Method Article

استخدام يرقات الزيبرافيش لدراسة العواقب المرضية لسكته دماغيه نزفية

DOI:

10.3791/59716

⸱

June 5th, 2019

 ,  ,  ,  , 
1Division of Neuroscience and Experimental Psychology, School of Biological Sciences, Manchester Academic Health Science Centre, University of Manchester, 2Division of Cardiovascular Sciences, School of Medical Sciences, Faculty of Biology, Medicine and Health, Manchester Academic Health Science Centre, University of Manchester, 3Lydia Becker Institute of Immunology and Inflammation, University of Manchester

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نقدم هنا بروتوكولا لقياس إصابات الدماغ ، والعجز الحركي والتهاب العصبي بعد النزيف في الدماغ في يرقات الزبرفيش ، في سياق النزف البشري الداخل (ICH).

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

علي الرغم من كونها النوع الفرعي الأكثر شده من السكتة الدماغية مع ارتفاع معدل الوفاات العالمية ، لا يوجد علاج محدد للمرضي الذين يعانون من نزيف داخل المخ (ICH). وقد ثبت ان نمذجة التراث الich الطبيعي قبل السريرية صعبه ، ونماذج القوارض الحالية تلخص بشكل رديء الطبيعة العفوية لتراث الإنسان البشري. ولذلك ، هناك حاجه ملحه لمنهجيات بديله قبل السريرية لدراسة أليات الامراض في التراث الخاص ولاكتشاف المخدرات المحتملة.

استخدام الزرد يمثل نهجا متزايد الشعبية للبحوث الانتقالية ، ويرجع ذلك في المقام الأول إلى عدد من المزايا التي تمتلكها علي نماذج الثدييات من المرض ، بما في ذلك معدلات التكاثر غزير والشفافية يرقات السماح للعيش التصوير. وقد أسست مجموعات أخرى ان اليرقات الزبرافيش يمكن ان تظهر التراث الوراثي التلقائي بعد الاضطراب الجيني أو الكيميائي للتطور الدماغي الوعائي. والهدف من هذه المنهجية هو الاستفادة من مثل هذه النماذج لدراسة العواقب المرضية لنزيف الدماغ ، في سياق البحوث التي تسبق السريرية التراث العام. باستخدام التصوير الحي واختبارات الحركة ، يمكن تقييم تلف المخ والتهاب العصبي والوظيفة الحركية التالية لICH وتحديدها كميا.

وتبين هذه الدراسة ان العواقب المرضية الرئيسية لنزيف الدماغ في البشر يتم الحفاظ عليها في اليرقات التي تسلط الضوء علي نموذج الكائن الحي باعتباره قيمه في نظام فيفو للتحقيق ما قبل السريرية لل ICH. والهدف من هذه المنهجية هو تمكين المجتمع السكتة الدماغية قبل السريرية لاستخدام نموذج اليرقات الزرد كنظام نموذج تكميلي بديل لقوارض.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نزيف داخل المخ (ICH) هو النوع الفرعي الأكثر شده من السكتة الدماغية المرتبطة بتمزق الاوعيه المخية العفوية والنزيف في حمه مما يؤدي إلى تلف الدماغ, الاعاقه البدنية وغالبا ما يموت1. علي الرغم من ارتفاع معدل الوفاات والاعتلال المرتبطة ب ICH2، لا يزال هناك نقص في فهم المسببات الكامنة وامراض ما بعد النزف. وعلي هذا النحو ، لا توجد علاجات محدده لمنع التراث الطبيعي الطبيعي أو تحسين نتائج المرضي. وقد جاء معظم فهمنا لعلم الاحياء المرض من نماذج القوارض قبل السريرية من ICH3، ولكن الدراسات حتى الآن في هذه النماذج قد فشلت في ترجمه اي علاج ناجح للعيادة4،5. وقد يعزي هذا الفشل جزئيا إلى بعض القيود المفروضة علي هذه النماذج الاكلينيكيه ، بما في ذلك عدم القدرة علي تلخيص الطبيعة العفوية للامراض البشرية بسهوله واشتراط الجراحة الغازية لتوليد النماذج في الثدييات6. بالاضافه إلى ذلك ، تشكل القوارض مشاكل عمليه فيما يتعلق بمراقبه الظهور السريع للاستجابات الخلوية لل ICH في الانسجه السليمة. ونظرا للافتقار إلى الترجمة من نماذج القوارض ، فان تطوير نماذج بديله من التراث العشوائي العفوي أمر حتمي إذا أردنا التغلب علي هذه المشاكل العملية والمساعدة في تحديد أهداف جديده للمخدرات.

أليات الجزيئية لتطوير الاوعيه الدموية مصانة جيدا بين الفقاريات بما في ذلك الزرد (danio rerio)7. علي هذا النحو ، فان اعتماد هذا الكائن النموذجي أصبحت استراتيجية ميكانيكيه أكثر فائده من اي وقت مضي لدراسة الامراض المخية الوعائية8. وقد تم إنشاء عدد من نماذج الزرد التي تلخص الأنماط الظاهرية المرتبطة السكتة الدماغية الشروط المتعلقة9,10,11,12. استخدام اليرقات الزرد للتحقيق في الامراض المرضية يقدم كل من المزايا العملية والعلمية علي نماذج الثدييات8. وهذا يشمل معدلات التكاثر العالية ، والتنمية السريعة والشفافية يرقات التي تسمح للتصوير انترافيتال دون القيود الغازية المرتبطة القوارض. اقتران هذه المزايا مع مجموعه واسعه من خطوط المراسلين المعدلة وراثيا المتاحة داخل المجتمع البحثي الزرد يرقي إلى قويه في نهج الجسم الحيوي لدراسة البيولوجيا المرض, لم تستخدم بعد لدراسة المرضية عواقب التراث الخاص.

رد الاصابه علي الدم في الدماغ هو بيهاسيك13; الاهانه الاوليه تسبب الموت العصبي ونخر الخلية ، والذي يبدا بعد ذلك موجه ثانويه من الضرر الذي يسببه التنشيط المناعي الفطري. وتعتبر المرحلة الثانية من أصابه الدماغ, ولا سيما مكون التهاب العصبي, هدفا واقعيا لعلاج المخدرات في المستقبل13. وقد وصفت النزيف عفويه والدماغية محدده في اليرقات الزرد سابقا14,15,16,17,18,19. اثنين من هذه النماذج هي استخدام atorفاستاتين (ATV) في 24 ح بعد الإخصاب (hpf) لكبح مسار HMGCR والكوليسترول الحيوي14، والبثرة (bbh) متحولة التي تعبر عن طفرة في الجينات arhgef7 ، التي وبعد ذلك يثبط أعاده عرض الاكتين لتقاطعات أوعيه ضيقه18. هذه النماذج تظهر التلقائي الدماغي محدده تمزق الاوعيه الدموية في بداية الدورة الدموية (~ 33 hpf). في الاونه الاخيره ، وقد وصفت هذه النماذج مزيد من الكشف عن ان الجوانب الرئيسية للاستجابة لإصابات الدماغ يتم الحفاظ عليها بين البشر واليرقات الزرد20. توضح هذه الدراسة المنهجية المطلوبة للحصول علي وتصور نزيف الدماغ العفوي في يرقات الزبرد وكيفيه قياس أصابه الدماغ ، والأنماط الظاهرية الحركية والعصبية التي تتعلق بالحالة البشرية. وتدعم هذه البيانات والتقنيات استخدام هذه الأنواع النموذجية كنظام تكميلي قيم للبحوث المتعلقة بالتراث السابق للاستعمال السريري.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد تم رفع وصيانة زبرافيش في وحده الخدمات البيولوجية بجامعه مانشستر في ظل الظروف القياسية كما سبق وصفها في21. وقد تمت الموافقة علي تربيه الكبار من قبل جامعه مانشستر لرعاية الماشية والأخلاق مجلس مراجعه. تم اجراء جميع التجارب وفقا للوائح المكتب المنزلي في المملكة البريطانية (P132EB6D7).

ملاحظه: خطوط المحورة وراثيا المستخدمة في هذه الدراسة تشمل الضامة السلالة الخاصة mpeg1:mcherry (شيدت في المنزل كما هو موضح سابقا22) ، mcherryالعدلات الخاصة: gfp23،gata1 الخاصة بالحمر الحمراء: dsred24 و اوبيف:الضم-mvenus ، مراسل لموت الخلية (أعاده المستمدة في منزل25)علي البرية من نوع ، صدف (mitfaw2/w2) ومتحولة (bbhm292) الخلفيات. ويبين الشكل 1 الجدول الزمني التجريبي.

figure-protocol-1
الشكل 1 : رسم الجدول الزمني التجريبي لتوصيف إصابات الدماغ, الحركية والنتائج العصبية. [يش], نزيف داخل المخ; bbh ، الراس الزاهي. وقد استنسخ الرقم من Crilly وآخرون20 مع الاذن ببموجب رخصه المشاع الإبداعي. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم. 

1. اليوم 0: إنتاج البيض وجمع

  1. جمع الاجنه المخصبة من التفريخ الطبيعي في صناديق التكاثر المنتجة من رجل واحد و 1-2 من الإناث البالغات الزيبرافيش.
    ملاحظه: بالنسبة للبروتوكول atorفاستاتين اي البرية/الكائنات المعدلة وراثيا يمكن استخدامها ولكن نسب نزيف تختلف قليلا بين سلالات.
  2. احتضان 100 الاجنه في 28 درجه مئوية في المتوسطة E3 الجنين العادية في طبق بتري والمرحلة وفقا للمبادئ التوجيهية القياسية26.
  3. في ~ 6 ساعات بعد الإخصاب (hpf) أزاله الاجنه الميتة وغير المخصبة من الطبق باستخدام ماصه باستور.

2. اليوم 1: العلاج اتوفاستاتين في 24 hpf

  1. ديتشوريوناتي الاجنه للعلاج اتوفاستاتين باستخدام حاده جدا تشريح الملقط الرقيق27. ويمكن تعديل الأرقام المطلوبة للاختبار وفقا لذلك.
  2. أضف 30 مل من الجنين المتوسط إلى اثنين من اطباق بيتري النظيفة. استخدام طبق واحد ل100 الاجنه.
    ملاحظه: إذا تم تصميم لوحات لثقافة الخلية ، والزرد التهاوي في هذه المرحلة المبكرة في كثير من الأحيان التمسك القاع. لتجنب هذا ، شطف لوحات جيدا في المياه النظيفة قبل الاستخدام.
  3. أزاله 60 μL من المياه الجنينية من لوحه العلاج وأضافه 60 μL من 0.5 mM atorفاستاتين (ATV). في تركيز الأسهم 0.5 mM ، فان التخفيف أعلاه يؤدي إلى تركيز النهائي من 1 μM والتي سوف تؤدي إلى ~ 20 ٪ من اليرقات غير نزيف (ICH-) و ~ 80 ٪ من اليرقات نزيف (ICH +). استخدام لوحه أخرى لعناصر التحكم غير المعالجة
    ملاحظه: Atorفاستاتين هو solubilized في الماء المقطر (3 ملغ إلى 10 مل) لجعل 0.5 mM الحل الأسهم. احتضان بين عشيه وضحيها في درجه حرارة الغرفة في الظلام مع الانفعالات والاذابه ياخذ بعض الوقت. الاذابه الكاملة يمكن ان تستغرق ما يصل إلى أسبوع واحد. لا تستخدم DMSO. الحل هو المقتبسة وتخزينها في-20 درجه مئوية. لا تجمد الذوبان.
  4. باستخدام ماصه باستور ، نقل 100 الاجنه في اقل قدر ممكن من الماء إلى لوحات العلاج.
  5. احتضان لوحات في 28 درجه مئوية.
    ملاحظه: سوف يحدث ICH بين 33 و 48 hpf. اتوفاستاتين لا تحتاج إلى ازالتها كما حضانة أطول من 24 ح لا يسبب اي قضايا تنموية أخرى.

3-اليوم الثاني: فصل السكان المتضررين من التراث الich-والتراث الich + في 50 hpf

  1. منفصلة ICH + الأسماك من ICH-السكان ونقل إلى اطباق جديده لسهوله.
    1. إذا كان استخدام نموذج ATV بتركيز 1 μM ، 75-100 ٪ من اليرقات سوف تظهر نزيف (ICH +) في هذه النقطة الزمنيه.
      ملاحظه: تختلف استجابه اليرقات بين السلالات ، إذا كانت اليرقات لا تنزف في الترددات المطلوبة ، استخدم دفعه جديده من atorفاستاتين أو تركيز اعلي. إذا لم تظهر اليرقات نزيف بواسطة 48 hpf ثم النظر فيها ICH-.
    2. إذا كان استخدام نموذج bbh ، فان جميع المسوخ homاوزيلوس تظهر نزيف بواسطة 48 hpf. إذا كان استخدام incross غير المتجانسة ، يمكن استخدام الاشقاء التراث الشاذ والبراري والبرية كالسيطرة علي الماشية للتجارب.
  2. إذا لزم الأمر ، تخدير اليرقات باضافه 0.02% MS222 إلى الوسائط E3. باستخدام ماصه باستور ، فرز اليرقات لوجود الدم في الراس إلى وسائل الاعلام E3 الطازجة. انظر الشكل 2.
    ملاحظه: قد يظهر الدم في الراس في الصدارة أو الدماغ المتوسط أو المؤخر أو في تركيبه ، ويمكن ان يختلف حجم النزف بين الماشية. في المسوخ bbh ، وغالبا ما يرتبط ICH مع الوذمه الشديدة التي يمكن التعرف عليها من قبل رؤساء أكبر ، ومساحة أوسع بين العينين ونزيف أكثر انتشارا. ولكن ليس كل اليرقات ICH + bbh تظهر وذمه.

figure-protocol-2
الشكل 2 : ICH + الظواهر الظاهرية نزيف الدماغ. أمثله من الأنماط الظاهرية اليرقات التي تم الاحتفاظ بها علي gata1 المحورة وراثيا: الخلفية الصحفية التي تم ملاحظتها مع المجسم الفراغي (لوحات علويه) والفلورية (لوحه القاع) في ~ 48 h بعد الإخصاب. ولوحظ عدم وجود نزيف في التراث الخاص باليرقات (ألواح اليسرى). ولوحظ تراكم متميز من خلايا الدم الحمراء في الدماغ الاماميه والدماغ المؤخر (السهام) في التراث الICH + اليرقات (اللوحات اليمني). وتمثل أشرطه القياس 250 ميكرومتر. وقد استنسخ الرقم من Crilly وآخرون20 باذن ببموجب ترخيص المشاع الإبداعي. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم. 

4. اليوم 3: الموت خليه وتحليل الكريات البيضاء في 72 hpf

  1. شاشه اليرقات باستخدام المجهر مضان لضمان التعبير عن البروتين الفلوري.
    ملاحظه: في هذه الدراسة ، تم استخدام اليرقات المحورة وراثيا: secannexinv-mvenus للإبلاغ عن موت خلايا المخ والمزدوجة المحورة وراثيا mvenus: gfp. mpeg1: mcherry أو اوبيف: mpeg1: mcherry المستخدمة لتحليل الكريات البيضاء.
  2. ملء غرفه الاضاءه المضيءه مع وسائل الاعلام E3 التي تحتوي علي 0.02 ٪ MS222.
  3. تخدير اليرقات باستخدام 0.02% MS222. نقل يرقات للتركيب (ن = 1-6) إلى سطح طبق بيتري جاف في قطره واحده. أزاله أكبر قدر ممكن من السائل.
    ملاحظه: 1.5 ٪ ذوبان منخفضه اجنشا يتم اعدادها باستخدام 0.15 غرام من ذوبان منخفضه اجنشا المذاب في 10 مل من المتوسطة E3 دون الميثيلين الأزرق في الميكروويف وابقي في 45 درجه مئوية حتى الاستخدام.
  4. أضافه قطره من 1.5 ٪ منخفضه الذوبان اجنشا (الحفاظ علي السائل في 45 درجه مئوية كتله الحرارة) إلى اليرقات واستخدام 800 μm تصاعد الشعرية ، ورسم اليرقات فوق راسه أولا. إذا كان تحديد المواقع غير دقيق يمكن طرد اليرقات من الاجثار وشنها مره أخرى. ترك الشعرية لتبرد قبل ادراجها في غرفه lightsheet.
    ملاحظه: بدلا من ذلك ، يمكن استخدام المجهر البؤري لهذا الاجراء. لهذا ، يجب ان تكون اليرقات المركبة أفقيا في اجنشا علي طبق القاع الزجاج.
  5. الحصول علي z-كومه الصور من الراس بين العدسات العين (~ 300 μm) وعمليه إلى الحد الأقصى كثافة الصورة الإسقاط.
    1. تحليل منطقه الدماغ من الصور التي تم جمعها للعدد الإجمالي للخلايا الفلورية وإجمالي كثافة الفلوري20.
  6. إنشاء فيديو الفاصل الزمني للمركبات الإسقاط متعددة أكثر من 18-24 h لتتبع حركه الكريات البيضاء والتفاعل مع الخلايا المحتضرة.
    ملاحظه: إذا تم تنفيذ التصوير الحي علي المدى الطويل ، يتم تركيب يرقه واحده فقط في الشعيرات الشعرية.
  7. عندما يتم الانتهاء من التصوير طرد اليرقات من تصاعد الشعرية إلى جرعه زائده مميته من 4 ٪ MS222 إلى موت ببطء.

5. اليوم 3: اختيار اليرقات لفحص الحركة في 72 hpf

  1. تخدير اليرقات في اطباق بتري مع 0.02 ٪ MS222.
  2. حدد عشوائيا n = 24 يرقه لفحص الحركة ونقلها إلى وسائط E3 الجديدة والسماح للحيوانات بالتعافي من التخدير.
    ملاحظه: التخدير عند هذه النقطة يزيل التحيز الاختيار للسباحين بطيئه التي هي سهله للقبض.

6. اليوم 3-5: الحركة الحركية في 72 ، 96 و 120 hpf

  1. نقل اليرقات المختارة في 72 hpf إلى المتوسطة E3 دون الميثيلين الأزرق.
    ملاحظه: لتهدئه في 3 dpf تسمح اليرقات متسع من الوقت للتعافي من التخدير (> 1 ح).
  2. لوحه واحده اليرقة في 1 مل لكل بئر من لوحه 24 بئر باستخدام ماصه.
    ملاحظه: اقطع نهاية طرف الماصة لتجنب اتلاف اليرقات. يمكن تغيير حجم اللوحة وفقا للتصميم التجريبي.
  3. تحميل لوحات في غرفه الكاميرا والحركة المقايسة لمده 10 دقيقه باستخدام روتين الضوء الأبيض باغت لزيادة السباحة العفوية.
    ملاحظه: تم تعقب سلوك السباحة باستخدام غرفه الكاميرا وتتبع البرمجيات (انظر جدول المواد).
  4. كرر التجربة مع نفس اليرقات في 96 و 120 hpf. نقل اليرقات من المساكن الفردية في لوحه الفحص إلى طبق بيتري واحتضان في 28 درجه مئوية بين المقايسات.
  5. عند الانتهاء من الفحص ، موت ببطء اليرقات في جرعه زائده مميته بنسبه 4% MS222.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تقييم وفاه خلايا المخ باستخدام اوبيفالمحورة وراثيا: النتائج في مجموعات واضحة من الخلايا المحتضرة في اليرقات ich + في كل من النماذج ATV و bbh التي تغيب في جميع اليرقات-الشكل 3. التكتلات تنحسر قبل 96 hpf. من خلال تحليل الصورة ، يرتبط النزيف مع زيادة كبيره مرتين في كثافة إجمالي الاشاره الفلورية في الدماغ ، مما يشير إلى موت الخلايا ملحوظ.

يتم تحديد استجابه التهابات العصبية في اليرقات ICH + من خلال زيادة كبيره في عدد خلايا الضامة mpeg1 ايجابيه في الدماغ. زاد الرقم من إجماليه [ مبو ] ايجابيه [العدلات] خلايا أيضا مهما هذا لم يبلغ دلاله احصائيه (شكل 4). ويمكن أيضا ان ينظر إلى مورفولوجية الضامة الايجابيه mpeg1 لتغيير في التراث الICH + اليرقات كما تعتمد الخلايا النشطة, مدوره, شكل اموهبويد. ويمكن أيضا رصد هذه الخلايا المدورة المنشطة مع مرور الوقت لإظهار استجابه متزايدة من الخلايا الصباغية لل اوبيف:secannexinv-mvenus التي تعبر عن خليه الموت في اليرقات ICH + (الشكل 5). mpeg1 الضامة ايجابيه عرض العمليات التي تم تصنيفها بأنها غير نشطه.

ويرتبط نزيف الدماغ مع انخفاض كبير في الحركة في 72 و 96 hpf بالمقارنة مع التراث الخاص-الاخوه الضوابط في كل من bbh ونماذج ATV (الشكل 6). الحركة في 120 hpf يتعافى إلى مستويات خط الأساس بالقرب. وغالبا ما تكون هناك اختلافات في الحركة الاساسيه بين براثن البيض والسلالات التالي ينبغي اجراء مقارنه لضوابط ICH في كل مره.

figure-results-1
الشكل 3 النزف داخل اليرقات ينتج عنه أصابه دماغيه قابله للقياس الكمي.: (ا) الصور التمثيلية للاصابه بالنمط الظاهري لإصابات المخ في اليرقات ich + (ألواح اليمني) ، بالمقارنة مع التراث الوراثي-الاشقاء (ألواح اليسرى) ، في 72 hpf. الصور برايت فيلد (ألواح السفلية ، شريط مقياس = 250 μm) تظهر وجود نزيف في الدماغ (السهام) في التراث الICH + اليرقات. تم اجراء المجهر الفلورسنت لتصور موت الخلية في اوبيف:الخط المراسل-mvenus المراسلة (اعلي اللوحات ، شريط مقياس = 100 μm). ولوحظت مجموعات من الخلايا المحتضرة في مناطق شبه الهيماتوال. تم اقتصاص الصور إلى مناطق الدماغ فقط وتحليلها لكثافة الفلورية الخضراء الاجماليه في جزيئات مستديرة أكبر من 30 بكسل في القطر (الخط الأبيض) باستخدام الماكرو في الملف التكميلي 1. (ب) القياس الكمي للاشاره الفلورية في أدمغه اليرقات غير المعالجة ، والتراث الich-والتراث الich المكتسب من خلال نموذج ATV (ن = 12 لكل مجموعه ؛ 3 نسخ متماثلة مستقله) في 72 hpf. ولوحظت اختلافات كبيره عند مقارنه التراث الكتروني غير المعالج بالغير دون علاج (* * p = 0.004) ومع الاشقاء (* p = 0.03). (ج) القياس الكمي للاشاره الفلورية كقراءه لربط الملحق في عقول اليرقات التي تم الحصول عليها من خلال نموذج الراس الزاهي (ن = 12 لكل مجموعه ؛ 2 نسخ متماثلة مستقله) في 72 hpf. تظهر الرسوم البيانية SD من الوسط. ولوحظ وجود فرق كبير في الفلورية mVenus بين التراث العام ICH + و ICH-الاخوه المتطابقة العمر (* * p = 0.002). وقد استنسخ الرقم من Crilly وآخرون20 مع الاذن ببموجب رخصه المشاع الإبداعي. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

figure-results-2
الشكل 4 : النزف داخل المخ (ICH) يبدا استجابه مناعية فطريه الخلوية في الدماغ اليرقات الزرد. عدد الكريات البيضاء الكمية داخل مناطق المخ الموصوفة سابقا لبرنامج mpo: GFP ؛ mpeg1: اليرقات المعدلة وراثيا المزدوجة (n = 8 لكل مجموعه; 2 متماثلة مستقله) في 72 hpf يكشف عن زيادة كبيره في الضامة (* p = 0.01) ، ولكن ليس العدلات (ع = 0.5) ، ردا علي التراث الICH. وقد استنسخ الرقم من Crilly وآخرون20 مع الاذن ببموجب رخصه المشاع الإبداعي. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم. 

figure-results-3
الشكل 5 : خلايا الضامة المنشطة تظهر استجابه الخلية لافه المخ. (ا) اللقطات الفاصلة الزمنيه التمثيلية20 التي تبين ان الدوريات التي تجوب الضامة تهاجر نحو خليه ايجابيه تابعه لمرفق الاستثمار العام (أولا-سادسا). يتم الحصول علي اللقطات من سلسله من الصور الماخوذه من الدماغ كله باستخدام هدف 20x. شريط مقياس يمثل 50 μm. وقد حصلت الضامة علي التشكل الأميبا (v) قبل الخلية الموجبة للاستثمار الملحق (vi ، vii). بعد كثرة الخلايا الضامة يستانف التشكل المورفولوجية ويهاجر بعيدا والخلية الموجبة للاستثمار الملحق لا يمكن ان ينظر اليه بعد الآن (viii). الضامة رافيد (#) ، الملحق الخلية الموجبة (السهم) ، ويشار إلى الضامة الأميبا (*). (ب) الصور التمثيلية للخلايا الايجابيه لmpeg1في الدماغ الخاصة بالتراث الخاص والتراث الذي يظهر الأميبا والمتحولة. وتمثل قضبان المقياس 50 ميكرومتر. (ج) لوحظت نسبه متزايدة من الضامة (البالعة) ونسبه متناقصة (غير نشطه) في أدمغه التراث الich والعقلي بالمقارنة مع الاشقاء. وقد استنسخ الرقم من Crilly وآخرون20 مع الاذن ببموجب رخصه المشاع الإبداعي. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم. 

figure-results-4
الشكل 6 : ينتج عن إصابات الدماغ الناجمة عن التراث الايرلندي عجز حركي قابل للقياس الكمي في يرقات الزيبرافيش. (ا) أمثله تمثيليه لمسارات السباحة في يرقات التراث الich-والتراث الich + bbh في 72 ، 96 و 120 hpf. (ب) وقد أظهرت اليرقات + التراث العام انخفاضا كبيرا في الوقت التراكمي المستغرق في التنقل خلال فتره التسجيل البالغة 10 دقائق في كل من 72 و 96 hpf. وقد ضاعت الاهميه عند نقطه التوقيت hpf 120 التي يحتمل ان تلمح إلى التعافي من أصابه المخ (ن = 24 يرقه لكل مجموعه ؛ 3 نسخ متماثلة مستقله ؛ * * * * p = 0.00006 ؛ * * p = 0.003 ؛ ns: p = 0.08). (ج) القياس الكمي للوقت التراكمي المستغرق في التحرك في اليرقات غير المعالجة والمعالجة بمركبات النقل المؤتمتة-والتراث الich + غير المعالج في 120 hpf. وقد أظهرت اليرقات + ICH انخفاضا كبيرا في الوقت التراكمي المستغرق في التنقل خلال فتره التسجيل البالغة 10 دقائق. وقد استخدمت ثلاثه نسخ متماثلة التقنية (ن = 24 يرقات لكل مجموعه) لحساب SD من متوسط (* * * p = 0.00004 ، * * p = 0.0003). وقد استنسخ الرقم من Crilly وآخرون20 مع الاذن ببموجب رخصه المشاع الإبداعي. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم. 

الملف التكميلي 1. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وتبين هذه الدراسة ان التراث الخاص في اليرقات الزكية يحفز علي الاستجابة لإصابات المخ التي تلخص الجوانب الرئيسية للحالة الانسانيه التي يمكن التعرض لها بانتظام وتحديدها كميا. تقدم zebrafish نموذجا متسقا وقابلا للتكرار من التراث الذاتي العفوي الذي سيساعد في المستقبل دراسات التدخل المخدرات التي تركز علي استهداف أصابه الدماغ الناجم عن الدم ، بدلا من منع تمزق السفينة17،28. وفي الواقع ، النظر إلى الطبيعة السريعة للمرض الذي يشبه الحالة السريرية ، فان هذا النهج يوفر أفاقا مثيره للنجاح في الترجمة في المستقبل.

وترتبط بعض القيود باستخدام اليرقات الزبرده ، مثل استخدام النظام النامي والتصنيف التصنيفي ، ولكن يجب النظر إلى المزايا العملية والعلمية لهذا النموذج لتقديم رؤى جديده في التراث الكتروني غير الملموس. لا يلزم اجراء اي عمليه جراحيه لبدء نزيف أو لمراقبه العمليات الخلوية علي مدي فترات طويلة من الوقت بعد الاصابه. الخصوبة العالية من الأزواج الزرد توليد بسهوله الوصول اليها واحجام العينات الكبيرة ، وبسبب التطور السريع لليرقات يتم تخفيض الجدول الزمني التجريبي بشكل كبير بالمقارنة مع الدراسات القوارض29،30.

حاليا هذه النماذج هي مناسبه لاستخدامها لتوضيح الاستجابة المرضية والمناعية الفورية لل ICH التلقائي في الدماغ من الكائنات الحية سليمه. يحتمل ، يمكن تكييف هذا النموذج لشاشات المخدرات متوسطه الانتاجيه لعلاجات التراث الضار ، سواء الوقائية أو الانتعاش تعزيز. وعلي هذا النحو ، تمثل امراض ما بعد التراث المذكور المعروضة في هذه الدراسة منصة بديله تكميليه للبحوث المتعلقة بالتراث السابق لسريري.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وليس لدي المؤلفين ما يفصحون عنه.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نود ان نشكر الدكتور ديفيد سبلر وجامعه مانشستر نظم المجهر المجهري الاساسيه لاستخدام المعدات ، البروفيسور ريتشارد بينز لاستخدام DanioVision والدكتور جاك ريفرز-Auty للتشاور الإحصائي. تمت مشاركه الخط bbh من قبل نيكول Munsie من مختبر الدكتور ساره الطفل في جامعه كالغاري. ونشكر أيضا البروفيسور ستيفن رينشاو ، والدكتور ادم هورستون ، والدكتور اندرو بادروك ، والدكتورة هيلين يونغ لخطوط ومعدات الأسماك.

وكانت هذه الدراسة مدعومة من NC3Rs (NC/N002598/1) ، ورابطه السكتة الدماغية (TSA LECT 2017/02) ، والخلايا العصبية الصافية في العصر (MR/M501803/1) ومؤسسه القلب البريطانية (FS/15/67/32038). كما اننا نشكر بشكل خاص الثقة ناتالي كيت موس وجامعه مانشستر كليه البيولوجيا والطب والصحة لدعمهم المالي المستمر.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
24 لوحة بئرسيجما ألدريتشCLS3527
28 درجة ؛ حاضنة CLMS210
AtorvastatinSigma-AldrichPZ0001-5mg
صناديق التربيةأنظمة Thoren Aquatics10011
غرفة مراقبة DaniovisionNoldusn / a
E3 متوسطة 1x4٪ محيط فوري ، 500 وميكرو ؛ L الميثيلين الأزرق في 1 لتر dH 2 < / sub >O
برنامج EthoVision XTNoldusالإصدار 11
كتلة الحرارةGrant-BioPHMT-PSC18
المحيط الفوريالمحيطالفوري SS15-10
مجهر LightsheetZeissZ.1
مجهر Lightsheet تصاعد الشعيرات الدمويةZeiss402100-9320-000
مجهر منخفض الذوبان من agarosePromegaV2111
Methylene BlueSigma-Aldrich319112-100ML
مجهر مجهر تشريح LeicaMZ95
مجهرLeicaM165FCمجهر الفلورسنت
MS2224g مسحوق tricaine ، 500 مل من dH2< / sub>O ، 10 مل من 1 M Tris (الرقم الهيدروجيني 9). اضبط الرقم الهيدروجيني على ~ 7
P1000 ماصةجيلسونF144059M
أطراف ماصة P1000StarlabS1122-1830
ماصات باستورStarlabE1414-0300
أطباق بتري   ؛Corning101VR20
PipetboyIntegra BiosciencesPIPETBOY
Stripette 25 ملCorningCLS3527
مسحوق التريكايينSigma-AldrichA5040-25G
Tris BaseFisher BioReagentsBP152-1
ملقط تشريح فائق الدقةAgar ScientificAGT502
برنامج ZenZeissالإصدار 2.3

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. An, S. J., Kim, T. J., Epidemiology Yoon, B. W. Epidemiology, risk factors, and clinical features of intracerebral hemorrhage: an update. Journal of stroke. 19 (1), 3(2017).
  2. WHO. The top 10 causes of death. , http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs310/en/ (2017).
  3. Casals, J. B. The use of animal models for stroke research: a review. Comparative medicine. 61 (4), 305-313 (2011).
  4. Kellner, C. P., Connolly, E. S. Neuroprotective Strategies for Intracerebral Hemorrhage Trials and Translation. Stroke. 41 (10 Suppl 1), S99-S102 (2010).
  5. Kirkman, M. A., Allan, S. M., Parry-Jones, A. R. Experimental intracerebral hemorrhage: avoiding pitfalls in translational research. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 31 (11), 2135-2151 (2011).
  6. ASPA. 1986 amendments. , (2012).
  7. Butler, M. G., Gore, A. V., Weinstein, B. M. Methods in cell biology. 105, Elsevier. 137-161 (2011).
  8. Walcott, B. P., Peterson, R. T. Zebrafish models of cerebrovascular disease. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 34 (4), 571-577 (2014).
  9. Liu, C. Macrophages mediate the repair of brain vascular rupture through direct physical adhesion and mechanical traction. Immunity. 44 (5), 1162-1176 (2016).
  10. Kasher, P. R. Characterization of samhd1 morphant zebrafish recapitulates features of the human type I interferonopathy Aicardi-Goutieres syndrome. The Journal of Immunology. 194 (6), 2819-2825 (2015).
  11. Wen, J. Mutation of rnf213a by TALEN causes abnormal angiogenesis and circulation defects in zebrafish. Brain research. 1644, 70-78 (2016).
  12. Eisa-Beygi, S., Rezaei, M. Etiology of intracerebral hemorrhage (ICH): novel insights from Zebrafish embryos. International Journal of Developmental Biology. 60 (4-5-6), 119-126 (2016).
  13. Mracsko, E., Veltkamp, R. Neuroinflammation after intracerebral hemorrhage. Frontiers in cellular neuroscience. 8, 388(2014).
  14. Eisa-Beygi, S., Hatch, G., Noble, S., Ekker, M., Moon, T. W. The 3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA reductase (HMGCR) pathway regulates developmental cerebral-vascular stability via prenylation-dependent signalling pathway. Developmental biology. 373 (2), 258-266 (2013).
  15. Shen, M. Discovery of Rho-kinase inhibitors by docking-based virtual screening. Molecular BioSystems. 9 (6), 1511-1521 (2013).
  16. Huang, B. Tanshinone I prevents atorvastatin-induced cerebral hemorrhage in zebrafish and stabilizes endothelial cell-cell adhesion by inhibiting VE-cadherin internalization and actin-myosin contractility. Pharmacological research. , (2017).
  17. Li, S. Discovery of a ROCK inhibitor, FPND, which prevents cerebral hemorrhage through maintaining vascular integrity by interference with VE-cadherin. Cell death discovery. 3, 17051(2017).
  18. Liu, J. A βPix-Pak2a signaling pathway regulates cerebral vascular stability in zebrafish. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (35), 13990-13995 (2007).
  19. ten Klooster, P. J., Jaffer, Z. M., Chernoff, J., Hordijk, P. L. Targeting and activation of Rac1 are mediated by the exchange factor β-Pix. The Journal of cell biology. 172 (5), 759-769 (2006).
  20. Crilly, S. Using zebrafish larval models to study brain injury, locomotor and neuroinflammatory outcomes following intracerebral haemorrhage. F1000Research. 7, (2018).
  21. Westerfield, M. The zebrafish book: a guide for the laboratory use of zebrafish. , http://zfin.org/zf_info/zfbook/zfbk.html (2000).
  22. Ellett, F., Pase, L., Hayman, J. W., Andrianopoulos, A., Lieschke, G. J. mpeg1 promoter transgenes direct macrophage-lineage expression in zebrafish. Blood. 117 (4), e49-e56 (2011).
  23. Renshaw, S. A. A transgenic zebrafish model of neutrophilic inflammation. Blood. 108 (13), 3976-3978 (2006).
  24. Traver, D. Transplantation and in vivo imaging of multilineage engraftment in zebrafish bloodless mutants. Nature immunology. 4 (12), 1238(2003).
  25. Morsch, M. In vivo characterization of microglial engulfment of dying neurons in the zebrafish spinal cord. Frontiers in cellular neuroscience. 9, (2015).
  26. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Developmental dynamics. 203 (3), 253-310 (1995).
  27. Liang, J. O. Zebrafish in the Classroom. , http://www.zfic.org (2011).
  28. Yang, R. Miconazole protects blood vessels from MMP9-dependent rupture and hemorrhage. Disease Models & Mechanisms. 10 (3), 337-348 (2017).
  29. Andaluz, N., Zuccarello, M., Wagner, K. R. Experimental animal models of intracerebral hemorrhage. Neurosurgery Clinics of North America. 13 (3), 385-393 (2002).
  30. Rosenberg, G. A., Mun-Bryce, S., Wesley, M., Kornfeld, M. Collagenase-induced intracerebral hemorrhage in rats. Stroke. 21 (5), 801-807 (1990).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Zebrafish LarvaeHemorrhagic StrokeIntracerebral HemorrhageLive ImagingMotility AssayBrain HemorrhageNeuroinflammationFluorescent MicroscopyAtorvastatin TreatmentEthoVision XT

Related Articles