هنا ، ونحن نقدم بروتوكول يستخدم الاصباغ الاشعه تحت الحمراء القريبة بالاقتران مع المسح الضوئي مناعي وعاليه الدقة لفحص البروتينات في مناطق الدماغ.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
استخدام الاشعه تحت الحمراء القريبة والمسح عاليه الدقة لقياس تعبير البروتين في الدماغ القوارض
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
العلوم العصبية هي دراسة كيفيه توسط الخلايا في الدماغ وظائف مختلفه. قياس تعبير البروتين في الخلايا العصبية والخلايا الدبقيه أمر بالغ الاهميه لدراسة علوم الأعصاب كما يتم تحديد وظيفة الخلوية من قبل تكوين ونشاط البروتينات الخلوية. في هذه المقالة ، ونحن وصف كيف يمكن الجمع بين المناعية الكيمياء مع الاشعه تحت الحمراء القريبة من المسح الضوئي عاليه الدقة لتوفير قياس شبه كمي من التعبير البروتين في مناطق الدماغ متميزة. ويمكن استخدام هذه التقنية للتعبير البروتين واحد أو مزدوج في نفس المنطقة الدماغ. يمكن استخدام قياس البروتينات بهذه الطريقة للحصول علي تغيير نسبي في تعبير البروتين مع التلاعب التجريبي ، والتوقيع الجزيئي للتعلم والذاكرة ، والنشاط في المسارات الجزيئية ، والنشاط العصبي في مناطق الدماغ المتعددة. باستخدام البروتينات الصحيحة والتحليل الإحصائي ، يمكن تحديد الاتصال الوظيفي بين مناطق الدماغ أيضا. ونظرا لسهوله تنفيذ الكيمياء المناعية في المختبر ، فان استخدام المناعة المناعية مع المسح الضوئي العالي الدقة بالاشعه تحت الحمراء يمكن ان يوسع من قدره الأعصاب علي فحص العمليات البيولوجية العصبية علي مستوي الانظمه.
المقدمة
الدراسة من العلوم العصبية تتعلق بالتحقيق في كيفيه الخلايا في الدماغ توسط وظائف محدده1. هذه يمكن ان تكون الخلوية في الطبيعة مثل كيفيه الخلايا التي تمنح الحصانة في الجهاز العصبي المركزي أو يمكن ان تنطوي علي التجارب التي تهدف إلى شرح كيفيه نشاط الخلايا العصبية في الحصين الظهري يؤدي إلى الملاحة المكانية. بمعني واسع ، يتم تحديد وظيفة الخلوية من قبل البروتينات التي يتم التعبير عنها في خليه ونشاط هذه البروتينات2. ونتيجة لذلك ، فان قياس التعبير و/أو نشاط البروتينات في خلايا المخ أمر بالغ الاهميه لدراسة العلوم العصبية.
وهناك عدد من التقنيات المتاحة لقياس التعبير البروتين في الدماغ. وتشمل هذه الأساليب في الكائنات المجرية مثل التضاريس الانبعاثات بوزيترون لكثافة مستقبلات3 والصغرى-غسيل الكلي للببتيدات الصغيرة4. أكثر شيوعا ، وتستخدم أساليب الجسم الآخر لفحص وظيفة البروتين والتعبير. وتشمل هذه التقنيات الطيف الكتلي5، وصمه عار الغربية والانزيم المرتبطة المقايسة المناعية (اليسا)6، والمناعية الكيمياء7. ويستخدم علي نطاق واسع في مجال الكيمياء العصبية المناعية. وينطوي هذا الأسلوب علي استخدام الأجسام المضادة الاساسيه للكشف عن البروتين (أو مستضد) الفائدة (مثلا ، c-Fos) والأجسام المضادة الثانوية المترافقة للكشف عن مجمع الأجسام المضادة للبروتين الأساسي (الشكل 1). لتمكين الكشف عن الأجسام المضادة البروتين-الاساسيه-مجمع الأجسام المضادة الثانوية ، والأجسام المضادة الثانوية لديها عوامل مؤكسده مثل البيروكسيداز الفجل (التي) مترافق لهم. وهذا يسمح لتشكيل الرواسب في الخلايا التي يمكن الكشف عنها باستخدام المجهر الضوئي7. الأجسام المضادة الثانوية يمكن أيضا ان يكون المواد الكيميائية يتالق مترافق لهم (اي الفلوروبيورس). عندما تحفز هذه المواد الكيميائية تنبعث منها الضوء ، والتي يمكن استخدامها للكشف عن البروتين-المضادات الاساسيه-مجمعات الأجسام المضادة الثانوية7. وأخيرا ، في بعض الأحيان الأجسام المضادة الاوليه لديها عوامل الحد والمواد الكيميائية مضان الملحقة بها السلبية مباشره الحاجة إلى الأجسام المضادة الثانوية7 (الشكل 1).
ومن المثير للاهتمام ، العديد من الأساليب المناعية تسمح لتصور البروتينات في خلايا المخ ، ولكن ليس القدرة علي قياس كميه البروتين في خليه معينه أو منطقه الدماغ. استخدام المجهر الضوئي للكشف عن الرواسب من ردود الفعل الحد يسمح لتصور الخلايا العصبية والخلايا الأخرى ، ولكن هذا الأسلوب لا يمكن استخدامها لقياس التعبير البروتين في الزنزانات أو في منطقه الدماغ محدده. من الناحية النظرية ، يمكن استخدام المجهر الفلوري لهذا ، لان الضوء المنبعث من الأجسام المضادة الثانوية الفلورية هو مقياس للأجسام المضادة للبروتين الاوليه-مجمع الأجسام المضادة الثانوية. ومع ذلك ، فان الفلورية في انسجه المخ يمكن ان تجعل من الصعب استخدام المجهر الفلوري لقياس التعبير البروتين في انسجه المخ8. ونتيجة لذلك ، نادرا ما يستخدم الضوء المنبعث من الصور الفلورية لأنسجه المخ لقياس تعبير البروتين في الدماغ.
يمكن معالجه العديد من هذه القضايا باستخدام الاشعه تحت الحمراء شبه الكيميائية بالتزامن مع المسح الضوئي عاليه الدقة9,10. في هذه المقالة ، ونحن وصف كيف المناعية الكيميائية إلى جانب فلوبهورس في أطياف الانبعاثات شبه الاشعه تحت الحمراء يمكن الجمع بين المسح الضوئي عاليه الدقة (علي سبيل المثال ، 10-21 μm) للحصول علي الصور الحاده التي تسمح للقياس الكمي نصف البروتين في متميزة مناطق الدماغ.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
تمت الموافقة علي البروتوكول التالي من قبل لجنه الرعاية الحيوانية والاستخدام المؤسسي (IACUC) في جامعه ديلاوير. ذكرت [سبرغ] [ددلي] فيران تقريبا 55-75 أيام قديمه كان استعملت ل هذا بروتوكول.
1. استخراج المخ واعداد الانسجه
- تخدير الفئران مع ايزوفلونان في غرفه الحث التخدير حتى الفئران لم يعد يسلك استجابه لقرصه القدم.
- التضحية الفئران عن طريق قطع الراس السريع باستخدام المقصلة.
- قطع الجلد علي الجمجمة الخلفي إلى الامامي وواضح من اعلي الجمجمة.
- استخدام رونجيورس لأزاله بعناية الجزء الخلفي من الجمجمة ، ومن ثم استخدام مقص تشريح الصغيرة خفض خط الوسط من الجمجمة ، ودفع التصاعدي ضد الجزء العلوي من الجمجمة في جميع الأوقات لتجنب اتلاف انسجه المخ.
- استخدام رونجيورس لقشر بعيدا اليمين واليسار نصف الجمجمة لفضح الدماغ.
- استخدام ملعقة صغيره لمغرفة تحت الدماغ وقطع الأعصاب ، ورفع بعناية الدماغ وتجميد العقول في نظير المبردة علي الجليد الجاف (علي الأقل-20 درجه مئوية). بعد ذلك, تخزين العقول في 80 درجه مئوية الفريزر حتى تقطيع.
- شريحة العقول في مناطق الفائدة في 30-50 μm في التبريد المحافظة بين-9 درجه مئوية و-12 درجه مئوية. مباشره جبل شرائح علي الشرائح الزجاجية وتخزينها في 80 درجه مئوية الفريزر حتى وقت فحص الكيمياء المناعية.
ملاحظه: في هذا البروتوكول الدماغ المناطق التي تهم الحصين واللوزة.
2. رد فعل واحد مناعي
ملاحظه: لرد فعل مزدوج مناعي ، والبروتوكول هو نفسه رد فعل مناعي واحد باستثناء هذا التفاعل لديه اثنين من الأجسام المضادة الاساسيه للمضيفين مختلفه (علي سبيل المثال ، الأرنب والفار) واثنين من الأجسام المضادة الثانوية لل المقابلة ينبغي ان تكون الانتخابات التمهيدية من مضيف واحد (علي سبيل المثال ، انتيرابيت الماعز والماعز المضادة). يجب ان تكون الأجسام المضادة الثانوية أيضا من اثنين من أطياف مختلفه متوفرة في الماسحات الضوئية عاليه الدقة. علي سبيل المثال ، واحد الأجسام المضادة الثانوية مع ذروه الانبعاثات في 680 نانومتر وواحد الأجسام المضادة الثانوية 800CW (ذروه الانبعاثات في 780 نانومتر).
- أزاله الشرائح الزجاجية من الفريزر والسماح لتتوازن إلى درجه حرارة الغرفة لمده 30 دقيقه.
- تحت غطاء الدخان, إصلاح انسجه المخ في 4% بارافورمالدهيد في 0.1 M الفوسفات مخزنه المالحة (الخدمات التلفزيونية الخاصة) ل 1 − 2 ح في درجه حرارة الغرفة.
- شطف الشرائح في 0.1 M تريس مخزنه المالحة (TBS) ثلاث مرات لمده 10 دقيقه لكل منهما. يتخلل اغشيه الخلايا من خلال احتضان الشرائح في المنظفات معتدل (علي سبيل المثال ، 0.01 ٪ المنظفات) لمده 30 − 60 دقيقه.
- شطف الشرائح في TBS ثلاث مرات لمده 15 دقيقه لكل منهما.
- تمييع الأجسام المضادة الاساسيه للبروتين الفائدة في التركيز الصحيح. علي سبيل المثال ، للكشف عن الجينات المبكرة الفورية ج-فوس ، واعداد أرنب الابتدائي مكافحه c-فوس الأجسام المضادة في تركيز 1:500.
- محلول الأضداد الاساسيه ماصه مباشره علي انسجه المخ (حوالي 200 μL لكل 3 بوصه × 1 بوصه الشريحة).
- استخدام الشفتين لاحتضان انسجه المخ علي الشرائح الزجاجية في تخفيف الأجسام المضادة الاوليه لمده 1 − 2 ح في درجه حرارة الغرفة أو بين عشيه وضحيها (~ 17 ساعة) في 4 درجه مئوية.
- أزاله الشفتين وغسل الشرائح في TBS التي لديها كميه صغيره من المنظفات المضافة اليها (علي سبيل المثال ، 0.01 ٪ المنظفات ، "TBS-T") أربع مرات لمده 15 دقيقه لكل منهما.
- استخدام الشفتين لاحتضان أقسام الدماغ في الأجسام المضادة الثانوية في درجه حرارة الغرفة لمده 2 ساعة.
ملاحظه: الأجسام المضادة الثانوية يجب ان تكون إلى التخفيف الصحيح وفي مخفف التي تحتوي علي TBS ، والمنظفات ، و 1.5 ٪ من المصل المضيف. علي سبيل المثال ، فان الأجسام المضادة الثانوية الماعز في تخفيف 1:2000 تحتوي علي 1.5 ٪ مصل الماعز و 0.05 ٪ المنظفات. - شطف الشرائح في TBS-T أربع مرات لمده 20 دقيقه لكل منهما ، ومن ثم في TBS أربع مرات لمده 20 دقيقه لكل منهما.
- الشرائح الجافة في درجه حرارة الغرفة في الظلام بين عشيه وضحيها. عندما تكون الشرائح جافه ، فهي جاهزه للتصوير.
3-التصوير
- ضع الشرائح علي واجهه المسح بالاشعه تحت الحمراء القريبة مع الانسجه التي تواجه الأسفل. اما صوره شريحة زجاجيه واحده أو شرائح متعددة في كل مره باستخدام أداه تحديد.
- الشرائح الصورة باستخدام اعداد اعلي مستوي من الجودة مع أزاحه من 0 نانومتر وقرار من 21 μm. وعاده ما يستغرق المسح الضوئي من 13 − 19 ساعة اعتمادا علي معدات المسح المستخدمة.
- استيراد الصور إلى برنامج تحليل الصور (علي سبيل المثال ، ImageStudio) لعرض ووضع علامة لتحليل البروتين شبه الكمي.
4. تحليل البروتين التعبير
- افتح برنامج تحليل الصور وحدد منطقه العمل التي تم مسح الصورة منها.
- افتح الصورة الممسوحة ضوئيا في برنامج تحليل الصور لعرض المسح الضوئي ، واضبط الأطوال الموجية التي يتم عرضها ، بالاضافه إلى التباين والسطوع والتكبير المعروض دون تغيير الصورة الاوليه أو الانبعاث الكمي الإجمالي.
- تحديد المناطق الرئيسية للقياس الكمي وحدد علامة التبويب التحليل علي طول الأعلى من الصفحة ، ثم حدد رسم مستطيل (أو رسم القطع الناقص /رسم اليدالحرة) لرسم مستطيل علي المنطقة التي سيتم تحديدها كميا.
- لعرض حجم المستطيل ، حدد الاشكال علي طول الجزء السفلي الأيسر من الشاشة ، ثم حدد الاعمده الموجودة أسفل اليمين. أضافه أعمده الارتفاع والعرض للتعرف علي حجم الشكل.
ملاحظه: من المهم التحكم في حجم الشكل عند مقارنه القياس الكمي. من المستحسن استخدام الاشكال المتطابقة الموضوعة ضمن الموقع الكمي المطلوب ، من أجل الحصول علي عينه دقيقه من الانبعاثات لتلك المنطقة. - ثم اسم الشكل وكرر. وبمجرد ان يتم أخذ عينات من جميع المناطق ، يمكن تجميع البيانات المتوفرة من علامة تبويب الاعمده وتحليلها.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
قبل استخدام المسح الضوئي عالي الدقة لمناعي ، يجب التحقق من ان البروتوكول يعمل. ويمكن تحقيق ذلك باستخدام فحص التحقق من الصحة حيث يتم احتضان أقسام المخ من نفس الحيواني مع الأجسام المضادة الاوليه والثانوية ، والأجسام المضادة الثانوية وحدها ، أو لا الأجسام المضادة الاوليه ولا الثانوية. وترد نتائج هذا الفحص في الشكل 2. في رد الفعل هذا كنا الكشف عن الجينات المبكرة الفورية c-يونيو في الحصين الظهري واللوزة. لم يلاحظ التعبير C-Jun الا عندما تم تطبيق الأجسام المضادة ال...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
تظهر النتائج المعروضة في هذه المقالة انه يمكن استخدام الخلايا المناعية القريبة من الاشعه تحت الحمراء في تركيبه مع المسح الضوئي عالي الدقة للحصول علي مقاييس شبه كميه لتعبير البروتين في انسجه المخ. ويمكن أيضا ان تستخدم لتسميه اثنين من البروتينات في وقت واحد في نفس المنطقة الدماغ. وقد استخدمنا سابقا بالقرب من الاشعه تحت الحمراء مناعي لقياس التعبير الجيني المبكر الفوري في مناطق الدماغ متعددة9,10. يمكن استخدام الجينات المبكرة الفورية كمقياس للنشاط العصبي. كما أخضعنا ه...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
وليس لدي المؤلفين ما يفصحون عنه.
شكر وتقدير
تم تمويل البحث في هذا التقرير من قبل منحه الهدف من NIGMS (1P20GM103653) منح إلى DK.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
غرفة الدماغ شرائح المناعي الكيميائي
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| تحريض التخدير لاستخراج | |||
| كينت Scientific | VetFlo-0530SM | ||
| كلاين المقصلة | جهاز هارفارد | 73-1920 | |
| فريدمان رونجور | أدوات العلوم الدقيقة | 16000-14 | تستخدم لإزالة الجزء الخلفي من الجمجمة |
| مقص تشريح دقيق | فيشر ساينتيك | 08-951-5 | تستخدم لقطع لأعلى على طول خط الوسط للجمجمة |
| ملعقة صغيرة | فيشر العلمي | 21-401-5 | تستخدم لاستخراج الدماغ |
| المجهر الزجاجي فيشر | العلمي | 12-549-6 | |
| التفاعل | |||
| ؛ يستخدم Triton X-100 | كمنظف معتدل لاختراق الخلايا بعد التثبيت في Paraformaldehyde ، ويستخدم أيضا كمنظف معتدل مع مصل المضيف والأجسام المضادة الثانوية ؛ | ||
| Tween-20 | يستخدم ككمية صغيرة من المنظفات المضافة إلى TBS & nbsp; لشراء TBS-T بعد تغطية الشرائح باستخدام الأجسام المضادة الأولية | ||
| Licor Odyssey scanner | Licor Biotechnology Inc. | ||
| Image Studio | Licor Biotechnology Inc. |
المراجع
- Kandel, E. R. Principles of Neural Science. , McGraw Hill. New York. (2013).
- Byrne, J. H., Roberts, J. L. From Molecules to Networks: An Introduction to Cellular and Molecular Neuroscience. , Academic Press/Elsevier. (2009).
- Salami, A., et al. Dopamine D2/3 binding potential modulates neural signatures of working memory in a load-dependent fashion. Journal of Neuroscience. , (2018).
- Merali, Z., Khan, S., Michaud, D. S., Shippy, S. A., Anisman, H. Does amygdaloid corticotropin-releasing hormone (CRH) mediate anxiety-like behaviors? Dissociation of anxiogenic effects and CRH release. European Journal of Neuroscience. 20 (1), 229-239 (2004).
- English, J. A., et al. Dataset of mouse hippocampus profiled by LC-MS/MS for label-free quantitation. Data in Brief. 7, 341-343 (2016).
- David, M. A., Tayebi, M. Detection of protein aggregates in brain and cerebrospinal fluid derived from multiple sclerosis patients. Frontiers in Neurology. 5, 251(2014).
- Oliver, C., Jamur, M. C. Immunocytochemical methods and protocols. Methods in Molecular Biology. , (2010).
- Spitzer, N., Sammons, G. S., Price, E. M. Autofluorescent cells in rat brain can be convincing impostors in green fluorescent reporter studies. Journal of Neuroscience Methods. 197 (1), 48-55 (2011).
- Knox, D., et al. Using c-Jun to identify fear extinction learning-specific patterns of neural activity that are affected by single prolonged stress. Behavioural Brain Researach. 341, 189-197 (2018).
- Knox, D., et al. Neural circuits via which single prolonged stress exposure leads to fear extinction retention deficits. Learning & Memory. 23 (12), 689-698 (2016).
- Malinow, R., Malenka, R. C. AMPA receptor trafficking and synaptic plasticity. Annual Review of Neuroscience. 25, 103-126 (2002).
- Nabavi, S., et al. Engineering a memory with LTD and LTP. Nature. 511 (7509), 348-352 (2014).
- Kimmelmann-Shultz, B., Mohammadmirzaei, N., Della Valle, R., Knox, D. Using high resolution near infrared imaging to measure fear-learning induced changes in AMPA/NMDA ratios throughout the fear circuit. The Annual Delaware Neuroscience Research and Poster Symposium, Newark, DE, , (2018).
- Eagle, A. L., et al. Single prolonged stress enhances hippocampal glucocorticoid receptor and phosphorylated protein kinase B levels. Neuroscience Research. 75 (2), 130-137 (2013).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
الوسوم
