Method Article

طريقه الربط المحسنة لايمونوبريسيبيتيشن (eCLIP) للتعرف الفعال علي الحمض الريبي المرتبط بالبروتين في خصيه الماوس

DOI:

10.3791/59681

⸱

May 10th, 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1State Key Laboratory of Reproductive Medicine, Nanjing Medical University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا ، نقدم بروتوكول eCLIP لتحديد أهداف الجيش الملكي النيبالي الرئيسية للمرشحين الملكي في الخصية.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

النطاف يحدد عمليه مرتبه للغاية من الذكور التمايز الخلايا الجرثومية في الثدييات. في الخصية ، والنسخ والترجمة غير مقترنة ، والتاكيد علي اهميه تنظيم ما بعد التحويل الجنسي للتعبير الجينات التي دبرها تقييديه. لتوضيح الأدوار الميكانيكية لل RBP ، يمكن استخدام منهجيه ايمونوبريسيبيتيشن (CLIP) للتقاط أهداف الجيش الملكي النيبالي المباشرة الذاتية وتحديد مواقع التفاعل الفعلية. المقطع المحسن (eCLIP) هو طريقه مطوره حديثا تقدم العديد من المزايا علي القصاصات التقليدية. ومع ذلك ، اقتصر استخدام eCLIP حتى الآن علي خطوط الخلايا ، داعيا إلى توسيع التطبيقات. هنا ، استخدمنا eCLIP لدراسة MOV10 و MOV10L1 ، اثنين من المعروفة الحمض الريبي النيبالي ملزمه الحلزونية ، في خصيه الماوس. كما هو متوقع ، ونحن نجد ان MOV10 في الغالب يربط إلى 3 ' المناطق غير المترجمة (UTRs) من mRNA و MOV10L1 يربط بشكل انتقائي إلى Piwi التفاعل الRNA (piRNA) السلائف المستنسخات. طريقه eCLIP الخاصة بنا تسمح بالتحديد السريع للأنواع الرئيسية من الحمض الريبي النيبالي المرتبطة بمختلف تقييديه عن طريق التسلسل الصغير للمستنسخين التالي توفر المكتبات المؤهلة ، كامر قضائي للمضي في التسلسل العميق. وتحدد هذه الدراسة أساسا قابلا للتطبيق للحصول علي eCLIP في خصيه الثدييات.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تمثل الخصية الثديية نموذجا تنمويا ممتازا حيث يعمل برنامج تمايز الخلايا المعقدة بشكل دوري لإنتاج العديد من النطاف. وتكمن القيمة الفريدة لهذا النموذج في ظهور التعطيل العابر للحدود في مراحل معينه من النطاف ، وعاده عندما يحدث التنشيط الكروموسوم الجنسي الذي يصيب الجنس الواحد (MSCI)1و2 وعند الخضوع لجولة نطفه الضغط النووي الشديد اثناء التسبب في النطاف3. وتستلزم هذه الاحداث العابرة المتعاقبة تنظيم الجينات بعد العجز ، الذي تلعب فيه البروتينات الملزمة بالحمض الريبي النيبالي (تقييديه) دورا حاسما ، وتشكل الناسخة وتحافظ علي خصوبة الذكور.

لتحديد أهداف الجيش الملكي النيبالي حسن النية من الفرد في الجسم الطبيعي ، ووضعت الطريقة ايمونوبريسيبيتيشن (كليب)4،5، استنادا إلى ولكن ابعد من الجيش الملكي النيبالي العادي ايمونوبريسيبيتيشن (RIP)6،7 ، من خلال ادراج الخطوات الرئيسية بما في ذلك الاشعه فوق البنفسجية (UV) الربط ، وغسل صارمة ونقل هلام لتحسين خصوصية الاشاره. وقد اثار التطبيق المتقدم لل CLIP مع التسلسل عاليه الانتاجيه اهتماما كبيرا في التنميط البروتين-RNA التفاعل في مستويات الجينوم علي نطاق واسع8. بالاضافه إلى الدراسات الوراثية علي وظيفة الملكية الخاصة ، وكانت هذه الأساليب البيوكيميائية التي تحدد التفاعل المباشر للبروتين الذاتية والحمض الريبي النيبالي لا غني عنها لتوضيح بدقه الأدوار التنظيمية RNA من تقييديه. علي سبيل المثال ، MOV10L1 هو الخصية الحمض الريبي النيبالية الخاصة المطلوبة للخصوبة الذكور والحمض الريبي المتفاعل (piRNA) بيوجينيسيس9. ومن المعروف MOV10 paralogue التي أعرب عنها بشكل مطلق ومتعددة الوظائف الحمض الريبي النيبالي الحلزوني مع الأدوار في جوانب متعددة من البيولوجيا rna10,11,12,13,14 , 15 , 16 , 17 , 18. من خلال توظيف التقليدية كليب-seq ، وجدنا ان MOV10L1 يربط وينظم الاوليه pirna السلائف للبدء في وقت مبكر pirna معالجه19،20، وان MOV10 يربط mrna 3 ' utrs وكذلك الحمض الريبي النيبالي غير الترميز الأنواع في الخلايا الجرثومية الخصية (البيانات لم تظهر).

ومع ذلك ، CLIP هو في الأصل اجراء شاقه ، المشعة تليها اعداد مكتبه التسلسل مع خسارة ملحوظة من العلامات كليب. في مقطع التقليدية ، يتم اعداد مكتبه cDNA باستخدام محولات ligated في كل من الأطراف RNA. بعد هضم البروتين ، تظل الجزيئات القصيرة المتداخلة المتداخلة مرتبطة بشظايا الحمض الريبي النيبالي. هذه العلامة المتقاطعة كتل جزئيا النسخ العكسي (rtase) التقدم خلال التوليف cdna ، مما ادي إلى اقتطاع cdna التي تمثل حوالي 80 ٪ من مكتبه cdna21،22. التالي ، يتم تسلسل أجزاء cDNA الناتجة عن RTase تجاوز موقع الارتباط التشعبي (القراءة). في الاونه الاخيره ، وقد استخدمت مختلف النهج كليب ، مثل PAR-كليب ، iclip ، eclip و uvclap ، لتحديد مواقع تشعبي من تقييديه في الخلايا الحية. PAR-كليب ينطوي علي تطبيق الاشعه فوق البنفسجية 365 nm والنظير النيوكليوتيد فوتواكتيكتابل التالي يقتصر علي الخلايا الحية في الذبح ، ودمج النظير النيونوسيد في المستنسخات التي تم توليفها حديثا عرضه لإنتاج التحيز حيث يتفاعل الجيش الريبي النيبالي جسديا مع البروتين23،24. في iCLIP ، يتم ربط محول واحد فقط إلى اقصي 3 ' من شظايا RNA المرتبطة. بعد النسخ العكسي (RT) ، يتم الحصول علي كل من المقتطعة والقراءة من خلال cdnas بواسطة إينتراموليكولارلي الدوران وأعاده الخطي تليها تفاعل البلمره سلسله (PCR) التضخيم25،26. ومع ذلك ، فان كفاءه الدوران داخل الجزيئات منخفضه نسبيا. علي الرغم من ان البروتوكولات القديمة كليب بحاجه إلى وضع العلامات من الحمض الريبي النيبالي مع النظائر المشعة ، الاشعه فوق البنفسجية والتقارب تنقيه (uvCLAP) ، مع عمليه تنقيه تقارب ترادفية صارمة ، لا تعتمد علي النشاط الإشعاعي27. ومع ذلك, uvCLAP يقتصر علي الخلايا المستزرعة التي يجب ان يتم نقلها مع ناقلات التعبير التي تحمل 3x العلم-HBH العلامة لتنقيه تقارب ترادفي.

في eCLIP ، كانت المحولات ligated الاولي في 3 ' اقصي من الجيش النيبالي الريبي تليها RT ، والمقبل في الطرف 3 ' من cDNAs في وضع بين الجزيئية. التالي ، eCLIP قادره علي التقاط جميع المقتطعة والقراءة من خلال cDNA28. كما انه لا يقتصر علي وضع العلامات المشعة ، ولا علي استخدام الخطوط الخلوية استنادا إلى مبداها ، مع الحفاظ علي قرار أحادي النوكليوتيد.

هنا ، ونحن نقدم وصفا خطوه بخطوه لبروتوكول eCLIP تكييفها لخصيه الماوس. لفتره وجيزة ، يبدا هذا البروتوكول eCLIP مع الاشعه فوق البنفسجية المتقاطعة من أنابيب الخصية ، تليها الهضم RNase الجزئي والايمونوبريسيبيتيشن باستخدام مضادات البروتين الخاصة. المقبل ، والحمض الريبي الذي يرتبط بالبروتين هو deفوسفوفورلات ، ومحول هو ligated إلى نهايته 3 '. بعد بروتين هلام الكهربائي والنقل من هلام إلى غشاء ، يتم عزل الحمض الريبي النيبالي عن طريق قطع منطقه الغشاء من نطاق الحجم المتوقع. بعد RT ، محول الحمض النووي هو ligated إلى نهاية 3 ' من cDNA تليها التضخيم PCR. ويتم فحص المستنسخات الفرعية قبل التسلسل العالي الانتاجيه كمراقبه لجوده المكتبة. هذا البروتوكول فعال في تحديد الأنواع الرئيسية من الحمض الريبي النيبالي المرتبط بالبروتين من تقييديه ، والتي تمثلها الخصيتين-التي تعبر عن الحمض الريبي النيبالي الحلزوني MOV10L1 و MOV10.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تمت الموافقة علي جميع التجارب الحيوانية التي أجريت من قبل لجنه جامعه نانجينغ الطبية. الذكور C57BL/6 وابقي الفئران تحت الظروف الضوئية الخاضعة للرقابة وزودت مع الطعام والماء.

1. حصاد الانسجه والاشعه فوق البنفسجية المتقاطعة

  1. موت ببطء 2 الكبار الفئران باستخدام ثاني أكسيد الكربون (CO2) لمده 1-2 دقيقه أو حتى توقف التنفس. بعد ذلك ، قم باجراء خلع عنق الرحم علي كل ماوس.
  2. حصاد حوالي 100 ملغ من الخصيتين من الفئران من العمر المناسب (خصيه واحده الكبار في هذه الدراسة) لكل تجربه ايمونوبريسيبيتيشن ، ووضع الانسجه في الجليد الباردة الفوسفات مخزنه المالحة (تلفزيوني).
  3. قم بازاله البوغينيا التونيكا برفق مع زوج واحد من ملاقط رفيعه الرؤوس.
  4. أضافه 3 مل من الجليد الباردة في طاحونة الانسجه والانسجه النسيجية بواسطة قوه ميكانيكيه خفيفه باستخدام الزجاج فضفاضة مدقه (نوع A مدقه الزجاج).
    ملاحظه: والغرض من هذه الخطوة ليس لخلايا lyse ، ولكن لسحب الانسجه بصرف الخلاف. ومن المهم الحفاظ علي صلاحيه الخلية وسلامتها.
  5. نقل تعليق الانسجه إلى طبق ثقافة الخلية (10 سم في القطر) وأضافه الجليد الباردة لمده تصل إلى 6 مل.
  6. يهز لوحه بسرعة بحيث يغطي السائل الجزء السفلي من الطبق بالتساوي. إذا كان النسيج هو الأرض بشكل صحيح ، وتوزيعها بالتساوي الأنابيب المنوية ستكون مرئية ، في حين ان وجود كتل الانسجه يشير إلى ان تشتت الانسجه هو دون الأمثل.
  7. Crosslink تعليق ثلاث مرات مع 400 مللي جول/سم2 في 254 nm علي الجليد. مزيج التعليق بين كل التشعيع.
    ملاحظه: لكل تجربه جديده ، يجب تحسين الربط المتقاطع.
  8. جمع تعليق في أنبوب مخروطي 15 مل وبيليه في 1,200 x g ل 5 دقيقه في 4 °c. أزاله supernatant ، أعاده تعليق بيليه في 1 مل من تلفزيوني ومن ثم نقل التعليق إلى أنبوب الطرد المركزي 1.5 mL. تدور في 4 °C و 1,000 x g لمده 2 دقيقه ، وأزاله supernatant.
  9. عند هذه النقطة ، والمضي قدما علي الفور مع بقية البروتوكول ، أو المفاجئة تجميد الكريات في النيتروجين السائل وتخزين في-80 درجه مئوية حتى الاستخدام.

2. اعداد الخرز

  1. أضافه 125 μL من البروتين الخرز المغناطيسي لكل عينه (بيليه) إلى أنبوب الطرد المركزي الطازج.
    ملاحظه: استخدام البروتين ز الخرز المغناطيسي للأجسام المضادة الماوس.
  2. وضع أنبوب علي المغناطيس لفصل الخرز من الحل. بعد 10 ليالي ، وأزاله supernatant. غسل الخرز مرتين مع 1 مل من الجليد الباردة تحلل العازلة.
    ملاحظه: الانفصال اللاحق للبروتين الخرز المغناطيسي يتبع هذه الخطوة. تحلل تركيب العازلة هو 50 mM تريس-HCl ، pH 7.5 ؛ 100 mM NaCl; 1 ٪ NP-40 ؛ 0.1 ٪ SDS ؛ 0.5 ٪ ديكسيتشوليت الصوديوم. 1/50 حمض ايثيلليندياميتاتاتاستيك (أدتا)-خاليه من الانزيم البروتيني المثبط كوكتيل (أضافه الطازجة).
  3. أعاده تعليق الخرز في 100 μL من العازلة تحلل الباردة مع 10 ميكروغرام eCLIP الأجسام المضادة. تدوير أنابيب في درجه حرارة الغرفة لمده 45 دقيقه.
    ملاحظه: تركيز الأجسام المضادة النهائي لايمونوبريسيبيتيشن هو 10 ميكروغرام/مل. إذا كان تركيز الأجسام المضادة غير معروف ، يجب تحسين كميه الأجسام المضادة.
  4. غسل الخرز مرتين مع 1 مل من الجليد الباردة تحلل العازلة.

3. تحلل الانسجه والهضم الجزئي RNA

  1. أعاده التعليق الكريات الانسجه في 1 مل من التحلل الباردة العازلة (أضافه 22 μL من 50x (أدتا)-خاليه من البروتين المثبط كوكتيل و 11 μL من مثبط RNase إلى 1 مل من تحلل العازلة).
    1. أعاده التعليق اثنين من الكريات العابرة للاشعه فوق البنفسجية واثنين من الكريات غير المتقاطعة لكل مجموعه من التجارب: الاشعه فوق البنفسجية-المتقاطعة-1 الكريات لمكتبه eCLIP (الاشعه فوق البنفسجية-1) ؛ الاشعه فوق البنفسجية المتقاطعة-2 الكريات لمكتبه eCLIP (الاشعه فوق البنفسجية-2) ؛ غير متقاطع-1 الكريات لمكتبه eCLIP كعنصر تحكم (غير الاشعه فوق البنفسجية) ؛ غير متقاطع-2 الكريات ل مفتش الملكية الفكرية لإثبات خصوصية الأجسام المضادة.
      ملاحظه: السيطرة المثالية للمكتبة eCLIP من الخصيتين الاشعه فوق البنفسجية المتقاطعة واسعه النوع هو ان من الخصيتين الاشعه فوق البنفسجية المتقاطعة الضربة القاضية من الفئران من نفس القمامة.
  2. الحفاظ علي ليسينج العينات علي الجليد لمده 15 دقيقه (لمنع تدهور البروتين والحمض الريبي النيبالي).
  3. سوكاتي في sonicator الرقمية في السعه 10 ٪ لمده 5 دقائق ، في 30 ق علي/30 ق قباله. وضع دائما العينة علي الجليد وتنظيف المسبار مع المياه الخالية من النيوداز بين كل عينه.
  4. أضافه 4 μL من DNase إلى كل أنبوب ، وتخلط جيدا. احتضان لمده 10 دقيقه في 37 درجه مئوية ، وتهتز في 1,200 دوره في الدقيقة.
  5. أضافه 10 μL من RNase المخفف I (4 U/μL RNase انا في تلفزيوني) ، وتخلط جيدا. احتضان لمده 5 دقائق في 37 درجه مئوية ، وتهتز في 1,200 دوره في الدقيقة.
  6. مسح محلله بواسطة طرد في 15,000 x g لمده 20 دقيقه (في 4 درجه مئوية).
  7. جمع بعناية supernatant. ترك 50 μl من محلله وتجاهل بيليه معها.
  8. حفظ عينات المدخلات كما Rwb (تشغيل للطخه الغربية) و rri (الترشح للعزل RNA). وفر 20 μL (2%) من الاشعه فوق البنفسجية-1 ، الاشعه فوق البنفسجية-2 ، غير الاشعه فوق البنفسجية وعينات مفتش كمدخلات ل RWB هلام التحميل. وفر 20 μL (2%) من الاشعه فوق البنفسجية-1 أو الاشعه فوق البنفسجية-2 عينات كمدخلات ل RRI هلام التحميل.

4. ايمونوبريسيبيتيشن

  1. أضافه 1 مل من محلله (من الخطوة 3.7) إلى الخرز (أعدت في القسم 2) وتدوير العينات في 4 درجه مئوية لمده 2 ساعة أو بين عشيه وضحيها.
  2. جمع الخرز مع موقف المغناطيسي وتجاهل supernatant. غسل الخرز مرتين مع 900 μL من ارتفاع الملح العازلة (50 mM تريس-HCl ، pH 7.5 ؛ 1 م NaCl ؛ 1 مم أدتا ؛ 1 ٪ NP-40 ؛ 0.1 ٪ SDS ؛ 0.5 ٪ ديكسيتشوليت الصوديوم) ، ثم يغسل الخرز مرتين مع 900 μL من غسل العازلة (20 ملم تريس-HCl ، pH 7.5 ؛ 10 مم MgCl2؛ 0.2 ٪ توين-20).
    ملاحظه: لعينه مفتش ، وقفه الاجراء هنا وتخزينها علي الجليد في المخزن المؤقت للغسيل.
  3. غسل الخرز مره واحده مع 500 μl من 1x العازلة الفسفات (10 ملم تريس-HCl ، pH 7.5 ؛ 5 مم mgcl2؛ 100 mm kcl ؛ 0.02 ٪ تريتون X-100).

5. ديفوسفورويليشن من RNA 3 ' ينتهي

  1. جمع الخرز مع موقف المغناطيسي وتجاهل supernatant. أزاله السائل المتبقية باستخدام نصائح ماصه غرامه. أضافه 100 μL من المزيج الرئيسي ديفوسفورويليشن (10 μL من 10x العازلة ديفوسفوريلاتيون [100 mM تريس-HCl ، pH 8.0 ؛ 50 mM MgCl2؛ 1 م kcl ؛ 0.2 ٪ تريتون X-100 ؛ 1 مغ/مل الزلال المصل البقري (بوسنيا)] ؛ 78 μl من المياه الخالية من النيوداز ؛ 2 Μl من مثبط RNase; 2 Μl من dnase; 8 μl من تحتوي الفوسفاتيز) لكل عينه ، واحتضان لمده 15 دقيقه في 37 درجه مئوية ، وتهتز في 1,200 دوره في الدقيقة.
  2. أضافه 300 μL من بولينوكليوتيد كيناز (PNK) المزيج الرئيسي (60 μL من 5x PNK pH 6.5 العازلة [350 mM تريس-HCl ، pH 6.5 ؛ 50 مم MgCl2] ؛ 223 μl من المياه الخالية من النيوداز ؛ 5 Μl rnase مثبط ؛ 2 Μl dnase; 7 μl من انزيم pnk; 3 μl من 0.1 M dithiothreitol) إلى كل عينه ، احتضان لمده 20 دقيقه في 37 درجه مئوية ، وتهتز في 1,200 دوره في الدقيقة.
  3. جمع الخرز مع موقف المغناطيسي وتجاهل supernatant. غسل الخرز مره واحده مع 500 μL من الباردة غسل العازلة. ثم غسل الخرز مره واحده مع 500 μL من الباردة الملح العازلة العالية. كرر هذه يغسل مره أخرى في هذا الترتيب.
  4. غسل الخرز مره واحده مع 500 μL من غسل الباردة العازلة ومن ثم مرتين مع 300 μL من الباردة 1x ربط العازلة (لا dithiothreitol ، 50 mM تريس-HCl ، pH 7.5 ؛ 10 مم MgCl2).

6. الجيش النيبالي الريبي محول ربط إلى RNA 3 ' ينتهي

  1. تخلص من السائل الفائق ، وقم بازاله السوائل المتبقية باستخدام نصائح ماصه ناعمه. أضف 25 μL من 3 ' مزيج الربط الرئيسي لكل عينه. اخلط بعناية عن طريق التنضيد. هذه الخطوة هي عرضه لإنتاج فقاعات.
    ملاحظه: الربط الرئيسي مزيج يحتوي علي 3 μL من 10x العازلة ربط [500 mM تريس-HCl ، pH 7.5 ؛ 100 mM MgCl2] ؛ 9 μL من المياه الخالية من النيوداز. 0.4 μL من مثبطات RNase; 0.3 μL من 0.1 M ATP; 0.8 ميكرولتر من ثنائي ميثيل سولفوكسيد (DMSO) ؛ 9 μL من 50 ٪ البولي إيثيلين غليكول (PEG) 8000 ؛ 2.5 μl من الحمض الريبي النيبالي يغاز [30 U/μl].
  2. أضافه 2.5 μL من الحمض الريبي النيبالي محول X1A (الجدول 1) و 2.5 μl من محول rna X1B (الجدول 1) لكل عينه. تخلط بعناية عن طريق التنضيد أو الوخز ، واحتضان ل 75 دقيقه في 25 درجه مئوية ، والوخز لخلط كل 10 دقيقه.
  3. غسل الخرز مره واحده مع 500 μL من الباردة غسل العازلة (استئناف عينه مفتش هنا).
  4. غسل الخرز مره واحده مع 500 μL من البرد الباردة الملح العازلة ومن ثم مع 500 μL الباردة غسل العازلة. كرر هذه يغسل مره أخرى.
  5. حبات منفصلة مغناطيسيا ، وأزاله السائل المتبقي مع نصائح ماصه غرامه.
  6. أعاده تعليق الخرز في 100 μL من الباردة غسل العازلة (وقفه عينه مفتش هنا وتخزينها علي الجليد في المخزن المؤقت للغسيل). نقل 20 μL إلى أنابيب جديده كعينات RWB. افصل مغناطيسيا المتبقية 80 μL كعينات RRI. أزاله العينات rri ' ماده طافي وأعاده تعليق الخرز في 20 μl من غسل العازلة.
  7. أضافه 37.5 μL من 4x الليثيوم دوديسيل كبريتات (LDS) عينه العازلة و 15 μL من 10x عينه الحد من وكيل لعينه مفتش. أضافه 7.5 μL من 4x LDS عينه العازلة و 3 μL من 10x عينه الحد من وكيل إلى (المتبقية) العينات. (لا تخلط بواسطة الأنابيب). احتضان لمده 10 دقيقه في 70 درجه مئوية ، وتهتز في 1,200 دوره في الدقيقة. بارد علي الجليد لمده 1 دقيقه ، وأجهزه الطرد المركزي في 1,000 x g لمده 1 دقيقه في 4 درجه مئوية.

7. SDS--صفحه وغشاء نقل

  1. حمل الهلام.
    1. لهلام RRI (4-12 ٪ مكررا-تريس هلام البروتين ، 10-حسنا ، 1.5 مم) وضع أنابيب علي المغناطيس والبروتين منفصلة التملص من الخرز. تحميل 30 μL من عينه في بئر. ومتباعدة عينات من قبل الملونة علامة حجم البروتين.
    2. لهلام RWB (4-12 ٪ مكررا-تريس هلام البروتين ، 10-حسنا ، 1.5 مم) وضع أنابيب علي المغناطيس والبروتين منفصلة التملص من الخرز. تحميل 15 μL من عينه في بئر. حفظ العينات المتبقية في-20 درجه مئوية كنسخ احتياطيه.
  2. أضافه 500 μL من مضادات الاكسده إلى 500 مل من 1x SDS تشغيل العازلة. تشغيل في 200 V في 1x SDS تشغيل العازلة لمده 50 دقيقه أو حتى الجبهة صبغ في الجزء السفلي.
    ملاحظه: مضادات الاكسده تحتوي علي N, N-ديميثيلفورماميد, بيسولفيت الصوديوم, الذي يهاجر مع انخفاض البروتينات لمنع أعاده أكسده الأحماض الامينيه الحساسة مثل ميثيونين و التربتوفان.
  3. نقل البروتين-الحمض الريبي المجمعات من هلام إلى غشاء النيتروسليلوز في 10 فولت ل 70 دقيقه في 1xtransfer العازلة مع 10 ٪ الميثانول (المجلد/المجلد). شطف غشاء RRI في تلفزيونيه الباردة ، والتفاف عليه في التفاف من البلاستيك ، وتخزين في-80 درجه مئوية.
  4. منع غشاء RWB في 5 ٪ الحليب في TBST في درجه حرارة الغرفة ل 1 ح. شطف الغشاء في TBST. احتضان مع الأجسام المضادة الاوليه في TBST في 4 °C بين عشيه وضحيها. يغسل مرتين مع TBST لمده 5 دقائق. احتضان مع الأجسام المضادة الثانوية (1:5000 الماعز المضادة للارص لمكافحه الأرانب) في TBST في درجه حرارة الغرفة ل 1 ح. يغسل ثلاث مرات مع TBST لمده 5 دقائق ، 10 دقيقه و 15 دقيقه ، علي التوالي.
  5. خلط كميات متساوية من الكهرباء الكهربائية (ECL) العازلة والعازلة B ، أضافه إلى غشاء واحتضان لمده 1 دقيقه. تغطيه الغشاء مع التفاف من البلاستيك ، وتعريضه لفيلم الاشعه السينية في درجه حرارة الغرفة ل 2-3 min. ثم تطوير الفيلم.
    ملاحظه: الفيلم مع التعرض المفرط سوف تظهر بوضوح شكل حواف الغشاء ، والتي يمكن محاذاة الفيلم مره أخرى إلى غشاء RWB. ثم ، محاذاة الاغشيه RWB و RRI استنادا إلى مواضع علامات فيها. الطبقات في النظام من أسفل إلى اعلي هي الفيلم ، وغشاء RWB وغشاء RRI في تسلسل.

8. الحمض الريبي المعزول

  1. قطع المنطقة من الفرقة البروتين إلى 75 كده (حوالي 220 nt من RNA) فوقه ، وذلك باستخدام غشاء RWB والفيلم كادله.
    ملاحظه: كما جزيء الحمض الريبي النيبالي المحمية بالبروتين قد يكون الحد الأقصى لطول 225 قواعد ، مع حوالي 340 دا لكل قاعده ، فانه من المعقول لخفض المنطقة حول 75 دهت فوق الفرقة RBP لاسترداد جميع المجمعات البروتين-RNA.
  2. قطع قطعه من غشاء المثيرة إلى عده شرائح صغيره ، ووضعها في أنبوب الطرد المركزي 1.5 mL الطازجة. أضافه 200 μL من بروتينيه K (PK) العازلة (100 mM تريس-HCl pH 7.5; 50 mM كلوريد الصوديوم; 10 مم أدتا) مع 40 μL من PK إلى قطع الغشاء. مزيج واحتضان لمده 20 دقيقه في 37 درجه مئوية ، وتهتز في 1,200 دوره في الدقيقة.
  3. أضافه 200 μL من PK اليوريا العازلة (100 mM تريس-HCl pH 7.4; 50 mM كلوريد الصوديوم; 10 مم أدتا; 7 M اليوريا) لكل عينه. احتضان لمده 20 دقيقه في 37 درجه مئوية ، وتهتز في 1,200 دوره في الدقيقة.
  4. أضافه 400 μL من حمض الفينول/كلوروفورم/ايزوميل الكحول (25:24:1) ، وتخلط جيدا واحتضان لمده 5 دقائق في 37 درجه مئوية ، وتهتز في 1,200 دوره في الدقيقة.
  5. وضع 2 مل المرحلة هلام القفل (PLG) أنبوب الثقيلة في جهاز الطرد المركزي وتدور في 15,000 x g ل 25 s.
  6. انقل جميع المحتويات باستثناء الشرائح الغشائية إلى الأنبوب الثقيل PLG. احتضان لمده 5 دقائق في 37 درجه مئوية ، وتهتز في 1,200 دوره في الدقيقة.
  7. تدور في درجه حرارة الغرفة و 15,000 x g لمده 15 دقيقه نقل الطبقة المائية إلى أنبوب مخروطي جديد 15 مل.
  8. استخدام الحمض الريبي النيبالي تنقيه وتركيز الاعمده لاستخراج RNA.
    1. أضافه وحدات تخزين 2 (800 μL) من المخزن المؤقت لربط الحمض الريبي النيبالي لكل عينه (من الخطوة 8.7) ومزيج. أضافه حجم متساو (1200 μL) من 100 ٪ الايثانول ومزيج.
    2. نقل 750 μL من العينة (من الخطوة 8.8.1) لتنقيه الحمض الريبي النيبالي والاعمده التركيز في أنبوب جمع والطرد المركزي في 15,000 x g ل 30 s. تجاهل تدفق من خلال.
    3. كرر الخطوة 8.8.2 حتى يتم تمرير كافة العينات خلال العمود. أضافه 400 μL من الجيش النيبالي المؤقت الاعداديه العازلة إلى العمود وأجهزه الطرد المركزي في 15,000 x g ل 30 s. تجاهل تدفق من خلال ، تطبيق 700 μl من الحمض الريبي النيبالي غسل العازلة والطرد المركزي العمود في 15,000 x g ل 30 s. تجاهل تدفق من خلال.
    4. أضافه 400 μL من الحمض الريبي النيبالي غسل العازلة إلى العمود والطرد المركزي في 15,000 x g لمده 2 دقيقه نقل العمود بعناية إلى أنبوب 1.5 mL جديده. أضافه 10 μL من المياه الخالية من النيوداز إلى مصفوفة العمود ، واسمحوا الجلوس لمده 2 دقيقه ، وأجهزه الطرد المركزي في 15,000 x g ل 30 s. تخزين عينات eclip في-80 درجه مئوية حتى RT (الخطوة 11.1).

9. ديفوسفوريلاتيون الإدخال RNA 3 ' ينتهي

  1. أضافه 15 μL من المزيج الرئيسي ديفوسفورويليشن (2.5 μL من 10x العازلة ديفوسفوريلاتيون [100 mM تريس-HCl ، pH 8.0 ؛ 50 mM MgCl2؛ 1 م kcl ؛ 0.2 ٪ تريتون X-100 ؛ 1 مغ/مل بوسنيا] ؛ 9.5 μl من المياه الخالية من النيوداز ؛ 0.5 μl من مثبط RNase ؛ 2.5 μl من الفوسفاتيز القلوية) إلى 10 μl من عينات الإدخال (من الخطوة 8.8.4). احتضان لمده 15 دقيقه في 37 درجه مئوية ، وتهتز في 1,200 دوره في الدقيقة.
  2. أضافه 75 μL من PNK ماستر ميكس (20 μL من 5x PNK PH 6.5 العازلة [350 mM تريس-HCl ، pH 6.5 ؛ 50 مم MgCl2] ؛ 44 μl من المياه الخالية من النيوداز ؛ 1 μl من مثبط rnase ؛ 2 Μl من dnase ؛ 7 μl من انزيم pnk ؛ 1 μl من 0.1 M dithiothreitol) إلى عينات. احتضان لمده 20 دقيقه في 37 درجه مئوية ، وتهتز في 1,200 دوره في الدقيقة.
  3. تنظيف الإدخال RNA
    1. أعاده التعليق الأحماض الخلوية استخراج الخرز المغناطيسي القارورة (دوامه لأكثر من 30 ق). أضافه 20 μL من الأحماض النووية استخراج الخرز المغناطيسي لكل عينه إلى أنابيب جديده. جمع الخرز مع موقف المغناطيسي وتجاهل supernatant.
    2. غسل الخرز مره واحده مع 1 مل من الحمض الريبي التحلل تنقيه العازلة (RLT العازلة). وضع أنبوب علي المغناطيس ل 30 ثانيه وتجاهل supernatant.
      ملاحظه: الفصل اللاحق من الأحماض النووية استخراج الخرز المغناطيسي اتبعت هذه الخطوة.
    3. أعاده تعليق الخرز مع 300 μL من المخزن المؤقت RLT وأضافه إلى العينة. أضافه 10 μL من 5 م كلوريد الصوديوم و 615 μL من الكحول ايثيل 100 ٪ (EtOH) وتخلط بواسطة الأنابيب. تدوير في درجه حرارة الغرفة لمده 15 دقيقه. فصل مغناطيسيا الخرز وأزاله supernatant.
    4. أعاده التعليق الخرز في 1 مل من 75 ٪ EtOH ونقل إلى أنبوب جديد. بعد 30 ثانيه ، وجمع الخرز مع موقف المغناطيسي وتجاهل supernatant. يغسل مرتين مع 75 ٪ EtOH ، وفصل مغناطيسيا الخرز ، وتجاهل السائل المتبقية مع نصائح ماصه غرامه. الهواء الجاف لمده 5 دقائق (تجنب الإفراط في التجفيف).
    5. أعاده تعليق الخرز مع 10 μl من المياه الخالية من النيوداز واحتضانه لمده 5 دقائق. حبات منفصلة مغناطيسيا ، والتحرك 5 μl من ماده طافي إلى أنبوب جديد (لربط محول 3 ' أدناه). ال [رنا] متبقي يستطيع كنت خزنت في-80 [ك] كنسخ احتياطيه.

10. [رنا] محول ربط إلى مدخل [رنا] 3 ' نهايات

  1. أضافه 1.5 μL من DMSO و 0.5 μL من محول RiL19 (الجدول 1) إلى 5 μl من الإدخال RNA (من الخطوة 9.3.5) ، احتضان لمده 2 دقيقه في 65 درجه مئوية ، ومكان علي الجليد لأكثر من 1 دقيقه. أضافه 13.5 μl من 3 ' مزيج الربط الرئيسي لكل عينه ، وتخلط من خلال التنضيد ، واحتضان ل 75 دقيقه في 25 درجه مئوية ، مع الوخز لخلط كل 15 دقيقه.
    ملاحظه: الربط الرئيسي مزيج يحتوي علي 2 μL من 10x العازلة ربط [500 mM تريس-HCl ، pH 7.5 ؛ 100 mM MgCl2؛ 10 ملم dithiothreitol] ؛ 1.5 μL من المياه الخالية من النيوداز. 0.2 μL من مثبطات RNase; 0.2 μL من 0.1 M ATP; 0.3 μL من DMSO ؛ 8 μL من 50 ٪ PEG8000 ؛ 1.3 μl من الحمض الريبي النيبالي يغاز [30 U/μl].
  2. تنظيف الإدخال الذي تم ربطه بالحمض الريبي
    1. منفصل مغناطيسيا 20 μL من الأحماض النووية استخراج الخرز المغناطيسي لكل عينه ، وأزاله supernatant. غسل الخرز مره واحده مع 1 مل من العازلة RLT.
    2. أعاده تعليق الخرز في 61.6 μL من المخزن المؤقت RLT ونقل تعليق لكل عينه. أضافه 61.6 μL من 100% EtOH. استخدام ماصه لخلط لمده 15 دقيقه كل 5 دقيقه. حبات منفصلة مغناطيسيا ، وأزاله سوبرناتانت.
    3. كرر الخطوة 9.3.4.
    4. أعاده التعليق الخرز مع 10 μl من المياه الخالية من النيوداز ، والسماح لها الجلوس لمده 5 دقائق. افصل مغناطيسيا الخرز ونقل 10 μl من ماده طافي إلى أنبوب جديد.
      ملاحظه: هذه نقطه توقف محتمله (يمكن تخزين عينات الإدخال في-80 درجه مئوية حتى اليوم التالي).

11. عكس النسخ ، محول الحمض النووي ربط إلى cDNA 3 ' ينتهي

  1. أضافه 0.5 μL من RT التمهيدي (الجدول 1) إلى 10 μl من إدخال الحمض الريبي النيبالي (من الخطوة 10.2.4) و 10 ΜL من CLIP rna (من الخطوة 8.8.4) علي التوالي ، احتضان لمده 2 دقيقه في كتله PCR قبل تسخينها في 65 درجه مئوية ، مكان علي الجليد لأكثر من 1 دقيقه.
  2. أضافه 10 μL من المزيج الرئيسي RT (2 μL من المخزن المؤقت RT [500 mM تريس-HCl ، pH 8.3 ؛ 750 mM KCl ؛ 30 مم MgCl2] ؛ 4 μl من المياه الخالية من النيوداز ؛ 0.3 Μl من مثبط RNase ؛ 2 μl من 0.1 m dithiothreitol; 0.2 μl من 0.1 m datp; 0.2 μl من 0.1 m dctp; 0.2 μl من 0.1 M dGTP; 0.2 μL من 0.1 M dTTP; 0.9 μL من النسخ العكسي) لكل عينه ، مزيج ، احتضان في 55 درجه مئوية ل 45 دقيقه علي كتله PCR قبل تسخينها.
  3. مزيج 20 μL من المنتج رد فعل RT مع 3.5 μL من المنتج PCR تنظيف الكاشف. احتضان لمده 15 دقيقه في 37 درجه مئوية.
  4. أضافه 1 μL من 0.5 M أدتا ، مزيج من خلال التنضيد. أضافه 3 μL من 1 م NaOH ، مزيج من خلال التنضيد ، واحتضان لمده 12 دقيقه في 70 درجه مئوية علي كتله PCR لحلف الحمض الريبي النيبالي القالب.
  5. أضافه 3 μL من 1 M HCl ، ماصه مزيج لتحييد العازلة.
  6. تنظيف cDNA
    1. منفصلة مغناطيسيا 10 μL من الأحماض النووية استخراج الخرز المغناطيسي لكل عينه ، وأزاله supernatant. يغسل مره واحده مع 500 μL من المخزن المؤقت RLT.
    2. أعاده تعليق الخرز في 93 μL من المخزن المؤقت RLT ونقل التعليق إلى العينة. أضافه 111.6 μL من 100 ٪ EtOH ، احتضانه لمده 5 دقائق ، ومزيج ماصه كل 2 دقيقه. جمع الخرز مع موقف المغناطيسي وتجاهل supernatant. أعاده التعليق الخرز مع 1 مل من 80 ٪ EtOH والانتقال إلى أنبوب جديد.
    3. بعد 30 ثانيه ، وجمع الخرز مع موقف المغناطيسي وتجاهل supernatant. يغسل مرتين مع 80 ٪ EtOH. منفصلة مغناطيسيا وتجاهل السائل المتبقية مع غيض غرامه. الهواء الجاف لمده 5 دقائق (تجنب الإفراط في التجفيف). أعاده تعليق الخرز في 5 μL من 5 مم تريس-HCl واحتضانه لمده 5 دقائق.
  7. أضافه 0.8 μL من محول الحمض النووي (الجدول 1) و 1 ΜL من dmso إلى الخرز ، احتضان لمده 2 دقيقه في 75 درجه مئوية. مكان علي الجليد لأكثر من 1 دقيقه.
  8. اعداد 12.8 μl من الربط الرئيسي مزيج (2 μl من 10x العازلة ربط [500 mM تريس-HCl; 100 mm mgcl2؛ 10 ملم ديثيوثريتول] ؛ 1.1 μl من المياه الخالية من النيوداز ؛ 0.2 μl من 0.1 M ATP ؛ 9 μl من 50 ٪ PEG8000 ؛ 0.5 μl من الحمض الريبي النيبالي يغاز [30 U/μl]) ، نفض الغبار لخلط ، تدور لفتره وجيزة في جهاز الطرد المركزي ، وأضافه إلى كل عينه ، ويحرك عينه مع غيض ماصه ببطء.
  9. أضافه 1 μl أخرى من الحمض الريبي النيبالي يغاز [30 U/μl] لكل عينه ونفض الغبار لخلط. احتضان لمده 30 ق عند 25 درجه مئوية ، وتهتز في 1,200 لفه في الدقيقة. احتضان عند 25 درجه مئوية بين عشيه وضحيها. نفض الغبار لخلط طفيفه 5 إلى 6 مرات ، مره واحده في الساعة.
  10. تنظيف cDNA
    1. منفصلة مغناطيسيا 5 μL من الأحماض النووية استخراج الخرز المغناطيسي لكل عينه ، وأزاله supernatant.
    2. يغسل مره واحده مع 500 μL RLT العازلة.
    3. أعاده تعليق الخرز في 60 μL من المخزن المؤقت RLT إلى الخرز ونقل التعليق إلى كل عينه. أضافه 60 μL من 100 ٪ EtOH ، احتضانه لمده 5 دقائق ومزيج ماصه كل 2 دقيقه. منفصلة مغناطيسيا ، وتجاهل supernatant.
    4. كرر الخطوة 9.3.4.
    5. أعاده التعليق الخرز مع 27 μL من 10 ملم تريس-HCl ، احتضانه لمده 5 دقائق. منفصلة مغناطيسيا ، ونقل 25 μL من عينه إلى أنبوب جديد. تمييع 1 μL من cDNA ligated مع 9 μL من المياه الخالية من النيوداز في أنبوب جديد. تخزين العينات المتبقية في-20 درجه مئوية حتى الخطوة 13.1.

12. القياس الكمي لل cDNA بواسطة PCR الكمية في الوقت الحقيقي (qPCR)

  1. أضافه 9 μL من المزيج الرئيسي qPCR (5 μL من 2x ماستر ميكس; 3.6 μL من المياه الخالية من النيوداز; 0.4 μL من مزيج التمهيدي [10 μM PCR-F-D50X و 10 μM PCR-R-D70X]) إلى لوحه qPCR 96 جيدا. أضافه 1 μL من 1:10 المخفف (في ح2س) cdna (من الخطوة 11.10.5) ، وختم ومزيج.
  2. تشغيل برنامج qPCR في ثيرموسيكلير: 2 دقيقه في 50 درجه مئوية; 2 دقيقه عند 95 درجه مئوية ؛ 3 ق في 95 درجه مئوية تليها 30 ق في 68 درجه مئوية لدورات 40 ؛ 15 ق في 95 درجه مئوية تليها 60 s في 68 درجه مئوية تليها 15 ق في 95 درجه مئوية لمده 1 دوره. ملاحظه Ct (عتبه الدورة) القيمة.

13. التضخيم PCR من cDNA

  1. الاستغناء 35 μL من المزيج الرئيسي PCR (25 μL من 2x PCR الرئيسية ميكس; 5 μL من المياه الخالية من النيوداز; 5 μL من مزيج التمهيدي [20 μM PCR-F-D50X و 20 μM PCR-R-D70X]) في 8-بئر شرائط. لمجموعه CLIP ، أضافه 12.5 μL من قصاصه عينه + 2.5 μL من H2O; لمجموعه المدخلات ، أضافه 10 μL من المدخلات + 5 μL من H2س. تخلط جيدا وتدور لفتره وجيزة في أجهزه الطرد المركزي.
  2. تشغيل برنامج PCR: 30 ق في 98 درجه مئوية ؛ 15 ق في 98 درجه مئوية تليها 30 ق في 68 درجه مئوية تليها 40 s في 72 درجه مئوية لمده 6 دورات; 15 ق في 98 درجه مئوية تليها 60 s في 72 درجه مئوية لدورات ن = (qPCR Ct القيم-3)-6 ؛ 60 s في 72 درجه مئوية ؛ 4 درجه مئوية عقد.
    ملاحظه: فمن الأفضل لأداء 1 إلى 2 دورات PCR اضافيه للزوجين الأول من لقطات.

14. هلام تنقيه

  1. تحميل عينات علي 3% عاليه الدقة اجنشا هلام. ترك 1 فارغه جيدا بين العينات ، واستخدام سلم علي كلا الجانبين من هلام. تشغيل في 100 V ل 75 min في 1x تريس-Borate-أدتا (TBE) العازلة.
  2. تحت أضاءه الضوء الأزرق ، قطع هلام شرائح 175-350 bp باستخدام شفرات الحلاقة الطازجة لكل عينه. ضعها في 15 مل من الأنابيب المخروطية.
    1. تزن شريحة هلام ، و الوت هلام باستخدام مجموعه استخراج هلام.
    2. أضافه وحدات تخزين 6x هلام تذويب العازلة لأذابه هلام (100 ملغ هلام = 600 μL من هلام حل العازلة). تذوب الهلام في درجه حرارة الغرفة. (يهز لخلط كل 15 دقيقه حتى يتم حل شريحة هلام تماما). أضافه 1 حجم هلام من 100 ٪ ايزوبروبانول وتخلط جيدا.
    3. نقل 750 μL من العينة (من الخطوة 14.2.2) إلى العمود في أنبوب جمع والطرد المركزي في 17,900 x g لمده 1 دقيقه. تجاهل التدفق من خلال.
    4. كرر الخطوة 14.2.3 حتى جميع العينات قد مرت من خلال العمود ، وغسل مره واحده مع 500 μL من هلام حل العازلة.
    5. أضافه 750 μL من غسل العازلة (من هلام استخراج عده) إلى العمود والطرد المركزي في 17,900 x g ل 1 دقيقه. تجاهل تدفق من خلال ، تدور في 17,900 x g لمده 2 دقيقه. وضع العمود إلى أنبوب 1.5 mL جديده.
    6. أزاله جميع المتبقية غسل العازلة من حافه الأرجواني البلاستيك من العمود. الهواء الجاف لمده 2 دقيقه أضافه 12.5 μL من المياه الخالية من النيوداز إلى مركز الغشاء. السماح للعمود الوقوف لمده 2 دقيقه في درجه حرارة الغرفة ، وتدور في 17,900 x g لمده 1 دقيقه (للحصول علي إنتاجيه محسنه ، كرر الخطوة التملص).

15. TOPO استنساخ المنتج PCR

  1. اعداد مزيج رد فعل الاستنساخ TOPO (1 μL من المنتج PCR من الخطوة 14.2.6 ؛ 1 μL من مزيج الاستنساخ ؛ 3 μL من المياه المعقمة). اخلطه برفق وحضنه لمده 5 دقائق عند 20-37 درجه مئوية. بارد علي الجليد.
  2. ذوبان البكتيريا المختصة كيميائيا e. القولونية علي الجليد. أضافه 5 μL من المنتج الاستنساخ TOPO إلى 100 μL من البكتيريا المختصة29. اخلطي جيدا برفق. احتضان علي الجليد لمده 30 دقيقه.
  3. الحرارة صدمه ل 60 s في 42 درجه مئوية. ثم تبرد علي الجليد لمده 2 دقيقه. أضافه 900 μL من المرق lysogeny (LB) المتوسطة ، احتضان في 37 درجه مئوية لمده 1 ساعة ، وتهتز في 225 دوره في الدقيقة. تدور في 1,000 x g لمده 1 دقيقه ، ثم قم بازاله 900 μl من supernatant. أعاده تعليق بقية الحل.
  4. طبق البكتيريا المتحولة علي لوحات أجار 1.5 ٪ LB التي تحتوي علي الامبيسلين (100 ميكروغرام/مل) ، واحتضان بين عشيه وضحيها في 37 درجه مئوية.
  5. اعداد ما لا يقل عن 20 1.5 mL أنابيب الطرد المركزي لكل بناء. ملء مجموعه واحده مع 500 μL من LB المتوسطة التي تحتوي علي 100 ميكروغرام/مل ampicillin. استخدام طرف ماصه معقمه لخدش مستعمره بكتيرية واحده عشوائيا وتخلط (عن طريق الأنابيب) مع 500 μL من LB المتوسطة. احتضان في 37 درجه مئوية لمده 5 ساعات ، وتهتز في 225 دوره في الدقيقة.
  6. تسلسل ادراج جزء باستخدام M13 التمهيدي العكسي: CAGGAAACAGCTATGAC بواسطة Sanger التسلسل30.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويبين الشكل 1، الشكل 2، الشكل 3، الشكل 4الإجراءات والنتائج الخاصة بالeclip. وكانت الفئران رحيم مع ثاني أكسيد الكربون وتم اجراء شق صغير في أسفل البطن باستخدام المقص الجراحي (الشكل 2 ا،ب). تمت أزاله الخصيتين الماوس ، detunicat...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

مع زيادة فهم الدور العالمي لتقييديه تحت كل من السياقات البيولوجية والمرضية ، وقد استخدمت أساليب كليب علي نطاق واسع للكشف عن وظيفة الجزيئية من تقييديه20،32،33، 34,35. يمثل البروتوكول الموصوف هنا تطبيقا معدلا لأسلوب eCLIP علي خصيه الماوس.

أحد التحديات في أداء eCLIP في الخصية هو الحفاظ علي القدرة علي البقاء وسلامه خلايا الخصية الجديدة...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وليس لدي المؤلفين ما يفصحون عنه.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نشكر اريك L فان نوستراند وجين دبليو يو للتوجيه المفيد مع البروتوكول الأصلي. وقد تم دعم K.Z. من قبل برنامج المفتاح الوطني R & D من الصين (2016YFA0500902, 2018Yبرشلونه 1003500), والمؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (31771653). وقد دعمت L.Y. من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (81471502 ، 31871503) وبرنامج مبتكره وريادة الاعمال في مقاطعه جيانغسو.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
<قوية>أجسام مضادة
مضادة للفأر MOV10  الأجسام المضادةProteintech، الصين10370-1-AP
الأجسام المضادة MOV10L1 المضادة للفأرZheng et al.20109polyclonal antisera UP2175المقدمة من مختبر P. Jeremy Wang، جامعة بنسلفانيا
HRP الماعز المضاد للأرانب IgG ABclonalAS014
Rabbit IgGBeyotime ، الصينA7016
معدات
الطرد المركزيEppendorf ، هامبورغ ، ألمانيا5242R
جهاز صوتي رقميبرانسون ، الولايات المتحدة الأمريكيةBBV12081048A450 واط ؛ 50/60 هرتز
DynaMag-2 مغناطيسInvitrogen ، الولايات المتحدةالأمريكية 12321D
Mini وحدة لطخةInvitrogen ، الولايات المتحدة الأمريكيةB1000
Mini Gel TankInvitrogen ، الولايات المتحدة الأمريكيةA25977
حاضنة اهتزازEppendorf ، هامبورغ ، ألمانياThermomixer Comfort   ؛
طاحونة المناديل ، DouncePYREX ، الولايات المتحدة الأمريكية1234F35فقط  تستخدم المدقة "السائبة" في هذا البروتوكول
المعيار القياسي 96 التدرجالحيوي ، ألمانياالرقم التسلسلي: 2604323
Tube Revolver كريستال ، الولايات المتحدة الأمريكيةالرقم التسلسلي: 3406051
الأشعة فوق البنفسجية الخفيفة عبر الرابطUVP ، USACL-1000
< Strong>Materials< / قوي >
TC معالج ثقافةطبق Corning ، الولايات المتحدة الأمريكية430167100 مم   ؛
أنابيبكورنينج ، الولايات المتحدة الأمريكية43079115 مل
أنابيب MicrotubesAXYGEN ، USAMCT-150-C1.5 مل & nbsp ؛
Reagents  < / قوي >
حمض الفينول / الكلوروفورم / كحول الأيزوميل   ؛Solarbio ، الصينP101125:24:01
AffinityScript EnzymeAgilent ، الولايات المتحدة الأمريكية600107
مضادات الأكسدةInvitrogen ، الولايات المتحدة الأمريكيةNP0005
DH5 & alpha البكتيريا المختصةThermo Scientific ، الولايات المتحدة الأمريكية18265017تنتج هذه الخلايا الاقتصادية >1 × 106< / sup> المحولات الصغيرة. ز التحكم في الحمض النووي لكل 50 & ميكرو ؛ رد فعل L.
DMSOSigma-Aldrich ، الولايات المتحدة الأمريكيةD8418
DNA LadderInvitrogen ، الولايات المتحدةالأمريكية 10416014
dNTPSigma-Aldrich ، الولايات المتحدة الأمريكيةDNTP100-1KT
Dynabeads Protein A & nbsp ؛Invitrogen ، الولايات المتحدة الأمريكية10002D
كاشف ECLVazyme ، الصينE411-04
EDTAInvitrogen ، الولايات المتحدة الأمريكيةكوكتيل
روش ، الولايات المتحدة الأمريكية04693132001إضافة
Exo-SAP-ITAffymetrix الطازج ، الولايات المتحدة الأمريكية78201كاشف تنظيف منتج PCR   ؛
إنزيم FastAPThermo Scientific ، الولايات المتحدة الأمريكيةEF0652
LDS عينة عازلةحرارية علمية ، الولايات المتحدة الأمريكيةNP0007
MetaPhor Agarose   ؛lonza ، سويسرا50180
MgCl2< / sub>Invitrogen ، الولايات المتحدة الأمريكيةAM9530G
MiniElute gel ExtractionQIAGEN ، ألمانيا28604مخزن العمود في 4 ؟ ؛ المخزن المؤقت QG = ذوبان الهلام ؛ المخزن المؤقت PE = المخزن المؤقت للغسيل (للخطوة 14) MyONE
Silane BeadsThermo Scientific ، الولايات المتحدة الأمريكية37002Dاستخراج الأحماض النووية الخرز المغناطيسي
NaClInvitrogen ، الولايات المتحدة الأمريكيةAM9759
  ؛
NP-40Amresco ، الولايات المتحدة الأمريكيةM158-500ML
NuPAGE Bis-Tris Protein GelsInvitrogen ، الولايات المتحدة الأمريكيةNP0336BOX4٪ & ndash ؛ 12٪ ، 1.5 مم ، 15 بئر
NuPAGE MOPS SDS Buffer Kit   ؛Invitrogen ، الولايات المتحدة الأمريكيةNP0050
PBSGibco ، الولايات المتحدة الأمريكية10010023
أنبوب ثقيل جل مقفل الطور (PLG)   ؛  TIANGEN ، الصينWM5-2302831
PowerUp SYBR Green Master MixApplied Biosystems ، الولايات المتحدة الأمريكيةA25742
Proteinase KNEB ، نيو إنجلاند   ؛P8107S
Q5 PCR ماستر ميكس  NEB ، نيو إنجلاند M0492L
RLT bufferQIAGEN ، ألمانيا79216RNA تنقية تحلل المخزن المؤقت   ؛
الحمض النووي الريبي نظيف & Concentrator-5 columns ZYMO RESEARCH, USAR1016RNA تنقية وتركيز أعمدة
RNase I & nbsp;Invitrogen ، الولايات المتحدة الأمريكيةAM2295
RNase InhibitorPromega ، الولايات المتحدة الأمريكيةN251B
RQ1 DNasePromega ، الولايات المتحدة الأمريكيةM610A
عامل اختزال العينةInvitrogen ، الولايات المتحدة الأمريكيةNP0009
SDS SolutionInvitrogen ، الولايات المتحدة الأمريكية1555302710٪
ديوكسيكولات الصوديومسيجما ألدريتش ، الولايات المتحدةالأمريكية 30970حماية من إنزيم
T4 PNKNEB ، نيو إنجلاند   ؛M0201L
T4 RNA ligase 1 مخروطية عاليةNEB ، نيو إنجلاند   ؛M0437M
TA / Blunt-Zero Cloning MixVazyme ، الصينC601-01
TBEInvitrogen ، الولايات المتحدة الأمريكيةAM9863
Tris-HCI BufferInvitrogen ، الولايات المتحدة الأمريكية15567027
Triton X-100Sangon Biotech ، الصينA600198  ؛
Tween-20Sangon Biotech ، الصينA600560
UreaSigma-Aldrich ، الولايات المتحدة الأمريكيةU5378
أفلام الأشعة السينيةCaresteam ، كندا6535876
مثبط البروتياز الخالي من EDTA AM9260G الخفيف

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Turner, J. M., Mahadevaiah, S. K., Ellis, P. J., Mitchell, M. J., Burgoyne, P. S. Pachytene asynapsis drives meiotic sex chromosome inactivation and leads to substantial postmeiotic repression in spermatids. Developmental Cell. 10 (4), 521-529 (2006).
  2. Turner, J. M. A. Meiotic sex chromosome inactivation. Development. 134 (10), 1823-1831 (2007).
  3. Kimmins, S., Sassone-Corsi, P. Chromatin remodelling and epigenetic features of germ cells. Nature. 434 (7033), 583-589 (2005).
  4. Ule, J., et al. CLIP identifies Nova-regulated RNA networks in the brain. Science. 302 (5648), 1212-1215 (2003).
  5. Ule, J., Jensen, K., Mele, A., Darnell, R. B. CLIP: a method for identifying protein-RNA interaction sites in living cells. Methods. 37 (4), 376-386 (2005).
  6. Trifillis, P., Day, N., Kiledjian, M. Finding the right RNA: identification of cellular mRNA substrates for RNA-binding proteins. RNA. 5 (8), 1071-1082 (1999).
  7. Tenenbaum, S. A., Carson, C. C., Lager, P. J., Keene, J. D. Identifying mRNA subsets in messenger ribonucleoprotein complexes by using cDNA arrays. Proceedings of National Acadamy of Sciences U S A. 97 (26), 14085-14090 (2000).
  8. Chi, S. W., Zang, J. B., Mele, A., Darnell, R. B. Argonaute HITS-CLIP decodes microRNA-mRNA interaction maps. Nature. 460 (7254), 479-486 (2009).
  9. Zheng, K., et al. Mouse MOV10L1 associates with Piwi proteins and is an essential component of the Piwi-interacting RNA (piRNA) pathway. Proceedings of National Acadamy of Sciences U S A. 107 (26), 11841-11846 (2010).
  10. Gregersen, L. H., et al. MOV10 Is a 5' to 3' RNA helicase contributing to UPF1 mRNA target degradation by translocation along 3' UTRs. Molecular Cell. 54 (4), 573-585 (2014).
  11. Banerjee, S., Neveu, P., Kosik, K. S. A coordinated local translational control point at the synapse involving relief from silencing and MOV10 degradation. Neuron. 64 (6), 871-884 (2009).
  12. Choi, J., Hwang, S. Y., Ahn, K. Interplay between RNASEH2 and MOV10 controls LINE-1 retrotransposition. Nucleic Acids Research. 46 (4), 1912-1926 (2018).
  13. Goodier, J. L., Cheung, L. E., Kazazian, H. H. Jr MOV10 RNA helicase is a potent inhibitor of retrotransposition in cells. PLoS Genetics. 8 (10), e1002941(2012).
  14. Haussecker, D., et al. Capped small RNAs and MOV10 in human hepatitis delta virus replication. Nature Structural & Molecular Biology. 15 (7), 714-721 (2008).
  15. Kenny, P. J., et al. MOV10 and FMRP regulate AGO2 association with microRNA recognition elements. Cell Reports. 9 (5), 1729-1741 (2014).
  16. Messaoudi-Aubert, S. E., et al. Role for the MOV10 RNA helicase in Polycomb-mediated repression of the INK4a tumor suppressor. Nature Structural & Molecular Biology. 17 (7), 862-868 (2010).
  17. Sievers, C., Schlumpf, T., Sawarkar, R., Comoglio, F., Paro, R. Mixture models and wavelet transforms reveal high confidence RNA-protein interaction sites in MOV10 PAR-CLIP data. Nucleic Acids Research. 40 (20), e160(2012).
  18. Skariah, G., et al. Mov10 suppresses retroelements and regulates neuronal development and function in the developing brain. BMC Biology. 15 (1), 54(2017).
  19. Zheng, K., Wang, P. J. Blockade of pachytene piRNA biogenesis reveals a novel requirement for maintaining post-meiotic germline genome integrity. PLoS Genetics. 8 (11), e1003038(2012).
  20. Vourekas, A., et al. The RNA helicase MOV10L1 binds piRNA precursors to initiate piRNA processing. Genes & Development. 29 (6), 617-629 (2015).
  21. Hocq, R., Paternina, J., Alasseur, Q., Genovesio, A., Le Hir, H. Monitored eCLIP: high accuracy mapping of RNA-protein interactions. Nucleic Acids Research. 46 (21), 11553-11565 (2018).
  22. Huppertz, I., et al. iCLIP: protein-RNA interactions at nucleotide resolution. Methods. 65 (3), 274-287 (2014).
  23. Hafner, M., et al. Transcriptome-wide identification of RNA-binding protein and microRNA target sites by PAR-CLIP. Cell. 141 (1), 129-141 (2010).
  24. Hafner, M., et al. PAR-CliP--a method to identify transcriptome-wide the binding sites of RNA binding proteins. Journal of Visualized Experiments. (41), (2010).
  25. Konig, J., et al. iCLIP reveals the function of hnRNP particles in splicing at individual nucleotide resolution. Nature Structural & Molecular Biology. 17 (7), 909-915 (2010).
  26. Konig, J., et al. iCLIP--transcriptome-wide mapping of protein-RNA interactions with individual nucleotide resolution. Journal of Visualized Experiments. (50), (2011).
  27. Maticzka, D., Ilik, I. A., Aktas, T., Backofen, R., Akhtar, A. uvCLAP is a fast and non-radioactive method to identify in vivo targets of RNA-binding proteins. Nature Communications. 9 (1), 1142(2018).
  28. Van Nostrand, E. L., et al. Robust transcriptome-wide discovery of RNA-binding protein binding sites with enhanced CLIP (eCLIP). Nature Methods. 13 (6), 508-514 (2016).
  29. Radulovich, N., Leung, L., Tsao, M. S. Modified gateway system for double shRNA expression and Cre/lox based gene expression. BMC Biotechnology. 11, 24(2011).
  30. Breunig, C. T., et al. A Customizable Protocol for String Assembly gRNA Cloning (STAgR). Journal of Visualized Experiments. (142), (2018).
  31. Kuhn, R. M., Haussler, D., Kent, W. J. The UCSC genome browser and associated tools. Briefings in Bioinformatics. 14 (2), 144-161 (2013).
  32. Vourekas, A., et al. Mili and Miwi target RNA repertoire reveals piRNA biogenesis and function of Miwi in spermiogenesis. Nature Structural & Molecular Biology. 19 (8), 773-781 (2012).
  33. Preitner, N., et al. APC is an RNA-binding protein, and its interactome provides a link to neural development and microtubule assembly. Cell. 158 (2), 368-382 (2014).
  34. Meyer, C., et al. The TIA1 RNA-Binding Protein Family Regulates EIF2AK2-Mediated Stress Response and Cell Cycle Progression. Molecular Cell. 69 (4), 622-635 (2018).
  35. Gerstberger, S., Hafner, M., Tuschl, T. A census of human RNA-binding proteins. Nature Reviews Genetics. 15 (12), 829-845 (2014).
  36. Vourekas, A., Mourelatos, Z. HITS-CLIP (CLIP-Seq) for mouse Piwi proteins. Methods in Molecular Biology. 1093, 73-95 (2014).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Enhanced CLIPProtein bound RNAMouse TestisRNA binding ProteinsCrosslinking ImmunoprecipitationSpermatogenesisGerm CellsMOV10 MOV10L1Piwi interacting RNA3 UTR Targets

Related Articles