مقالة منهجية

حقن Gryllus بيماكولاتوس البيض

DOI:

10.3791/59726

⸱

أغسطس 22, 2019

 ,  ,  ,  ,  , 
1Colby College, 2Division of Evolutionary Developmental Biology, National Institute for Basic Biology, 3Department of Biological Sciences, National University of Singapore, 4Department Biology and Department of Neuroscience, Bowdoin College, 5Department of Organismic and Evolutionary Biology and Department of Molecular and Cellular Biology, Harvard University

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا نقدم بروتوكول لحقن بيض الكريكيت، وهي تقنية التي تعمل كطريقة تأسيسية في العديد من التجارب في الكريكيت، بما في ذلك، على سبيل المثال لا الحصر، تدخل الحمض النووي الريبي والتلاعب الجينومي.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تغيير وظيفة الجينات في كائن حي النامية أمر أساسي لأنواع مختلفة من التجارب. في حين تم تطوير أدوات وراثية قوية للغاية في أنظمة النماذج التقليدية، فإنه من الصعب التعامل مع الجينات أو رسول RNA (mRNA) في معظم الكائنات الحية الأخرى. وفي الوقت نفسه، تعتمد النُهج التطورية والمقارنة على استكشاف وظيفة الجينات في العديد من الأنواع المختلفة، مما يستلزم تطوير وتكييف تقنيات التلاعب بالتعبير خارج نطاق الحشرات حالياً. الانواع. يصف هذا البروتوكول طريقة لحقن الكواشف في بيض الكريكيت لاختبار آثار التلاعب معين على التنمية الجنينية أو اليرقات. يتم وصف تعليمات حول كيفية جمع وحقن البيض مع الإبر البكرة. هذه التقنية واضحة نسبيا مرنة ويمكن أن تتكيف مع الحشرات الأخرى. يمكن للمرء جمع وحقن العشرات من البيض في تجربة واحدة، ومعدلات البقاء على قيد الحياة لحقن العازلة فقط تحسين مع الممارسة ويمكن أن تكون عالية كما 80٪. هذه التقنية سوف تدعم عدة أنواع من النهج التجريبية بما في ذلك حقن العوامل الدوائية، في المختبر توج mRNA للتعبير عن الجينات ذات الاهتمام، RNA المزدوج الذين تقطعت بهم السبل (dsRNA) لتحقيق تدخل الحمض النووي الريبي، واستخدام مجمعة بانتظام يُكرّر البَرَدّم القصير المُتداخل (CRISPR) بالتنسيق مع الكواشف المرتبطة بالبروتين 9 (Cas9) المرتبطة بـ CRISPR لتعديل الجينوم، والعناصر القابلة للتبديل لتوليد خطوط جينية عابرة أو مستقرة.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

القدرة على تعديل الجينوم أو التأثير على التعبير الجيني في الكائنات الحية هو الأساس لتصميم أنواع كثيرة من التجارب اختبار السببية الوظيفية. ومن الأهمية بمكان أيضاً بالنسبة للعمل المقارن والتطوري ذي الصلة أن تكون تقنيات التعديل الجينومي وغير الجينومي متاحة في الكائنات الحية خارج النظم التقليدية النموذجية للمختبرات الوراثية الحيوانية (مثل موسوكولوس، ودانيو rerio, Drosophila melanogaster, وCaenorhabditis elegans). سواء كانت الرغبة في فهم التنوع الحي1 أو التزام المرء بمبدأ كروغ، أنه لكل سؤال بيولوجي هناك كائن أكثر ملاءمة لحلها 2،3،والقدرة على تعديل الجينوم أو التأثير على التعبير الجيني ضروري للتصاميم التجريبية الحديثة.

الكريكيت Gryllus bimaculatus هو نظام نموذج الناشئة. تستخدم في القرن الماضي في تجارب علم الأعصاب4، شهد العقدان الماضيان اهتماما تجريبيا متزايدا في الكريكيت ، وخاصة ركزت على تطور وتطور هذا الكائنالحي 5. الكريكيت هو حشرة هيمتابولوس التي تتفرع بشكل خاص إلى الحشرات الهولوميتابولوس مدروسة جيدا، مثل D. melanogaster وTribolium castaneum6. نظرا لموقعها المفيد على شجرة التطور ، والعلماء مهتمون في طرح الأسئلة التجريبية الحديثة والمتطورة في هذه الحشرة ، مما أدى إلى اهتمام متزايد في تكييف الأدوات الجزيئية للاستخدام في G. bimaculatus.

ويمكن استخدام حقن الكواشف الجزيئية في بيض الكريكيت لتجارب التعديل الجينومي وكذلك التلاعب اتلاف التعبير الجيني في الأجنة. على سبيل المثال، تم إنشاء المعدلة وراثيا G. bimaculatus تحمل الإدراج eGFP باستخدام piggyBactransposase7،8. وقد نجح المحققون في إنشاء ضربة قاضية G. bimaculatus باستخدام nucleases الزنك الإصبع (ZFNs) والنسخ المنشط مثل (TAL) تأثير nucleases (TALENs) لإدخال فواصل مزدوجة الذين تقطعت بهم السبل في مناطق جينية محددة9. على الرغم من أن ZFNs وTALENs تسمح باستهداف مواقع محددة في الحيوانات خارج الأنظمة النموذجية الأربعة الكبيرة، إلا أن هذه الكواشف قد تم تجاوزها بسرعة من خلال نظام CRISPR/Cas9، الذي هو أبسط للاستخدام، وأكثر كفاءة، ومرنة للغاية10. وقد استخدم كريسبر في G. bimaculatus لإنتاج خروج المغلوب11 وكذلك ضرب في خطوط12،13 بالإضافة إلى تعديل الجينوم ، يمكن حقن dsRNA في البيض لهدم التعبير mRNA في تطوير الأجنة، مما يسمح للمحققين لفهم دور نسخ محددة في جميع أنحاء التنمية14،15. وقد نشرت بعض التفاصيل المحدودة حول كيفية حقن بيض الكريكيت سابقا12.

هنا، ونحن نصف بروتوكول مفصل لحقن البيض في وقت مبكر G. bimaculatus. هذا البروتوكول فعال وقابل للتكيف بسهولة مع مختلف البيئات المختبرية، ومواد الحقن، وربما مع الحشرات الأخرى. في حين تم نشر تفاصيل إضافية لتصميم وتنفيذ التعديل الجيني والتجارب ضربة قاضية في مكان آخر12,13, هذه النهج سوف تعتمد في نهاية المطاف على بروتوكول الحقن مفصلة هنا.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. إعداد الأجهزة وإعداد المواد

ملاحظة: يرجى الاطلاع على الجدول 1 وجدول المواد لإعداد الحلول والكاشف وتفاصيل المعدات.

  1. إعداد مجهر تشريح من أجل رؤية البيض وتوجيه إبرة الحقن. (الشكل1A يظهر مجهر تشريح مجهزة الفلورة.) القدرة على الفلورة مفيدة ولكنليس ضرورية.
  2. وضع 3 محور micromanipulator للمناورة إبرة الحقن في مكان (الشكل1A).
  3. إعداد محقن صغير مع الأنابيب وحامل إبرة لحقن كميات صغيرة من المواد (الشكل1A). اختياريا استخدام دواسة القدم التي لا تظهر في الشكل.
  4. تصميم وإنشاء ختم لإنشاء آبار للبيض (الشكل1C)عن طريق طباعة معكوس النمط المطلوب، إما مع طابعة 3D أو حفارة ليزر.
    ملاحظة: الطابع المطبوع ثلاثي الأبعاد هو 4.5 سم × 5 سم مع 128، 3 سم × 1 سم × 1 مم نتوءات لإنشاء آبار فردية. وقد نشرت تفاصيل حول كيفية جعل مجموعة متنوعة من قوالب للتخصيص في مكان آخر16.
  5. إعداد 10X حقن العازلة، HEPES المخزنة المالحة (HBS)، ومحلول مخزون من صبغ ة تيتراميثيلرودامين Dextran وتخزينها في 4 درجة مئوية.
  6. إعداد الحلول التجريبية ليتم حقنها، مثل dsRNA، CRISPR / Cas912، عناصر قابلة للنقل، في المختبر توج mRNA7،8، وكلاء الدوائية17، ZFNs ، أو TALENS9.
  7. وضع الشريط المزدوج عصا على عدة طبقات من شريط المختبر القياسية على شريحة المجهر الزجاجي من أجل إنشاء منصة 1 ملم أو نحو ذلك فوق الشريحة الزجاجية، والتي سيتم استخدامها لعقد الإبر للتقييم.
  8. إعداد حاوية الكريكيت ما يقرب من 40 سم × 60 سم في الحجم مع غطاء تمتلك فتحة شبكة مغطاة لدوران الهواء.
  9. إضافة المواد الغذائية والمياه والمأوى.
  10. إضافة عدة عشرات من صحة الذكور والإناث الكريكيت الكبار. تحديد الكريكيت الكبار من خلال وجود أجنحة.
    ملاحظة: قد تزيد مجموعة من الأعمار ما بعد التخيلي من غلة البيض. وينبغي أن تكون كثافة الصراصير عالية نسبيا من أجل أن تكون قادرة على جمع ما يكفي من البيض لتجربة، ولكن ليس مزدحمة بحيث يحدث أكل لحوم البشر. على سبيل المثال، حوالي عشرين لعبة الكريكيت صحية، مع نسبة متساوية تقريبا من الذكور إلى الإناث، في حاوية من الحجم المذكور أعلاه ينبغي أن تكون كافية لجمع حوالي 200 بيضة في فترة 1-2 ساعة. يمكن الاحتفاظ بالصراصير في درجة حرارة الغرفة، ولكن التطوير والسلوك سيكونان مثاليين إذا تم الحفاظ على الصراصير في حاضنة رطوبة دافئة (23.5-26 درجة مئوية)، رطبة (40-60٪ رطوبة نسبية).

2. صنع الإبر للحقن

  1. استخدام الشعيرات الدموية الزجاج البورسليكات مع خيوط (انظر جدول المواد للحصول على تفاصيل الحجم). إعداد إبر السحب في نفس اليوم، أو ما يصل إلى بضعة أيام قبل الانتهاء من الحقن.
  2. وضع الزجاج الشعرية في الساحبة، ومركز الزجاج على خيوط، وتشديد المقابض لتأمين الزجاج في المكان.
  3. تعيين درجة حرارة الساحبة بالقرب من درجة حرارة منحدر الزجاج (-5 درجة مئوية إلى +10 درجة مئوية).
  4. استخدام خطوة واحدة، بروتوكول عالية الحرارة لسحب تفتق طويلة مع فتحة صغيرة ولكن تجنب ذوبان نهايات مغلقة.
    ملاحظة: على سبيل المثال، عند استخدام سحب micropipette مفصلة في جدول المواد المجهزة بخيوط مربع، استخدم المعلمات التالية للزجاج مع درجة حرارة منحدر من 478: الحرارة 478؛ سحب 45; Vel 75; ديل 120 وينبغي أن يحدد كل مستخدم الظروف المثلى لإنتاج إبرة مع الشكل المبين في الشكل 2B.
  5. نصائح إبرة شطبة في التحضير للحقن.
  6. الرطب الطائرة طاحونة الغزل من beveler (الشكل2A)مع الماء نازف. استخدم إما التناضح العكسي (RO) أو ثنائي إيثيل بيروكربونات (DEPC) المعالجة بالماء المقطر.
  7. ضع الإبرة المسحوبة في البفيلر وأنتقل إلى زاوية 20 درجة.
  8. خفض الإبرة حتى انها مجرد اللمسات على طائرة طحن وشطبة لمدة 2-3 دقائق.
  9. تقييم شطبة عن طريق وضع إبرة مشطوف على الشريط المزدوج العصا التي تم الالتزام بها إلى شريحة المجهر الزجاجي.
  10. وضع الشريحة عقد الإبرة على خشبة المسرح من المجهر مركب مجهزة كاميرا وصورة الحصول على البرمجيات.
  11. الحصول على صورة من طرف إبرة باستخدام هدف 20X.
  12. استخدام برنامج التصوير لقياس قطر التجويف الداخلية من الإبرة فقط قريب من فتح مجدول (الشكل2C). الحجم الأمثل هو 10 ميكرومتر + 2 ميكرومتر.
  13. تجاهل الإبر التي تحتوي على فتحة أقل من 8 ميكرومتر وأكثر من 12 ميكرومتر.
  14. تخزين الإبر في حاوية مع غطاء لتجنب الحصول على مغبرة. استخدام شريط من الشمع أو مواد مماثلة لرفع الإبر من الجزء السفلي من الحاوية لمنع كسر النصائح (الشكل2D).

3. جمع البيض وإعداده

  1. تعظيم عدد البيض وضعت عن طريق حرمان الصراصير من أي مواد زرع رطبة (قارورة المياه، أطباق البيض) بين عشية وضحاها أو لمدة 8-10 ساعة على الأقل قبل محاولة جمع البيض.
    ملاحظة: وبما أن الإناث لديهن القدرة على تخزين الحيوانات المنوية داخلياً، فقد يكون من الضروري إجراء ً او توقيتمختلف إذا كان الإخصاب في الوقت المناسب ضروريًا تجريبيًا18.
  2. جعل 40 مل من 1٪ أغاروز في الماء وتصب في طبق بيتري 10 سم.
  3. وضع ختم البيض جيدا على سطح أجاروز قبل أن يترسخ.
  4. إزالة الطابع، بمجرد أن يتم تقوية أغاروز، للكشف عن الآبار (الشكل1C).
  5. ملء لوحة الأوجاروز جيدا مع HBS التي تحتوي على 1٪ البنسلين / العقديات.
  6. ضع الغطاء على الطبق، ولف في بارافيلم وتخزينه او تخزينه عند درجة حرارة 4 درجات مئوية.
    ملاحظة: يمكن تخزين الأطباق لبضعة أيام عند درجة حرارة 4 درجة مئوية ولكن يجب تسخينها حتى درجة حرارة الغرفة قبل استخدامها لتجنب التكثيف.
  7. جعل طبق جمع البيض للصراصير لوضع البيض في عن طريق ملء طبق بيتري 35 ملم مع الرمال ملعب أبيض (الشكل1B).
    ملاحظة: والمساحة المحددة في جدول المواد هي من حجم الحبوب المناسب. إذا كانت الحبوب والحبوب والحبوب كبيرة جدا، فإن الجبن يضر البيض.
  8. يُغطّى طبق البيض بمربع من المنشفة الورقية المقطّع إلى حوالي 18 سم × 18 سم، ويُوضع على الجزء العلوي من الطبق مع الأنفيل. من خلال هذه المنشفة الورقية تغطية طبق مليئة مع مياه الصنبور.
  9. إمالة طبق بيتري وضغط بلطف الجزء العلوي لإزالة المياه الزائدة.
  10. الثنية زوايا مربع منشفة ورقية تحت الطبق ووضع طبق البيض في غطاء مقلوب، والتي سوف تساعد على الحفاظ على غطاء منشفة ورقية في مكانها.
  11. وضع طبق البيض في سلة الكريكيت والسماح للإناث البالغات بيض oviposit لمدة 1-2 ح.
    ملاحظة: الوقت القصير نسبيا هنا يضمن أن جميع البيض سوف تكون مماثلة في مرحلة التنمية في وقت الحقن. إذا كان الحقن قبل الخلوية مهم، يجب أن تحدث الحقن في غضون 14 ساعة من وضع البيض19.
  12. وفي الوقت نفسه، اسمح واجاروز طبق (من الخطوة 3.6) لتدفئة إلى درجة حرارة الغرفة استعدادا لعقد البيض للحقن.
  13. إزالة طبق جمع البيض، التي تحتوي الآن على البيض وضعت حديثا، من سلة الكريكيت، وإزالة غطاء منشفة ورقية. وضع مصفاة بحجم مسام من 0.5-1 مم على كوب لا يقل عن 500 مل (الشكل1B).
  14. شطف محتويات طبق وضع البيض (والأخضر والبيض) في مصفاة تحت مياه الصنبور تشغيل بلطف السماح للحبوب والمياه من خلال قشرة تقع من خلال شبكة مصفاة في الماء في الكأس أدناه ولكن ترك بيض الكريكيت في سلة مصفاة.
  15. ملء وعاء مع ماء ريال عماني ووضعها في صينية. عكس مصفاة فوق الحاوية والاستفادة من ذلك ضد الطبق لطرد البيض في الماء. سوف تغرق البيض إلى الجزء السفلي من الحاوية.
  16. قطع غيض قبالة طرف ماصة P1000 مع مقص لجعل فتح ما يقرب من 3 ملم في القطر. ضع هذا الطرف على أنبوب P1000 واستخدمه لنقل البيض من الحاوية إلى طبق قالب بيض ة أغاروز، ونقل أقل قدر ممكن من الماء.
  17. استخدام ملاقط بلاستيكية لاصطفا البيض في آبار أجاروز مليئة HBS بالإضافة إلى 1٪ البنسلين / العقديات. كل بيضة سوف تغرق في الجزء السفلي من بئر الفردية. يُغطّى المزيج بغطاء طبق بيتري حتى يصبح جاهزاً للحقن.

4. إعداد الحاقن الصغير

  1. إرفاق الحاقن الصغير بالهواء المضغوط أو مصدر الغاز (تم تحسين هذا البروتوكولباستخدام الهواء المضغوط أو N 2).
    ملاحظة: إذا كنت تستخدم خزان هواء محمول، قم بتعبئة ما لا يقل عن 75 رطل لكل بوصة مربعة. سوف تفقد الدبابة ضغط الهواء في جميع أنحاء الحقن، وقد تحتاج إلى إعادة تعبئتها. حقن تصبح صعبة أقل من 40psi.
  2. قم بتشغيل الحاقن الدقيق. تعيين وقت الحقن إلى 0.17 s والضغط إلى 10-15 رطل لكل بوصة مربعة.
    ملاحظة: الضغط الدقيق المطلوب سوف يعتمد على فتح الإبرة ويجب تحديدتجريبيا لكل جولة من الحقن و / أو إبرة جديدة تستخدم.
  3. تأكد من أن مقبض التوازن من الحاقن الصغير يتم تحويلها إلى 0 (عادة عكس اتجاه عقارب الساعة تماما) وأن يتم الضغط على الحاقن الصغير وفي وضع الحقن.

5. الحقن

  1. تصفية حوالي 500 درجة مئوية من 10X حقن العازلة باستخدام حقنة 1 مل وفلتر حقنة 0.45 م.
  2. الكواشف حقن مزيج (التفاصيل التالية هي لحقن dsRNA أعدت كما هو موضح في12).
    ملاحظة: قد يكون من المستحسن تصميم وتنفيذ العديد من الضوابط، وخاصة عندما يكون المرء هو أول تعلم هذه التقنية. بدس البيض دون حقن، حقن العازلة + صبغ وحدها، أو حقن العازلة + صبغ + كاشف التحكم (مثل eGFP dsRNA) كلها اختبارات جيدة لكيفية العناصر المختلفة التخريبية من بروتوكول الحقن قد يكون. انظر الشكل 3 للاطلاع على إمكانية بقاء عدد من عناصر التحكم المختلفة.
  3. تبدأ مع 4 مل dsRNA aliquot.
  4. إضافة 0.5 مل من المخزن المؤقت حقن 10x تمت تصفيتها إلى aliquot dsRNA.
  5. إضافة 0.5 مل من 50 ملغ / مل تيتراميثيل رودامين Dextran صبغ الأوراق المالية الحل. إذا كان العمل على نطاق تشريح دون الفلورة، واستخدام الفينول الأحمر بدلا من ذلك.
  6. الحفاظ على جميع المواد على الجليد لمدة فترة الحقن.
  7. تحميل حل الحقن في إبرة حقن باستخدام نصائح التحميل 20 مل وpipet p10.
  8. وضع حل حقن 1.5 مل وإدراج طرف التحميل في نهاية واسعة من إبرة الحقن.
  9. إخراج الحل بقدر ما أسفل في الإبرة ممكن والقضاء على فقاعات الهواء عن طريق النقر بلطف. يجب الحرص على عدم كسر الإبرة.
  10. ضع طبق البيض تحت المجهر تشريح وحدد التكبير منخفضة من حوالي 10X (1X التكبير ينظر إليها من خلال أهداف العين 10X).
  11. إدراج الإبرة في السكن حقن وتشديد.
    ملاحظة: الحرص على أن يتم إدراج الإبرة بشكل صحيح وبحزم في السكن. للقيام بذلك، وسحب نهاية واسعة من الإبرة مرة أخرى من السكن المعدني، وجلب أنابيب السيليكون في السكن معها. ضبط أنابيب السيليكون بحيث نهاية الزجاج من الإبرة تبرز فقط خارج السيليكون. إذا لم يتم ذلك، قد تحصل على انسداد أنابيب السيليكون بين الزجاج والمساكن المعدنية، وعرقلة نهاية الإبرة.
  12. إدراج بعناية السكن حقن مع إبرة تعلق في micromanipulator. كن على بينة من نهاية حادة من الإبرة وكن حذرا من أنه لا صدم في الأسطح وكسر.
  13. أثناء النظر إلى كل من البيض والإبرة من خلال المجهر، حرك الإبرة بالقرب من البيض في الزاوية اليسرى العليا من شبكة الطبق.
  14. خفض الإبرة حتى يدخل طرف HBS بالإضافة إلى 1٪ البنسلين / العقدية المخزنة في الطبق.
  15. مركز الإبرة في مجال الرؤية ونقل طبق البيض بحيث الإبرة هي بضعة ملم أقرب إلى حافة الطبق من البيض.
  16. لا تعيق عرض شبكة البيض مع الإبرة.
  17. تعيين المجهر إلى مرشح مناسب لRhodamine لذلك فمن الممكن لمراقبة الفلورة في الإبرة والتركيز على غيض من الإبرة.
  18. على الحاقن الدقيق، تتحول ببطء مقبض التوازن في اتجاه عقارب الساعة حتى يبدأ حل الحقن لتسرب من الإبرة في حل التعليق. وسيبدأ عدد الرصيد على شاشة الحاقن الصغير في الزيادة، على الرغم من أن القيمة العددية ليست مهمة. بعد ذلك، بدوره مقبض الباب مرة أخرى عكس اتجاه عقارب الساعة قليلا فقط حتى تتوقف صبغ تسرب من الإبرة.
    ملاحظة: من المهم تعيين هذا التوازن في كل مرة يتم فيها استخدام إبرة جديدة. دون تعيين التوازن بشكل مناسب، وسوف يستمر الحقن الدقيق لحقن لبعض الوقت بعد تشغيل الحقن. فمن الممكن حتى أن دفعة واحدة من زر الحقن مع إبرة غير متوازنة سيؤدي إلى طرد محتويات كامل من إبرة محملة.
  19. مع الإبرة المتمركزة في مجال الرؤية ، حرك طبق البيض بحيث تهدف الإبرة إلى حقن البويضة أولاً. من المستحسن أن تبدأ الحقن في زاوية واحدة من شبكة من البيض مرتبة، على سبيل المثال، الزاوية اليسرى العليا.
  20. ضبط التكبير إلى حوالي 50x; في هذا التكبير، بيضة واحدة سوف تملأ معظم مجال الرؤية.
  21. استخدام كل من micromanipulator واليد واحد على طبق البيض لنقل الإبرة في موقف للحقن.
  22. تقدم الإبرة باستخدام micromanipulator وإدراج غيض من الإبرة في البويضة الأولى ليتم حقنها.
  23. أدخل الإبرة على طول بيضة 20-30٪ من الطرف الخلفي (البلحدة) من البويضة (الشكل1E)،عمودي على المحور الطويل للبيضة.
  24. حقن الحل إما مع دواسة القدم حقن أو زر الحقن على الحاقن الصغير. وسوف يشير بولوس صغير من المواد الفلورية داخل البيضة إلى حقن ناجحة (الشكل1D).
    ملاحظة: ليس من غير المألوف أن يتم إخراج بعض صفار البيض من البويضة أثناء الحقن (الشكل1F)،وهذا لا يشير بالضرورة إلى أن البويضة المحقونة ستكون غير قابلة للحياة.
  25. سحب الإبرة من البيض. إذا تم رفع البويضة عن غير قصد من بئرها عند سحب الإبرة، استخدم ملقط صغيرة لدفع البويضة مرة أخرى إلى بئرها مع سحب الإبرة.
  26. إذا كانت الإبرة تسد أثناء الحقن، وإزالة الإبرة من البيض، والحفاظ على الإبرة المغمورة في HBS بالإضافة إلى 1٪ البنسلين / العقديات الحل الذي يغطي البيض، مسح الإبرة المسدودة باستخدام إما وظيفة واضحة أو عن طريق دفع الحقن زر.
  27. الاستمرار في استخدام نفس الإبرة، كرر إجراء الحقن لأكبر عدد ممكن من البيض. في البداية، قد يكون هذا فقط حوالي 20 أو 30 بيضة ولكن سوف تزيد إلى أكثر من 100 مع الممارسة.
  28. إذا انسدادت الإبرة ولا يمكن إزالتها، تخلص من الإبرة، وملأ إبرة جديدة والبدء من جديد (أي العودة إلى الخطوة 5.7).
  29. تخزين طبق من البيض عن طريق الحقن في حاضنة دافئة (23.5-26 درجة مئوية) التي هي رطبة قليلا (للحد من التبخر) حتى تصل الأجنة إلى المرحلة المرجوة من التنمية للتحليل.
  30. على الأقل كل 24 ساعة، وإزالة البيض التي لم تعد قابلة للحياة (الشكل3A،B)، واستبدال الحل تعليق مع HBS الطازجة بالإضافة إلى 1٪ البنسلين / العقديات.
  31. بعد يومين إلى ثلاثة أيام من الحقن، نقل البيض عن طريق الأنابيب لطيف أو مع ملقط البلاستيك إلى المناشف الورقية مبللة مع HBS بالإضافة إلى 1٪ البنسلين / العقديات في طبق بيتري مغطى لمواصلة التنمية في الحاضنة الدافئة والرطبة.
  32. مراقبة البيض، وإزالة البيض التي لم تعد قابلة للحياة كل يوم (الشكل3A،B).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الصراصير بسهولة وضع البيض في المواد الرطبة، وتوفير المواد الكافية، مثل الرمال الرطبة أو الأوساخ، يدفعهم إلى وضع عدد كبير من البيض. وهذا فعال بشكل خاص إذا تم حرمان الكريكيت أولا من المواد زرع البيض لمدة 8-10 ح. البيض وضعت في وسادة نظيفة يمكن فصلها بسهولة، وجمعها (الشكل1B)ووضعها في آبار البيض مصممة خصيصا للحقن (الشكل1C). يمكن استخدام مجهر تشريح، وحقن دقيق، وmicromanipulator (الشكل1A)لحقن البيض الفردية ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

التحديات الرئيسية اثنين مع هذه التقنية هي القضايا ذات الصلة من حجم إبرة الأمثل والقدرة على البقاء. على الرغم من أن الإبر الصغيرة تحسن القدرة على البقاء على قيد الحياة، فإن الإبر ذات اللومن الأضيق لديها درجة أكبر من القوى الشعرية في العمل، مما يجعل من المرجح أن ينتقل صفار البيض إلى الإبرة مما تسبب في انسداده. في أفضل الأحوال، يمكن إزالة انسداد ببساطة عن طريق حقن بيضة أخرى أو عن طريق تطهير الإبرة كما هو موضح أعلاه. يمكن للمرء أيضا محاولة زيادة ضغط التوازن على الحاقن الدقيق حتى يتم دفع صفار من الإبرة. والتحدي الرئيسي الآخر ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد تم دعم البحوث الواردة في هذا المشروع من قبل جائزة التنمية المؤسسية (IDeA) من المعهد الوطني للعلوم الطبية العامة للمعاهد الوطنية للصحة تحت رقم المنحة P20GM10342 إلى HH3، ورقم جائزة NSF IOS-1257217 إلى الفريق.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
مجهر تشريح الفلورسنتLeicaM165 FCمجهر مجسم مع مضان
مصدر ضوء خارجي للتألقLeicaEL 6000
MicroinjectorNarishigeIM-300-Accessoriesقد تشمل حامل إبر الحقن ، خرطوم الإدخال (مع موصل خرطوم) ، سلك طاقة التيار المتردد ، مفتاح القدم ، طوقا مطاط السيليكون -
مكعبمرشح mCherryمكعب مرشح LeicaM205FA / M165FCل mCherry أو صبغة حمراء مماثلة سيعمل
MicromanipulatorWorld Precision Instruments، Inc.M3301Rتستخدم مع حامل مغناطيسي (Narishige ، نوع GJ-8)
حامل مغناطيسيNarishigeMMO-202ND
حامل ماصة (حامل إبرة)أنابيب NarishigeHD-21
لتوصيل مصدر الهواء بالحاقن
الدقيق ختم بئر البيض3D مطبوعمخصصثلاثي الأبعاد مطبوع على Lulzbot Taz 5 باستخدام البلاستيك الحراري لحمض
الميكروويف
أو غرفة يتم التحكم في درجة حرارتهادرجات حرارة مختلفةمن 23.5-26 درجة ؛ هناك حاجة إلى C.
طعام الكريكيتطعام القطط المختلفةأو رقائق السمك هي طعام مناسب.
الاحتفاظ بالمياهقوارير وتقديمها إلى الصراصير من خلال كرات القطن
أن تشمل مواد المأوى المأوى مناشف ورقية مجعدة أو علب بيض
رقم الصنف 1B100F-4Kwik-Fil & trade ؛ الشعيرات الدموية الزجاجية البورسليكات ، بطول 100 مم ، معرف 0.58 مم ، OD 1.0 مم ، مع
مجتذب ماصة دقيقةملتهب / بنيموديل P-97موزعة بواسطة شركة Sutter Instrument.
طاحونة بيفلر / مايكروناريشيجموديل EG-45 / EG-400EG-400 يتضمن رأس مجهر
أطباق بتريCellTreatكود المنتج 22969390 مم
Play SandSandtastik Products Ltd.B003U6QLVSرمل اللعب الأبيض
AgaroseAB000972 التحليل الحيوي الأمريكيAgarose GPG / LE
مصفاة بيض فائقة النقاء: مصافي مخروطية من الفولاذ المقاوم للصدأ شبكة ناعمة للغاية من الفولاذ المقاوممستلزمات المطبخ الأمريكيةنموذج SS-C123يجب أن يتراوح حجم المسام بين 0.5 - 1.0 مم
البنسلين ستربتومايسينجيبكو بواسطة Life Technologiesالمرجع 15070-063بالقلم Strep
Sipel Electronic SAP3C-STDأسود ثابت مشتت ، مرشحات حقنة 118 مم
، قطر 25 مم ، 0.45 وميكرو ؛ mNalgene725-2545استخدم مع حقنة 1 مل
1 مل حقنة ، مع طرف سلةسلة Becton Dickinson309602استخدم مع مرشح الحقن لتصفية عازلة الحقن ، ستعمل محاقن Luer-Lok أيضا
خزان الهواء (اختياري) منتجاتالغربالأوسط Air Works & reg ؛خزان هواء محمول
صبغة الرودامينThermofisherD-1817ديكستران ، رباعي ميثيل رودامين 10،000 ميجاوات ،
20 مل نصائح تحميلEppendorfرقم الطلب 5242 956.003epT.I.P.S. 20 & mu ؛ L ميكرولودر
مجهر مركبZeissAxioskope 2 plus
20x objectiveZiessPlan-Apochromat 20x/0.75 M27
CameraLeicaDMC 5400
Leica Application Suite  برنامجLeicaLASالإصدار 4.6.2 المستخدم هنا
اللاكتيك بولي حاضنة مختلفة أو يمكن في يمكن أنابيب شعرية زجاجية World Precision Instruments، Inc. خيوط قطر للصدأ ملاقط بلاستيكية

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Abzhanov, A., et al. Are we there yet? Tracking the development of new model systems. Trends in Genetics. 24 (7), 353-360 (2008).
  2. Krebs, H. A. The August Krogh principle: “For many problems there is an animal on which it can be most conveniently studied. Journal of Experimental Zoology Part B: Molecular and Developmental Evolution. 194 (1), 221-226 (1975).
  3. Krogh, A. The Progress of Physiology. American Journal of Physiology. 90 (2), 243-251 (1929).
  4. Huber, F., Moore, T. E., Loher, W. Cricket neurobiology and behavior. , Cornell University Press. Ithaca. (1989).
  5. Horch, H. W., Mito, T., Popadic, A., Ohuchi, H., Noji, S. The Cricket as a Model Organism: Development, Regeneration, and Behavior. , Springer. Tokyo. (2017).
  6. Misof, B., et al. Phylogenomics resolves the timing and pattern of insect evolution. Science. 346 (6210), 763-767 (2014).
  7. Nakamura, T., et al. Imaging of transgenic cricket embryos reveals cell movements consistent with a syncytial patterning mechanism. Current Biology. 20 (18), 1641-1647 (2010).
  8. Shinmyo, Y., et al. piggyBac-mediated somatic transformation of the two-spotted cricket, Gryllus bimaculatus. Development, growth & differentiation. 46 (4), 343-349 (2004).
  9. Watanabe, T., et al. Non-transgenic genome modifications in a hemimetabolous insect using zinc-finger and TAL effector nucleases. Nature communications. 3, 1017(2012).
  10. Wang, H., La Russa, M., Qi, L. S. CRISPR/Cas9 in Genome Editing and Beyond. Annual Review of Biochemistry. 85 (1), 227-264 (2016).
  11. Awata, H., Watanabe, T., Hamanaka, Y., Mito, T., Noji, S., Mizunami, M. Knockout crickets for the study of learning and memory: Dopamine receptor Dop1 mediates aversive but not appetitive reinforcement in crickets. Scientific Reports. 5, 15885(2015).
  12. Horch, H. W., Liu, J. J., Mito, T., Popadic, A., Watanabe, T. Protocols in the Cricket. The Cricket as a Model Organism: Development, Regeneration, and Behavior. , 327-370 (2017).
  13. Watanabe, T., Noji, S., Mito, T. Genome Editing in the Cricket, Gryllus bimaculatus. Genome Editing in Animals. , 219-233 (2017).
  14. Kainz, F., Ewen-Campen, B., Akam, M., Extavour, C. G. Notch/Delta signalling is not required for segment generation in the basally branching insect Gryllus bimaculatus. Development. 138 (22), 5015-5026 (2011).
  15. Miyawaki, K., et al. Involvement of Wingless/Armadillo signaling in the posterior sequential segmentation in the cricket, Gryllus bimaculatus (Orthoptera), as revealed by RNAi analysis. Mechanisms of Development. 121 (2), 119-130 (2004).
  16. Donoughe, S., Kim, C., Extavour, C. G. High-throughput live-imaging of embryos in microwell arrays using a modular specimen mounting system. Biology Open. 7 (7), bio031260(2018).
  17. Donoughe, S., Nakamura, T., Ewen-Campen, B., Green, D. A., Henderson, L., Extavour, C. G. BMP signaling is required for the generation of primordial germ cells in an insect. Proceeding of the National Academy of Science USA. 111 (11), 4133-4138 (2014).
  18. Larson, E., Andres, J., Harrison, R. Influence of the male ejaculate on post-mating prezygotic barriers in field crickets. PLOS ONE. 7 (10), e46202(2012).
  19. Donoughe, S., Extavour, C. G. Embryonic development of the cricket Gryllus bimaculatus. Developmental Biology. , (2016).
  20. Matsuoka, Y., et al. Short germ insects utilize both the ancestral and derived mode of Polycomb group-mediated epigenetic silencing of Hox genes. Biology Open. 4 (6), 702-709 (2015).
  21. Rosenberg, M., Lynch, J., Desplan, C. Heads and tails: Evolution of antero-posterior patterning in insects. Biochimica et biophysica acta. 1789 (4), 333-342 (2009).
  22. Bacon, J., Strausfeld, N. Nonrandom resolution of neuron arrangements. Neuroanatomical Techniques: Insect Nervous System. , 357-372 (1980).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

HBS

مقالات ذات صلة