اختبار عن طريق النقر على منحدرفقط، في حالة مطلوب التناوب المعلمة (لحجم المنحدر، موقفبيزو، الخ). يجب أن يكون عمق المسافة البادئة أكبر من سمك جدار الخلية (يتم تحديده بشكل مثالي بشكل منفصل عن طريق الفحص المجهري للإلكترون).
    9. اختر ثلاثة مواقع مسافة بادئة على الأقل لكل خلية بالقرب من مركز المسافات الخارجية، وكرر المسافة البادئة ثلاث مرات لكل موقع. ومن شأن ذلك أن يسفر عن تسعة منحنيات قوة على الأقل لكل خلية لإجراء مزيد من التحليل. عندما يكون راضيا عن وضع موقع المسافة البادئة، انقر فوق منحدر والتقاط. يتم حفظ منحنيات المسافة البادئة force تلقائياً إلى الدليل المعين.
    10. عند اكتمال المنحدرات، انتقل إلى موضع مختلف لقياس التجانب، أو اسحب رأس المسح الضوئي وتغيير العينة.
    11. عند الانتهاء، تنظيف cantilever كما هو الحال في الخطوتين 1.3.8 و 1.3.9.
  4. تحليل البيانات
    1. في برنامج التحليل، افتح الملف *.mca. يوضح هذا موضع كل منحنى قوة على الصورة الممسوحة ضوئيًا. إذا رغبت في ذلك، حدد قبل منحنيات القوة للتحليل.
    2. فتح منحنى قوة واحد لتحليلها، عادة في شكل x0000y.00z، حيث x هو اسم الملف المحدد في دليل الحفظ بينما y و z يتم تسجيل أرقام تلقائياً تدل على تسلسل المسافة البادئة ورقم المسح الضوئي.
    3. انقر فوق الزر تصحيح الأساس واسحب خطوط الاندفاع الزرقاء على منحنى القوة حتى يتم توسيع بدء خط الأساس المصدر وإيقاف خط الأساس الموسع بنسبة 0% و80%، على التوالي. انقر فوق تنفيذ.
      ملاحظة: بدلاً من ذلك، قد يتم تعيين "إيقاف أساس المصدر الموسع" في قيم مختلفة طالما أنه لا يزال ضمن الأساس وليس خارج نقطة الاتصال.
    4. انقر فوق الزر عامل تصفية Boxcar ثم انقر فوق تنفيذ لمنحنى قوة ناعمة.
    5. انقر فوق الزر المسافة البادئة.
      1. في إطار الإدخال، قم بتعيين المنحنى النشط لتوسيع .
      2. تعيين أسلوب الملاءمة إلى نموذج خطي وتضمين قوة التصاق إلى نعم.
      3. تعيين الحد الأقصى للقوة صالح إلى 99٪ والحد الأدنى قوة صالح إلى 75٪.
      4. تعيين نموذج تناسب صلابة (خطي).
        ملاحظة: هذا الإعداد سوف يحسب صلابة واضحة ك لخصم ضغط التورغور. في هذا المثال، تعكس حدود الملاءمة صلابة تناسب حوالي 1.5 ميكرومتر عمق المسافة البادئة.
    6. يمكن تحليل منحنيات القوة دفعة واحدة. انقر فوق الزر تشغيل المحفوظات، وحدد دليل التقرير وإضافة كافة منحنيات القوة الأخرى التي تتطلب نفس المعاملة. عندما يكون راضياً، انقر فوق تشغيل. بشكل افتراضي، سيتم تخزين الاحتواء كملف *.txt.
    7. عند تركيب مجموعة k، انقر فوق المحفوظات → 5 المسافة البادئة للعودة إلى إطار المسافة البادئة.
      1. تغيير الحد الأقصى للقوة تناسب إلى 10٪ والحد الأدنى صالح القوة إلى 0٪.
      2. تعيين نموذج صالح إلى هرتزيان (كروية).
        ملاحظة: هذا سوف يحسب جدار الخلية الشباب معامل E لخصم الضغط التورغور. في هذا المثال، تعكس حدود الملاءمة تناسب هرتزيان (باستخدام مسبار كروي) من حوالي 0.4 ميكرومتر عمق المسافة البادئة.
    8. كرر الخطوة 2.4.6 للدفعة تناسب E.
    9. افتح الملف *.00z (z هو رقم الفحص المسجل تلقائيًا) لعرض قنوات المسح الضوئي المختلفة. في إطار قناة الارتفاع، انقر فوق زر المقطع. وهذا سيسمح بقياس انحناء سطح العينة المطلوب لخصم ضغط التورم.
      1. ارسم خطًا عبر المحور الطويل لخلية واحدة، وحرّك حدود خط شرطة إلى حواف الخلية، وسجل قيمة نصف القطر r1. كرر هذا للمحور القصير لاسترداد نصف قطر r2. حساب سطح الخلية يعني انحناء M وانحناء غاوسي ة G باستخدام قياس الراديواثنين على النحو التالي:
        figure-protocol-1وfigure-protocol-2 
    10. استنتاج ضغط التورغور P باستخدام نموذج رقيقة قذيفة نشرت9 على النحو التالي:
      figure-protocol-3 
      مع
      figure-protocol-4
      حيث t هو سمك جدار الخلية التي يحددها على سبيل المثال المجهر الإلكتروني.
      ملاحظة: خصم ضغط التورغور هو عملية ملائمة، حيث التكرارات مطلوبة. أربعة تكرارات عموما قادرة على إعادة إنتاج منتج مستقر، ولكن يمكن القيام بالمزيد من التكرارات (على سبيل المثال 100 مرة).
    11. حساب متوسط Eو k و P لكل خلية. أيضاً، قم بتسجيل التباين داخل الخلايا (مثل الانحراف المعياري) للوثائق.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

ويبين الشكل 1ألف والشكل 1باء لقطة شاشة توضح نتيجة الخطوات 1-3-4 إلى 1-3-6 من البروتوكول، المستخدمة لتحديد موقع منطقة ذات أهمية يمكن فيها الحصول على خريطة QI. ومن الجدير بالذكر أنه قد تم اختيار المنطقة ذات الأهمية لكي لا تكون على سطح مائل (أي مسطحة قدر الإمكان). في الواقع، كما لاحظ روتييه وآخرون5،إذا كان محور المسافة البادئة ليست عمودية على السطح، يمكن التقليل من معامل الشباب قياس. يظهر هذا التأثير في الزاو...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

يتم تحديد ظهور الأشكال في النباتات بشكل رئيسي من خلال معدل منسق واتجاه النمو خلال الزمان والمكان. يتم تغليف الخلايا النباتية في جدار خلية جامدة مصنوعة من مصفوفة polysaccharidic، الذي يلصق لهم معا. ونتيجة لذلك، يتم التحكم في توسيع الخلية من خلال التوازن بين ضغط التورغور سحب على جدار الخلية، وصلابة جدار الخلية مقاومة لهذا الضغط. من أجل فهم الآليات الكامنة وراء التنمية، من المهم أن تكون قادرة على قياس كل من الخصائص الميكانيكية جدار الخلية، فضلا عن ضغط التعكر في أنسجة أو خلايا مختلفة من جهاز معين. وكما هو مبين في هذه الورقة،...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

ونود أن نشكر فريق بلاتيم على دعمه التقني، وكذلك أريزكي بودووأعضاء فريق الفيزياء الحيوية في مختبر RDP لإجراء مناقشات مفيدة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
<قوي >متوسط النمو < / قوي >
محلولفيماتين المستخدم في صنع ACM ، التكوين انظر Stanislas et al. ، 2017. أضف إلى ACM بعد التعقيم ، قبل الصب.
1-N-حمض النفثيل الفثلاميك (NPA)Sigma-Aldrich / Merck132-66-1يضاف إلى وسط نبات الأرابيدوبسيس ، 10 مو ؛ يضاف بعد التعقيم قبل الصب.
أجار أجارسيجما ألدريتش / ميرك9002-18-0أضف إلى متوسط أرابيدوبسيس ، 1٪ وزن / حجم.
AgaroseMerck Millipore9012-36-6لصنع ACM صلب ، 0.8٪ وزن / حجم.
نبات الأرابيدوبسيس < / em> متوسطDuchefa BiochimieDU0742.0025لثقافة الأرابيدوبسيس في المختبر ، 11.82 جم / لتر.
الكالسيوم رباعي هيدراتسيجما ألدريتش / ميرك13477-34-4يضاف إلى وسط نبات الأرابيدوبسيس ، 2 ملليمتر.
موراشيج & أمبير SKOOG MEDIUMDuchefa BiochimieM0221.0025خليط الملح القاعدي ، يستخدم في صنع ACM ، 2.2 جم / لتر.
N6-benzyladenine (BAP)Sigma-Aldrich / Merck1214-39-7المستخدمة في صنع ACM ، 555 نانومتر. أضف إلى ACM بعد التعقيم ، قبل الصب.
OryzalinSigma-Aldrich / Merck19044-88-3لعلاج oryzalin ، 10 & mu ؛ جم / مل.
خليط حفظ النبات (PPM)تقنيةالنباتية المستخدمة في صنع ACM ، 0.1٪ v / v. أضف إلى ACM بعد التعقيم ، قبل الصب.
يستخدم هيدروكسيد البوتاسيومDuchefa Biochimie1310-58-3لصنع وسط نبات الأرابيدوبسيس و ACM ، وكلاهما الرقم الهيدروجيني 5.8.
السكروزDuchefa Biochimie57-50-1يستخدم في صنع ACM ، 1٪ وزن / حجم.
<أدوات قوية > ل AFM< / strong>
BioScope Catalyst BioAFMBrukerيستخدم AFM لقياس ضغط التورم في هذا البروتوكول.
Nanowizard III + CellHesionJPK (Bruker)يستخدم AFM لقياس الخواص الميكانيكية.
الهيكل المرن المرجعي PatafixUHUD1620
NanoIdea2Z00026
Reprorubber-Thin PourFlexbar16135غراء متوافق حيويا.
نصائح AFM كرويةNanoandmoreSD-SPHERE-NCH-S-10نصائح تستخدم لقياس الخواص الميكانيكية.
1,000x مخزون يستخدم نترات الخلايا

المراجع

  1. Du, F., Guan, C., Jiao, Y. Molecular mechanisms of leaf morphogenesis. Molecular Plant. 11, 1117-1134 (2018).
  2. Cosgrove, D. J. Growth of the plant cell wall. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6, 850-861 (2005).
  3. Dumais, J. Can mechanics control pattern formation in plants? Current Opinion in Plant Biology. 10, 58-62 (2007).
  4. Smyth, D. R., Bowman, J. L., Meyerowitz, E. M. Early flower development in Arabidopsis. The Plant Cell. 2, 755-767 (1990).
  5. Routier-Kierzkowska, A. L., et al. Cellular force microscopy for in vivo measurements of plant tissue mechanics. Plant Physiology. 158 (4), 1514-1522 (2012).
  6. Corson, F., et al. Turning a plant tissue into a living cell froth through isotropic growth. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 8453-8458 (2009).
  7. Hervieux, N., et al. A mechanical feedback restricts sepal growth and shape in Arabidopsis. Current Biology. 26, 1019-1028 (2016).
  8. Stanislas, T., Hamant, O., Traas, J. Chapter 11 - In-vivo analysis of morphogenesis in plants. Methods in Cell. Lecuit, T. 139, Academic Press. 203-223 (2017).
  9. Beauzamy, L., Derr, J., Boudaoud, A. Quantifying hydrostatic pressure in plant cells using indentation with an atomic force microscope. Biophysical Journal. 108 (10), 2448-2456 (2015).
  10. Costa, K. D., Sim, A. J., Yin, F. C. P. Non-Hertzian Approach to Analyzing Mechanical Properties of Endothelial Cells Probed by Atomic Force Microscopy. Journal of Biomechanical Engineering. 128 (2), 176-184 (2006).
  11. Beauzamy, L., Louveaux, M., Hamant, O., Boudaoud, A. Mechanically, the shoot apical meristem of Arabidopsis behaves like a shell inflated by a pressure of about 1MPa. Frontiers in Plant science. 6 (1038), 1-10 (2015).
  12. Majda, M., et al. Mechanochemical polarization of contiguous cell walls shapes plant pavement cells. Developmental Cell. 43 (3), 290-304 (2017).
  13. Torode, T. A., et al. Branched pectic galactan in phloem-sieve-element cell walls: implications for cell mechanics. Plant Physiology. 176, 1547-1558 (2018).
  14. Farahi, R. H., et al. Plasticity, elasticity, and adhesion energy of plant cell walls: nanometrology of lignin loss using atomic force microscopy. Scientific Reports. 7, 152(2017).
  15. Peaucelle, A., et al. Pectin-induced changes in cell wall mechanics underlie organ initiation in Arabidopsis. Current Biology. 21, 1720-1726 (2011).
  16. Cosgrove, D. J. Diffuse growth of plant cell walls. Plant Physiology. 176, 16-27 (2018).
  17. Sader, J. E., Larson, I., Mulvaney, P., White, L. R. Method for the calibration of atomic force microscope cantilevers. Review of Scientific Instruments. 66 (7), 3789-3798 (1995).
  18. Sader, J. E., Chon, J. W. M., Mulvaney, P. Calibration of rectangular atomic force microscope cantilevers. Review of Scientific Instruments. 70 (10), 3967-3969 (1999).
  19. Sikora, A. Quantitative Normal Force Measurements by Means of Atomic Force Microscopy Towards the Accurate and Easy Spring Constant Determination. Nanoscience and Nanometrology. 2 (1), 8-29 (2016).
  20. Schillers, H., et al. Standardized Nanomechanical Atomic Force Microscopy Procedure (SNAP) for Measuring Soft and Biological Samples. Scientific Reports. 7 (1), (2017).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة