يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

تقييم صلاحية الخلية والموت في الثقافات الكروية ثلاثية الأبعاد للخلايا السرطانية

28.6K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/59714

⸱

يونيو 16, 2019

 ,  , 
1Section for Cell Biology and Physiology, Department of Biology, Faculty of Science, University of Copenhagen

في هذه المقالة

ملخص

هنا، نقدم العديد من الطرق البسيطة لتقييم الجدوى والموت في كروية الخلايا السرطانية ثلاثية الأبعاد، والتي تحاكي التدرجات الفيزيائية الكيميائية للأورام الحية أفضل بكثير من الثقافة 2D. نموذج كروي, وبالتالي, يسمح تقييم فعالية المخدرات السرطان مع تحسين الترجمة إلى في ظروف الجسم الحي.

الملخص

الكرويات ثلاثية الأبعاد من الخلايا السرطانية هي أدوات هامة لكل من شاشات المخدرات السرطان واكتساب البصيرة الميكانيكية في بيولوجيا الخلايا السرطانية. قوة هذا الإعداد يكمن في قدرتهعلى تقليد العديد من جوانب الظروف في الجسم الحي من الأورام في حين يجري سريعة ورخيصة، وتنوعا بما فيه الكفاية للسماح فحص عالية الإنتاجية نسبيا. يمكن أن تلخص ظروف الثقافة الكروية التدرجات الفيزيائية الكيميائية في الورم، بما في ذلك الحموضة خارج الخلايا المتزايدة، وزيادة اللاكتات، وتقليل توافر الجلوكوز والأكسجين، من محيط كروي إلى جوهره. أيضا، يتم تقليد الخصائص الميكانيكية والتفاعلات خلية الخلية من الأورام في الجسم الحي جزئيا من قبل هذا النموذج. خصائص محددة، وبالتالي ظروف النمو الأمثل، من كروية 3D، تختلف على نطاق واسع بين أنواع مختلفة من الخلايا السرطانية. وعلاوة على ذلك، فإن تقييم صلاحية الخلايا والموت في الكرويات ثلاثية الأبعاد يتطلب أساليب تختلف جزئياً عن تلك المستخدمة في الثقافات ثلاثية الأبعاد. هنا نحن وصف عدة بروتوكولات لإعداد كروية 3D من الخلايا السرطانية، واستخدام هذه الثقافات لتقييم قدرة الخلايا على البقاء والموت في سياق تقييم فعالية الأدوية المضادة للسرطان.

المقدمة

استخدام نماذج متعددة الخلايا كروية في علم الأحياء السرطان هو عدة عقود من العمر1,2, ولكن اكتسبت زخما كبيرا في السنوات الأخيرة. وهذا يعكس إلى حد كبير زيادة الوعي بمدى قوة النمط الظاهري للخلايا السرطانية يعتمد على بيئتها الدقيقة وظروف نموها المحددة. البيئة الدقيقة في الأورام الصلبة تختلف اختلافا جوهريا عن تلك التي في الأنسجة العادية المقابلة. ويشمل ذلك الظروف الفيزيائية الكيميائية مثل درجة الألف الألف، وتوتر الأكسجين، وكذلك الضغط الخلالي، وتدرجات تركيز العوامل القابلة للذوبان مثل المواد الغذائية، ومنتجات النفايات، ومركبات الإشارات المفرزة (عوامل النمو، السيتوكينات). وعلاوة على ذلك، فإنه يشمل تنظيم المصفوفة خارج الخلية (ECM)، والتفاعلات الخلية الخلية والإشارات بين الخلايا، وجوانب أخرى من العمارة ثلاثية الأبعاد (3D) معينة للورم3،4، 5,6. الظروف البيئية الدقيقة المحددة التي توجد فيها الخلايا السرطانية، تؤثر بشكل عميق على ملامح التعبير الجيني والخصائص الوظيفية، ومن الواضح أنه، بالمقارنة مع تلك التي تنمو في الخلايا 2D، والنمط الظاهري من كروية 3D يحاكي عن كثب أن من الأورام في الجسم الحي7،8،9،10،11. نماذج 2D، حتى لو كانت تستخدم نقص الأكسجة، الحموضة الحمضية، والتركيزات اللاكتات عالية لتقليد الجوانب المعروفة من البيئة الدقيقة الورم، لا تزال تفشل في التقاط تدرجات المعلمات الفيزيائية الكيميائية الناشئة داخل الأورام، فضلا عن ورمها 3D الهندسه المعماريه. من ناحية أخرى، النماذج الحيوانية مكلفة، بطيئة، وإشكالية أخلاقيا، وعموما، لديها أيضا أوجه القصور في قدرتها على تلخيص ظروف الورم البشري. وبالتالي، تم تطبيق كرويات ثلاثية الأبعاد كنموذج تعقيد متوسط في دراسات مجموعة واسعة من خصائص معظم أنواع السرطان الصلبة9،11،12،13، 14,15,16,17.

استخدام المستخدمة على نطاق واسع من كروية 3D هو في فحص الاختبارات من فعالية العلاج بالسرطان9,18,19,20. الاستجابات العلاجية حساسة بشكل خاص للورم الميكروي، مما يعكس كل من تأثير التقصير، والانتشار المقيد، والضغط الخلالي العالي، ودرجة الحموضة البيئية الحمضية على تسليم الأدوية، وتأثير نقص الأكسجة وغيرها جوانب من البيئة الدقيقة على استجابة موت الخلية9,17. لأن البيئة داخل كروية 3D يتطور بطبيعتها كل هذه الخصائص7،8،9،10،11، يمكن توظيف الثقافات خلية 3D تحسين ترجمة النتائج إلى ظروف حية بشكل كبير، مع السماح بكفاءة وبأسعار معقولة عالية الإنتاجية الفرز من صافي النمو. ومع ذلك، لا تزال الغالبية العظمى من الدراسات على استجابة المخدرات من الخلايا السرطانية تجري في ظل ظروف 2D. وهذا يعكس على الأرجح أنه، في حين أن بعض الاختبارات يمكن تنفيذها بسهولة نسبيا لثقافات الخلايا 3D، وكثير، مثل اختبارات البقاء، والنشاف الغربية، وتحليل الفلور المناعي، يتم القيام به بشكل مريح أكثر بكثير في 2D مما كانت عليه في 3D.

والهدف من العمل الحالي هو توفير الفحوصات والبروتوكولات الدقيقة سهلة الملاءمة لتحليل تأثير العلاج بالأدوية المضادة للسرطان على قدرة الخلايا السرطانية على البقاء على قيد الحياة في بيئة محاكاة للورم ثلاثي الأبعاد. وعلى وجه التحديد، نقدم ونقارن ثلاث طرق مختلفة لتشكيل كروي، تليها طرق للتحليلات النوعية والكمية للنمو، والقدرة على البقاء، والاستجابة للمخدرات.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1. جيل من الكرويدات

  1. إعداد تعليق الخلية لتشكيل كروي
    ملاحظة:     خطوط الخلايا المختلفة لها خصائص التصاق مختلفة جداويجب أن يتم تأسيس بروتوكول تشكيل كروية مناسبة في كل حالة. لقد وجدنا أن خلايا MCF-7 و BxPC-3 مناسبة لتشكيل كرويتلقائي، في حين أن MDA-MB-231، SKBr-3، Panc-1 و MiaPaCa تتطلب إضافة غشاء الطابق السفلي المعاد تشكيله لتشكيل كروية بنجاح. فقط MDA-MB-231 وBxPC-3 الخلايا قد استخدمت لبروتوكول إسقاط شنقا، ولكن خطوط الخلايا الأخرى تنطبق بالتأكيد.
    1. تنمو الخلايا كطبقة واحدة حتى 70-80% confluency.
    2. الخلايا المزودة بمحلول ملحي من الفوسفات (1× PBS، 5 مل ل25 سم2 أو 10 مل لقارورة 75 سم2)، إضافة انزيم فصل الخلية (0.5 مل ل 25 سم2 أو 1 مل ل75 سم2 قارورة) واحتضان الخلايا لمدة 2-5 دقيقة في 37 درجة مئوية في 5% ثاني2 و 95% رطوبة.
    3. تحقق من مفرزة الخلية تحت المجهر وتحييد انزيم الخلايا المنفصلة عن طريق إضافة متوسط النمو (6-10٪ مصل اعتمادا على خط الخلية) إلى حجم إجمالي 5 مل في 25 سم2 أو 10 مل ل75 سم2 قارورة.
    4. استخدام غرفة Bürker لحساب الخلايا وحساب 8 مربعات في غرفة لكل إعداد الخلية للحصول على استنساخ عالية من حجم الكرويات.
      ملاحظة: وترد أدناه ثلاثة بروتوكولات تصف كل طريقة مختلفة لتشكيل كروية. ويمكن استخدام البروتوكولين 1-2 و1-3 في جميع البروتوكولات التحليلية اللاحقة المقدمة، في حين أن البروتوكول 1-4 هو الأنسب لتضمين الاستعدادات والتجهيز. اعتمادا على خط الخلية، وتشكيل كروي ة يستغرق 2-4 أيام، بغض النظر عن الطريقة المستخدمة.
  2. تشكيل كروي تلقائي
    1. تنفيذ الخطوات 1.1.1-1.1.4.
    2. تمييع تعليق الخلية في أنبوب 15 مل للحصول على 0.5-2 X 104 خلايا / مل (الكثافة المثلى للخلايا يجب أن تحدد لكل خط خلية) (الشكل1ألف '2').
    3. ملء الحلقة الخارجية من الآبار مع 1X PBS أو متوسط النمو للحد من التبخر من الآبار المتبقية. نقل تعليق الخلية إلى خزان معقم، وباستخدام ماصة متعددة القنوات، اغنى 200 ميكرولتر/بئر إلى لوحات سفلية مستديرة ذات 96 بئر مرفقة منخفضة للغاية (الشكل1ألف '3').
    4. احتضان لوحة في حاضنة في 37 درجة مئويةمع 5٪ ثاني 2، 95٪ الرطوبة.
    5. كل 2-3 أيام الحصول على الصور المجهرية الخفيفة من كروية.
      ملاحظة: يتم التقاط الصور في هذه الورقة في التكبير 11.5x، وهو مناسب لمعظم كروية أعدت باستخدام هذه البروتوكولات.
    6. كل 2-3 أيام (بعد الحصول على الصور) استبدال 100 μL المتوسطة (إزالة 100 μL من المتوسط قضى واستبدال مع 100 ميكرولتر من المتوسطة الطازجة.
      ملاحظة: لتجنب إزالة الكرويات عند استبدال المتوسطة، فإنه من المستحسن لإمالة لوحة قليلا ً في حين إزالة ببطء المتوسطة وفحص المتوسطة يستنشق في نصائح لكرويدات مرئية قبل التخلص منها.
  3. إعادة تشكيل غشاء القبو بوساطة تشكيل كروي.
    ملاحظة:     تم استخدام اللاكتوز dehydrogenase ارتفاع فيروس (LDEV) خالية من انخفاض معامل النمو غشاء الطابق السفلي (rBM). rBM حساسة لدرجة الحرارة، وينبغي أن تبقى دائما على الجليد، كما أنها سوف تتخثر إذا وصلت إلى 15 درجة مئوية. قم بذوبان rBM على الجليد إما بين عشية وضحاها عند درجة حرارة الغرفة أو 2-4 ساعات في درجة حرارة الغرفة (RT) قبل الطلاء.
    1. ثوّم [ربم] على جليد (رأيت طاولة ال [متريلس]).
    2. احتفظ بالألواح والخزانات (إذا كانت ملفوفة بشكل فردي) على الجليد قبل الاستخدام.
    3. تنفيذ الخطوات 1.1.1-1.1.4.
    4. ملء الحلقة الخارجية من الآبار مع 1X PBS أو متوسط النمو للحد من التبخر من الآبار المتبقية. تمييع تعليق الخلية في أنبوب 15 مل للحصول على 0.5-2 X 104 خلايا / مل (الكثافة المثلى للخلايا يجب أن تحدد لكل خط خلية) (الشكل1ألف '2').
    5. ضع أنبوب 15 مل الذي يحتوي على تعليق الخلية المخفف على الجليد (على سبيل المثال، في كوب زجاجي) (الشكل1A (iia)).
    6. نقل الألواح المبردة والخزانات إلى غطاء محرك السيارة. شطف الحاويات البلاستيكية، وملء لهم مع الجليد ونقلها إلى غطاء محرك السيارة للسماح لوحات والخزانات لوضعها على الجليد خلال العملية بأكملها.
    7. إعادة تعليق rBM بلطف لضمان هلام متجانسة.
    8. إضافة 1-2٪ rBM (التركيز الأمثل يحتاج إلى تحديد لكل خط خلية) إلى تعليق الخلية المبردة (الشكل1ألف (iib)).
    9. عكس أنبوب 15 مل لضمان الخلط السليم من rBM وتعليق الخلية قبل الاستغناء عن تعليق في لوحة.
    10. نقل تعليق الخلية التي تحتوي على rBM إلى خزان معقم وصرف 200 ميكرولتر/بئر إلى لوحات مبردة منخفضة جداً 96 بئر باستخدام ماصة متعددة القنوات (الشكل1ألف '3').
      ملاحظة: إذا كان العمل مع تعليق الخلية عدة (على سبيل المثال، أكثر من خط خلية)، فمن الضروري الاستغناء عن كل تعليق الخلية مباشرة بعد إضافة rBM لمنع التبلور المبكر.
    11. جهاز طرد مركزي لوحة لمدة 15 دقيقة في 750 x ز باستخدام 'لينة لائق'/ لا الكبح (إذا كان ذلك ممكنا، والطرد المركزي في 4 درجة مئوية للحفاظ على السائل rBM أطول ولكن ليس شرطا لتشكيل كروية ناجحة)، لضمان أن يتم تجميع الخلايا معا عندما rBM تصلب ، وتسهيل تشكيل كروية واحدة واحدة.
    12. احتضان لوحة في حاضنة (37 درجة مئوية،5٪ ثاني 2، 95٪ الرطوبة).
    13. كل 2-3 أيام الحصول على الصور المجهرية الخفيفة لتقييم النمو كروي.
    14. كل 2-3 أيام استبدال 100 μL المتوسطة (إزالة 100 ميكرولتر واستبدل مع 100 ميكرولتر من المتوسطة الطازجة).
  4. تعليق قطرة كروية.
    1. تنفيذ الخطوة 1.1.1-1.1.4.
    2. خلايا مخففة للحصول على تخفيف مناسب. والتخفيف العملي هو 50،000 خلية / مل.
    3. إزالة غطاء طبق ثقافة خلية 10 سم2 ووضعها حتى أنه يواجه صعودا. أضف 6 مل من 1x PBS إلى الطبق (الشكل 1B (ط)).
    4. صب تعليق الخلية في خزان معقم ووضع بعناية تصل إلى 30 قطرات من 40 ميكرولتر من تعليق الخلية على غطاء طبق ثقافة الخلية باستخدام ماصة متعددة القنوات (الشكل1B '2))،مما أدى إلى تركيز 2،000 خلية / قطرة. تجنب وضع قطرات قريبة جدا من حافة الغطاء وهذه قطرات هي أكثر عرضة لتفقد التوتر السطحي عند عكس الغطاء في الخطوة التالية.
    5. عكس الغطاء في حركة سريعة ولكن تسيطر عليها ووضعها على رأس 1X PBS التي تحتوي على طبق الخلية الثقافة (الشكل 1B '3').
    6. ضع الطبق في حاضنة عند درجة حرارة 37 درجة مئوية مع 5% ثاني أكسيد الكربون2 و95% الرطوبة دون إزعاج قطرات وتركها تنمو لمدة 4-6 أيام.
    7. إذا كان لاستخدامها لlysates البروتين أو التضمين، تجمع كروية عن طريق إزالة الغطاء وإمالة ذلك، من أجل غسل قطرات مع 1 مل من المتوسطة ساخنة. نقل المتوسط الناتج ة تحتوي على كروية إلى أنبوب 1.5 مل والسماح لهم ليستقر إلى أسفل الأنبوب. المضي قدما كما هو موضح في 4.4 و 6.2.2 لlysates البروتين وتضمينها، على التوالي.

2. علاج الزبة

ملاحظة: ويمكن تطبيق العلاج الطويل الأجل للمخدرات على الكروية من أجل فحص آثار المخدرات ذات الأهمية. قبل البدء في العلاج بالعقاقير ، من المستحسن إجراء تجربة استجابة الجرعة للدواء (الأدوية) ، من أجل العثور على جرعة مناسبة للعلاج التجريبي. يجب أن تستند الجرعات علىIC 50 /Ki المحددة من المخدرات وتتراوح من حوالي 0.2x-10x من هذه القيمة.

  1. إعداد 6-12 كروية لكل حالة المطلوب كما هو موضح في 1.2 أو 1.3 ومكان في الحاضنة (37 درجة مئوية، 5٪ ثاني2،95٪ الرطوبة) لمدة 2 أيام.
  2. في اليوم الثاني، خذ صورًا مجهرية خفيفة للكرويدات.
  3. إعداد جرعات العلاج الأولى (بعد الحصول على الصور).
    ملاحظة: يجب أن يكون تركيز العلاج الأول ضعف التركيز النهائي المطلوب حيث سيتم تخفيف المحلول 1:2 عند إضافة إلى وسط 100 ميكرولتر الذي يحتوي على البئر. الفترات المقترحة لعلاج المخدرات (سوف تعتمد على نصف عمر المخدرات): اليوم 2 و 4 و 7.
  4. باستخدام ماصة متعددة القنوات، قم بإزالة 100 ميكرولتر من المتوسط واستبدالها بـ 100 ميكرولتر من الأدوية التي تحتوي على متوسط.
  5. ضع لوحة 96 بئر مرة أخرى في الحاضنة في 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني2 و 95٪ الرطوبة وتكرار 2.3 و 2.4 في الأيام المختارة من العلاج ولكن الآن دون مضاعفة الجرعة للحصول على الجرعة النهائية الصحيحة.
  6. في اليوم الأخير من الجدول الزمني للبروتوكول / العلاج، واحد أو عدة من الاختبارات التالية يمكن إجراء.

3. خلية قابلية الثبات للكرويرويدات

  1. إعداد 4-6 كروية لكل حالة المطلوب كما هو موضح في 1.2 أو 1.3 ووضع في الحاضنة في 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني2 و 95٪ الرطوبة.
    ملاحظة: وفي هذه الحالة، تم إجراء فحص مدى بقاء الخلية في اليوم 7 أو 9، بعد رصد نمو كروي كل يومين إلى ثلاثة أيام بواسطة المجهر الضوئي كما هو موضح أعلاه (النقطة 1-2-5 و1-3-13).
  2. قم بذوبان الكاشف القابلة للبقاء (انظر جدولالمواد) والسماح لها بالتوازن إلى RT قبل الاستخدام.
  3. اخلطي بلطف عن طريق المقلوب للحصول على حل متجانس.
  4. قبل إجراء الإنقازات، قم بإزالة 50% من الوسط الثقافي من الكرويات (100 ميكرولتر).
  5. إضافة الكاشف خلية قابلية البقاء لكل بئر بنسبة 1:3 إلى كمية من المتوسط الحاضر في البئر (الشكل 2A '1') للوحة 96 جيدا، إضافة 50 ميكرولتر من الكاشف إلى 100 μL من المتوسطة.
  6. اخلط المحتويات بقوة لمدة 5 دقائق للحث على تَرَكُس الخلايا (الشكل 2أ (2)).
  7. احتضان لمدة 25 دقيقة في RT لتحقيق الاستقرار في إشارة الانارة (الشكل 2ألف '3').
  8. تسجيل الإشارة الانارة (الشكل 2أ (4)).

4. إعداد الليسات البروتين لبقع الغربية من الثقافات كروية 3D

ملاحظة: عند جمع الكرويات، فإنه من المستحسن استخدام ماصة P200 وقطع نهاية الطرف للسماح بفتح أكبر وبالتالي التقاط أسهل من كرويرويدس دون إزعاج هيكلها.

  1. لكل حالة، تجمع ما لا يقل عن 12، من الناحية المثالية 18-24 كروية (اعتمادا على حجم كروي) في أنبوب 1.5 مل (تجنب 2 أنابيب مل، كما الخطوات التالية سوف تصبح أكثر صعوبة بسبب أسفل مدبب أقل).
    ملاحظة: إذا كان مقدار متوسط يتجاوز 1.5 مل قبل بعد أن جمعت جميع كروية، والسماح للكرويدات التي تم جمعها لتسوية في الجزء السفلي (يحدث بسرعة كبيرة، الطرد المركزي غير ضروري) وتجاهل نصف حجم الأنبوب قبل الاستمرار في جمع الكرويات المتبقية.
  2. وضع أنابيب على الجليد والسماح للكروية ليستقر في الجزء السفلي من أنبوب 1.5 مل.
  3. الانتقال من مختبر الخلية المعقمة إلى المختبر العادي.
  4. غسل كروية مرتين في 1 مل من الجليد الباردة 1X PBS. السماح كرويرويدس تسوية قبل إزالة 1X PBS بين كل خطوة الغسيل.
  5. استنشق أكبر عدد ممكن من 1X PBS دون إزعاج أو إزالة الكرويات.
  6. إضافة 5 μL من العازلة lysis ساخنة (LB) مع مثبطات الفوسفاتيز والبروتياز، لكل كروية (على سبيل المثال، 10 كروية = 50 ميكرولتر LB).
  7. كرر فترات الدوامة تليها تدور إلى أسفل حتى يتم حل كروية. أداء دورة من الدوامة لمدة 30 s تليها التمركز (تدور سريعة باستخدام جهاز طرد مركزي الطاولة كافية) لمدة 10 ق لحوالي 5-10 دقيقة اعتمادا على حجم والحجم والحجم من كروية.
    ملاحظة: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتاً هنا. حافظ على الليسات عند -20 درجة مئوية حتى يتم تنفيذ هاونشن، تجانس، وتحديد البروتين كما هو الحال في بروتوكول lysate البروتين 2D القياسية، تليها النشاف الغربية باستخدام البروتوكولات القياسية.

5. الببوبيديوم يوديد (PI) تلطيخ من كروية

  1. إعداد 3-6 كروية لكل حالة المطلوب كما هو موضح في 1.2 أو 1.3 ووضع في الحاضنة في 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني2 و 95٪ الرطوبة.
  2. في مختبر معقم لزراعة الخلايا، قم بتسخين 1x PBS إلى 37 درجة مئوية.
  3. جعل حل PI من 4 ميكرومتر عن طريق تمييع حل الأسهم في 1X PBS: تمييع 1 مغ / مل مخزون مائي من PI 1:350 في 1X PBS.
    ملاحظة: وسيتم تخفيض هذا التركيز إلى النصف عند إضافة الحل إلى الآبار مع التركيز النهائي من 2 ميكرومتر.
    تحذير: يجب التعامل مع اليود (PI) في غطاء الدخان وارتداء القفازات. PI حساسة للضوء. حماية من الضوء عند التعامل معها.
  4. إزالة 100 ميكرولتر من المتوسط من كل بئر في لوحة 96 جيدا دون إزالة الكرويات.
  5. اغسل الوسيط المتبقي بإضافة 100 ميكرولتر من 1x PBS ساخنة لجميع الآبار تليها إزالة 100 ميكرولتر من السائل في الآبار. كرر هذه الخطوة الغسيل 3 مرات.
  6. إضافة 100 ميكرولتر من حل PI لكل بئر، وتغطية لوحة في رقائق الألومنيوم ووضعها في حاضنة في 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني2 و الرطوبة 95٪ لمدة 10-15 دقيقة.
  7. كرر 3 خطوات الغسيل الموصوفة في 4.5 لغسل حل PI، من أجل تقليل إشارة الخلفية عند التصوير.
  8. استخدام المجهر الفلوري لتصوير كروية. لتقييم قابلية بقاء الخلايا في جوهر كروي تأخذ z-stacks للحصول على الصور مع أعماق متفاوتة من كروي.
    ملاحظة: من المستحسن أن يكون حجم الخطوة حوالي 18-35 ميكرومتر بين كل شريحة اعتمادا على حجم كروي، وإعطاء ما يقرب من 11-18 مداخن لكل كروية. يمكن معالجة Z-stacks في ImageJ باستخدام وظيفة الإسقاط z، والتي يمكن أن تجمع بين جميع z-stacks في صورة نهائية واحدة، وإعطاء لمحة عامة عن تلطيخ في جميع أنحاء كروي (لمزيد من المبادئ التوجيهية حول استخدام ImageJ لهذا الغرض، انظر (https://imagej.net/Z-functions).

6. تضمين الأغصان ثلاثية الأبعاد

  1. إعداد هلام الأجاروز التي يتم تضمين كروية (فقط أول مرة ضرورية أداء البروتوكول).
    1. اخلط 1 جم من الباكتوجار في 50 مل من ddH2O.
    2. سخني ببطء في فرن الميكروويف حتى يذوب الباكتوجار ويتشكل هلام متجانس. لا تسمح يغلى الجل.
    3. حافظ على الباكتوجار دافئاً في حمام مائي عند 60 درجة مئوية.
    4. حافظ على درجة حرارة 4 درجة مئوية بين التجارب.
  2. تضمين الأغصان.
    1. في اليوم 1، لكل حالة، تجمع ما لا يقل عن 12 كروية في أنبوب 1.5 مل.
    2. اغسل مرة واحدة مع 1 مل من الجليد الباردة 1X PBS.
    3. لإصلاح الكرويات، إضافة 1 مل من 4٪ بارافورمالديهايد.
      ملاحظة: وينبغي أن يتم التعامل مع البارافورمالديهايد في غطاء محرك الدخان.
    4. دعهم يحضنون لمدة 24 ساعة في RT.
    5. في اليوم الثاني، قم بتسخين هلام الأغاروز بعناية عن طريق وضعه في كوب مملوء بالماء في فرن ميكروويف. تأكد من أن الجل لا يغلي! يُحفظ دافئاً في طبق تسخين على سطح الطاولة، عند 60 درجة مئوية حتى يصبح للاستخدام.
    6. غسل كروية مرتين مع 1 مل من الجليد الباردة 1X PBS.
    7. يستنشق معظم 1X PBS (ترك ما يقرب من 100 ميكرولتر في هذه المرحلة هو عملي للتعامل مع كروية).
    8. إعداد ماصة 20 μL عن طريق قطع طرف ماصة في منحدر للحصول على طرف أكثر نقطة مع ثقب أكبر (انظر التوضيح).
      ملاحظة: الجزء التالي يجب القيام به بسرعة لضمان نقل كروي الأمثل وتجنب صلابة قطرة هلام. إذا لم تتوفر كتلة التدفئة، فمن المستحسن أن أول التقاط كروية ثم جعل قطرة أجاروز (أي، تبديل ترتيب النقاط 6.2.9 و 6.2.10).
    9. جعل قطرة هلام أجاروز على شريحة المجهر. ضع الشريحة على كتلة التدفئة الدافئة لمنع agarose من ترسيخ.
    10. باستخدام تلميح الماصة المعدل (انظر 6.2.8)، التقط أكبر عدد ممكن من الأغصان في حجم 15-20 ميكرولتر.
    11. حقن بعناية 15-20 ميكرونلتر كروية تحتوي على 1X PBS في وسط قطرة هلام أجاروز دون لمس الشريحة المجهر.
      ملاحظة: وهذه نقطة صعبة بعض الشيء. سيتم فقدان الكرويات إذا كان طرف الماصة يلمس شريحة المجهر عند حقن الكرويدات في قطرة هلام. فمن المستحسن ممارسة عملية كاملة من جعل قطرة الأغاروز وحقن الكروية عن طريق حقن سائل ملون في قطرة. وهذا سوف يسمح تصور اختراق محتمل من خلال قطرة، كما السائل الملونة سوف يكون تسرب إلى الشريحة.
    12. دع هلام الأغاروز يصلب باحتضان لمدة 5-10 دقيقة في RT أو عند 4 درجة مئوية. مرة واحدة وقد ترسخت قطرة هلام إلى حد ما (ولكن لا يزال لينة إلى حد ما)، ودفع بعناية قطرة هلام من الشريحة المجهر في كاسيت الأنسجة البلاستيكية مع مشرط.
    13. تغطية أشرطة الأنسجة البلاستيكية في 70٪ الإيثانول.
      ملاحظة: عند هذه النقطة يمكن استخدام كروية مباشرة أو تخزينها لعدة أشهر.
    14. قم بتضمين الكروية المدمجة بالأغروس في البارافين، والقسم إلى شرائح طبقة سميكة 2-3 ميكرومتر وصمة عار مع الهيماتوكسيلين وإيوسين أو تخضع لتلطيخ مناعية- هيستوري.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

اختبارات النمو كروية على أساس بروتوكول تشكيل كروية موضحة تخطيطيا في الشكل 1ألف والشكل 1B، واستخدمت كنقطة انطلاق لتحليل آثار العلاجات المضادة للسرطان المخدرات في ورم 3D محاكاة الإعداد. السهولة التي يتم تشكيل هاون الكروية هو خط الخلية محددة، وبعض خطوط الخلايا تتطلب مكملات مع rBM من أجل تشكيل كرويات متماسكة22. تركيز rBM المضافة يمكن أن تؤثر تأثيرا عميقا على مورفولوجيا الكروية. كما هو مبين في

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

وقد ثبت استخدام كرويرويدال الخلايا السرطانية 3D أداة قيمة وتنوعا ليس فقط لفحص المخدرات المضادة للسرطان، ولكن أيضا للحصول على البصيرة الميكانيكية في تنظيم موت الخلايا السرطانية والقدرة على البقاء في ظل ظروف تحاكي تلك الموجودة في الورم الصغرى البيئة. وهذا أمر حاسم بشكل خاص حيث تتأثر تأثيرات العلاج الكيميائي والتأثيرات داخل الخلايا داخل الخلايا بشكل كبير بالظروف الفيزيائية الكيميائية في الورم، بما في ذلك الـحال الـحَس، وتوتر الأكسجين، وتورطُر الجسم، والجسدية و التفاعلات الكيميائية الخلية الخلية9...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ولم يعلن أصحاب البلاغ عن أي تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

ونحن ممتنون لكاترين فرانكلين مارك وأنيت بارتلز للمساعدة التقنية الممتازة وأسبيورن نور-نيلسن لإجراء التجارب في الشكل 1D. تم تمويل هذا العمل من قبل مؤسسة إينار ويلمسن، ومؤسسة نوفو نورديسك، ومؤسسة جوشوم (جميعها إلى SFP).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
2- (4-أميدينوفينيل) -1H-indole-6-carboxamidine (DAPI)Invitrogen# C10595   ;لتلوين النوى
5-فلورويوراسيل (5-FU)سيجماألدريتش #F6627مكون في العلاج الكيميائي
5- (N-إيثيل إيزوبروبيل) أميلوريد (EIPA)تقنيات الحياة#E3111مثبط للجسم
المضاد NHE1 ضد إشارات خلية PARP و cPARP# 9542للنشاف الغربي
إشارات خليةKi-67# 9449المستخدمة في IHC
الجسم المضاد ضد إشارات الخلية p53 #2524 تستخدم ل IHC
الأجسام المضادة ضد β-actinSigma A5441المستخدمة في النشاف الغربي
BactoagarBD Bioscience# 214010تستخدم لتحضير هلام الاغاروز
سلم البروتين المعياريInvitrogen# 10747-012تستخدم في SDS-PAGE
Bio-Rad DC Protein Assay KitBio-Rad Laboratories# 500-0113 ، # 500-0114 ، # 500-0115   ؛  تستخدم لتقدير البروتين من المحللات
ب ü غرفة rkerMarienfeld610311لعد الخلايا  
مجهر الإبيكفلور BX63أوليمبوسيستخدم للتصوير الفلوري
CellTiter-Glo 3D Cell Waability AssayPromega#G9681يستخدم لمقايسة جدوى الخلية
سيسبلاتينسيجما-ألدريش#P4394 مكون في علاج العلاج الكيميائي
كورنينج كروية Microplate ، 96 بئر ، أسود مع قاع دائري واضح ،   ؛ مرفق منخفض للغاية ، مع غطاء ، معقمCorning# 4520يستخدم لزراعة الكرات الكروية بقياسات اللمعان كنقطة نهاية
Corning 96 جيدا ، قاع دائري واضح ،   ؛ صفيحة دقيقة مرفقة منخفضة للغاية ، مع غطاء ، معقمةCorning# 7007كافية للنمو الكروي دون قياسات التلألؤ كنقطة النهاية
معيار TGX جل مسبقة الصبBio-Rad5671025يستخدم في SDS-PAGE
DoxorubicinAbcam# 120629مكون في العلاج الكيميائي
FLUOStar Optima Microplate قارئBMG Labtechتستخدم لتسجيل اللمعان  
الفورمالديهايد VWR للكيماويات #9713.1000 تستخدم لتثبيت الخلايا
Geltrex LDEV خالية من عامل النمو المنخفض مصفوفة الغشاء القاعديGibco#A1413202الحفاظ على 4 درجات ؛ ج لمنع التصلب. يشار إليه باسم rBM في البروتوكول.
Sigmaالمعطل بالحرارة#F9665مصل لوسائط النمو
ImageJالمعاهد الوطنية للصحةتحليل الصور العلمية
Medim Uni-safe كاسيتMedim Histotechnologie10-0114تستخدم لتخزين الكرات المدمجة أقراص
كوكتيل مثبطات البروتياز الصغيرةRoche Diagnostics GmBH & nbsp ؛# 11836153001تستخدم لإعداد المخزن المؤقت للتحلل
MZ16 المجهرLeicaالمستخدمة للصور المجهرية الخفيفة
NuPAGE LDS 4x Sample Buffer   ؛Invitrogen#NP0007تستخدم للنشاف الغربي
بيرس ECL الركيزة النشاف الغربيةThermo Scientific# 32106تستخدم للنشاف الغربي
Ponceau SSigma-Aldrich#P7170-1Lتستخدم لتلوين شريط البروتين
Prism 6.0Graphpadالرسوم البيانية العلمية والبرامج الإحصائية
بروبيديوم يوديد (محلول 1 مجم / مل في الماء)Invitrogen P3566حساسة للضوء 
خزانات معقمة ، علومالحياة SPLالقنوات 21002تستخدم لبذر الخلايا لتكوين كروي
التصاق Superfrost Ultra-Plus   ؛Menzel-Glä ser#J3800AMNZزجاجية مجهرية تستخدم لتضمين
TamoxifenSigma-Aldrich#T5648تستخدم كعلاج كيميائي
Trans-blot Turbo 0.2 & micro ؛ م أغشية النيتروسليلوزBio-Rad# 170-4159تستخدم للنشاف الغربي
Tris / Glycine / SDS تشغيل العازلة   ؛Bio-Rad # 161 0732تستخدم لحل SDS-PAGE
Trypsin-EDTASigma#T4174 إنزيم تفكك الخلايا
يستخدم في الأجسام المضادة ضد FBS متعددة شريحة شريحة

المراجع

  1. Sutherland, R. M. Cell and environment interactions in tumor microregions: the multicell spheroid model. Science. 240 (4849), 177-184 (1988).
  2. Mueller-Klieser, W., Freyer, J. P., Sutherland, R. M. Influence of glucose and oxygen supply conditions on the oxygenation of multicellular spheroids. British Journal of Cancer. 53 (3), 345-353 (1986).
  3. Gaedtke, L., Thoenes, L., Culmsee, C., Mayer, B., Wagner, E. Proteomic analysis reveals differences in protein expression in spheroid versus monolayer cultures of low-passage colon carcinoma cells. Journal of Proteome Research. 6 (11), 4111-4118 (2007).
  4. Chen, J. L., et al. The genomic analysis of lactic acidosis and acidosis response in human cancers. PLoS Genetics. 4 (12), 1000293(2008).
  5. Cukierman, E., Pankov, R., Stevens, D. R., Yamada, K. M. Taking cell-matrix adhesions to the third dimension. Science. 294 (5547), 1708-1712 (2001).
  6. Gudjonsson, T., Ronnov-Jessen, L., Villadsen, R., Bissell, M. J., Petersen, O. W. To create the correct microenvironment: three-dimensional heterotypic collagen assays for human breast epithelial morphogenesis and neoplasia. Methods. 30 (3), 247-255 (2003).
  7. Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nature Reviews in Molecular and Cell Biology. 8 (10), 839-845 (2007).
  8. Hirschhaeuser, F., et al. Multicellular tumor spheroids: an underestimated tool is catching up again. Journal of Biotechnology. 148 (1), 3-15 (2010).
  9. Jacobi, N., et al. Organotypic three-dimensional cancer cell cultures mirror drug responses in vivo: lessons learned from the inhibition of EGFR signaling. Oncotarget. 8 (64), 107423-107440 (2017).
  10. Rodriguez-Enriquez, S., et al. Energy metabolism transition in multi-cellular human tumor spheroids. Journal of Cell Physiology. 216 (1), 189-197 (2008).
  11. Kunz-Schughart, L. A. Multicellular tumor spheroids: intermediates between monolayer culture and in vivo tumor. Cell Biology International. 23 (3), 157-161 (1999).
  12. Andersen, A. P., et al. Roles of acid-extruding ion transporters in regulation of breast cancer cell growth in a 3-dimensional microenvironment. Molecular Cancer. 15 (1), 45(2016).
  13. Swietach, P., Patiar, S., Supuran, C. T., Harris, A. L., Vaughan-Jones, R. D. The role of carbonic anhydrase 9 in regulating extracellular and intracellular ph in three-dimensional tumor cell growths. Journal of Biological Chemistry. 284 (30), 20299-20310 (2009).
  14. Walenta, S., Doetsch, J., Mueller-Klieser, W., Kunz-Schughart, L. A. Metabolic imaging in multicellular spheroids of oncogene-transfected fibroblasts. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 48 (4), 509-522 (2000).
  15. Kunz-Schughart, L. A., Groebe, K., Mueller-Klieser, W. Three-dimensional cell culture induces novel proliferative and metabolic alterations associated with oncogenic transformation. International Journal of Cancer. 66 (4), 578-586 (1996).
  16. Feng, H., et al. Homogeneous pancreatic cancer spheroids mimic growth pattern of circulating tumor cell clusters and macrometastases: displaying heterogeneity and crater-like structure on inner layer. Journal of Cancer Research and Clinical Oncology. 143 (9), 1771-1786 (2017).
  17. Santini, M. T., Rainaldi, G., Indovina, P. L. Apoptosis, cell adhesion and the extracellular matrix in the three-dimensional growth of multicellular tumor spheroids. Critical Reviews in Oncology/Hematology. 36 (2-3), 75-87 (2000).
  18. Vinci, M., et al. Advances in establishment and analysis of three-dimensional tumor spheroid-based functional assays for target validation and drug evaluation. BMC Biology. 10, 29(2012).
  19. Pickl, M., Ries, C. H. Comparison of 3D and 2D tumor models reveals enhanced HER2 activation in 3D associated with an increased response to trastuzumab. Oncogene. 28 (3), 461-468 (2009).
  20. Wong, C., Vosburgh, E., Levine, A. J., Cong, L., Xu, E. Y. Human neuroendocrine tumor cell lines as a three-dimensional model for the study of human neuroendocrine tumor therapy. Journal of Visual Experiments. (66), e4218(2012).
  21. Friedrich, J., et al. A reliable tool to determine cell viability in complex 3-d culture: the acid phosphatase assay. Journal of Biomolecular Screening. 12 (7), 925-937 (2007).
  22. Ivascu, A., Kubbies, M. Diversity of cell-mediated adhesions in breast cancer spheroids. International Journal of Oncology. 31 (6), 1403-1413 (2007).
  23. Crouch, S. P., Kozlowski, R., Slater, K. J., Fletcher, J. The use of ATP bioluminescence as a measure of cell proliferation and cytotoxicity. Journal of Immunological Methods. 160 (1), 81-88 (1993).
  24. Andersen, A. P., et al. The net acid extruders NHE1, NBCn1 and MCT4 promote mammary tumor growth through distinct but overlapping mechanisms. International Journal of Cancer. , (2018).
  25. Vaupel, P. Tumor microenvironmental physiology and its implications for radiation oncology. Seminars in Radiation Oncology. 14 (3), 198-206 (2004).
  26. Vaupel, P. W., Frinak, S., Bicher, H. I. Heterogeneous oxygen partial pressure and pH distribution in C3H mouse mammary adenocarcinoma. Cancer Research. 41 (5), 2008-2013 (1981).
  27. Helmlinger, G., Yuan, F., Dellian, M., Jain, R. K. Interstitial pH and pO2 gradients in solid tumors in vivo: high-resolution measurements reveal a lack of correlation. Nature Medicine. 3 (2), 177-182 (1997).
  28. Zhang, X., Lin, Y., Gillies, R. J. Tumor pH and its measurement. Journal of Nuclear Medicine. 51 (8), 1167-1170 (2010).
  29. Gillies, R. J., Raghunand, N., Karczmar, G. S., Bhujwalla, Z. M. MRI of the tumor microenvironment. Journal of Magnetic Resonance Imaging. 16 (4), 430-450 (2002).
  30. Vukovic, V., Tannock, I. F. Influence of low pH on cytotoxicity of paclitaxel, mitoxantrone and topotecan. British Journal of Cancer. 75 (8), 1167-1172 (1997).
  31. Song, C. W., Griffin, R., Park, H. J. Cancer Drug Resistance. Teicher, B. A. , Humana Press. 21-42 (2006).
  32. Lotz, C., et al. Role of the tumor microenvironment in the activity and expression of the p-glycoprotein in human colon carcinoma cells. Oncology Reports. 17 (1), 239-244 (2007).
  33. Sant, S., Johnston, P. A. The production of 3D tumor spheroids for cancer drug discovery. Drug Discovery Today: Technologies. 23, 27-36 (2017).
  34. Stratmann, A. T., et al. Establishment of a human 3D lung cancer model based on a biological tissue matrix combined with a Boolean in silico model. Molecular Oncology. 8 (2), 351-365 (2014).
  35. Kuen, J., Darowski, D., Kluge, T., Majety, M. Pancreatic cancer cell/fibroblast co-culture induces M2 like macrophages that influence therapeutic response in a 3D model. PLoS One. 12 (7), 0182039(2017).
  36. Bochet, L., et al. Adipocyte-derived fibroblasts promote tumor progression and contribute to the desmoplastic reaction in breast cancer. Cancer Research. 73 (18), 5657-5668 (2013).
  37. Amann, A., et al. Development of a 3D angiogenesis model to study tumour - endothelial cell interactions and the effects of anti-angiogenic drugs. Scientific Reports. 7 (1), 2963(2017).
  38. LaBonia, G. J., Ludwig, K. R., Mousseau, C. B., Hummon, A. B. iTRAQ Quantitative Proteomic Profiling and MALDI-MSI of Colon Cancer Spheroids Treated with Combination Chemotherapies in a 3D Printed Fluidic Device. Analytical Chemistry. 90 (2), 1423-1430 (2018).
  39. Hulikova, A., Vaughan-Jones, R. D., Swietach, P. Dual role of CO2/HCO3(-) formula buffer in the regulation of intracellular pH of three-dimensional tumor growths. Journal of Biological Chemistry. 286 (16), 13815-13826 (2011).
  40. Wallace, D. I., Guo, X. Properties of tumor spheroid growth exhibited by simple mathematical models. Frontiers in Oncology. 3, 51(2013).
  41. Michel, T., et al. Mathematical modeling of the proliferation gradient in multicellular tumor spheroids. Journal of Theoretical Biology. 458, 133-147 (2018).
  42. Meijer, T. G., Naipal, K. A., Jager, A., van Gent, D. C. Ex vivo tumor culture systems for functional drug testing and therapy response prediction. Future Science OA. 3 (2), (2017).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

زراعة الكريات ثلاثية الأبعادحيوية الخلايا السرطانيةتقييم موت الخلايافحص الأدوية المضادة للسرطانالبيئة المجهرية للأورامطريقة الإسقاط اليدويالطمر الكيميائي النسيجي المناعيصبغ يوديد البروبيديومالتصوير بنظام Z-Stackتأثيرات تركيز rBM
تقييم صلاحية الخلية والموت في الثقافات الكروية ثلاثية الأبعاد للخلايا السرطانية
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.