جراحة استئصال النخاع الشوكي للحبل الشوكي وتقييم المحرك الحركي المفتوح في الفئران

ترتبط إصابة الحبل الشوكي (SCI) باضطرابات شديدة في الوظائف الحركية والحسية واللاإرادية. النماذج الحيوانية التجريبية من SCI هي أدوات قيمة لفهم الأحداث التشريحية والفسيولوجية التي تنطوي عليها علم الأمراض SCI، للتحقيق في الآليات العصبية في الإصلاح والتعافي، وللفحص لفعالية وسلامة العلاجية المحتملة التدخلات. الفئران هي الأنواع الأكثر استخداما في البحوث SCI¹. نماذج الفئران منخفضة التكلفة، وسهلة التكاثر، وبطارية كبيرة من الاختبارات السلوكية متاحة لتقييم النتائج الوظيفية². على الرغم من بعض الاختلافات في مواقع المسالك، والحبل الشوكي الفئران يشارك وظائف الحسية مماثلة عموما مع الثدييات أكبر، بما في ذلك الرئيسيات^3،4. الفئران أيضا حصة العواقب الفسيولوجية والسلوكية مماثلة لSCI التي تتعلق البشر⁵. يمكن أن توفر الرئيسيات غير البشرية والنماذج الحيوانية الكبيرة تقريبًا تقريبًا تقريبًا من SCI⁶ البشري وهي ضرورية لإثبات سلامة العلاج وفعاليته قبل التجارب البشرية، ولكنها أقل شيوعًا بسبب الرعاية الأخلاقية والحيوانية الاعتبارات والنفقات والمتطلبات التنظيمية⁷.

يتم تنفيذ نماذج SCI تشريح الفئران عن طريق انقطاع المستهدفة من الحبل الشوكي مع آفة انتقائية باستخدام سكين تشريح أو مقص استئصال القزحية بعد استئصال الصفيحة. بالمقارنة مع تشريح كامل، تشريح جزئي في الفئران يؤدي إلى إصابة أقل شدة، أسهل الرعاية الحيوانية بعد العملية الجراحية، والانتعاش الحركي التلقائي، وأكثر عن كثب نماذج SCI في البشر التي هي في الغالب غير مكتملة مع تجنيب جزئي من الأنسجة التي تربط الحبل الشوكيوالهياكل فوق الشوكي8 . ويعطل تشريح الفص اللاإحادي جميع المساحات الصاعدة والمنحدرة على جانب واحد فقط، وينتج عن عجز في المحركات يمكن قياسه كمياً وشديد الانحراف، مما يعزز استكشاف الآليات البيولوجية الأساسية. النتيجة الوظيفية الأبرز للاستئصال هو شلل الأطراف الأولي على نفس الجانب وتحت مستوى الآفة مع الانتعاش التلقائي متدرج من وظيفة الحركية على مدى عدة أسابيع^{9،10، 11 , 12.}نموذج تشريح الاستئصال مفيد بشكل خاص للتحقيق في اللدونة العصبيةمن المسالك التالفة والمتبقية والدوائر المرتبطة الانتعاش الوظيفي 9،^{11،12، 13،14،15،16،17،18.} على وجه التحديد، استئصال النخاع الذي يتم إجراؤه على مستوى الصدر، أي فوق الدوائر الشوكية التي تتحكم في الحركة الخلفية، مفيد بشكل خاص للتحقيق في التغيرات في التحكم الحركي. كما توجد علاقة غير خطية بين شدة الآفة والانتعاش الحركي بعد SCI¹⁹، والاختبار السلوكي المناسب لتقييم النتائج الوظيفية أمر بالغ الأهمية في النماذج التجريبية.

تتوفر بطارية شاملة من الاختبارات السلوكية لتقييم جوانب محددة من الاسترداد الحركي الوظيفي في الفئران^2،20. العديد من الاختبارات الحركية لا توفر تدابير موثوق بها في وقت مبكر بعد SCI كما يتم تعطيل الفئران جداً لدعم وزن الجسم. مقياس الأداء الحركي التلقائي الذي هو حساس للعجز في وقت مبكر بعد الإصابة، ولا يتطلب التدريب قبل الجراحة أو المعدات المتخصصة، مفيد من أجل رصد الانتعاش الحركي للنقاط الزمنية المناسبة التي تكملة الاختبارات السلوكية المتخصصة. ومارتينيز في مجال مفتوح التقييم النتيجة¹⁰، وضعت أصلا لتقييم الأداء الحركي بعد SCI عنق الرحم في الفئران ، هو 20 نقطة درجة ordinal تقييم الأداء الحركي العالمي خلال الحركة فوق الأرض عفوية في حقل مفتوح. يتم إجراء التهديف بشكل منفصل لكل طرف باستخدام قاعدة تقيّم المعلمات المحددة لمجموعة من التدابير الحركية بما في ذلك حركة الأطراف المفصلية، ودعم الوزن، ووضع الأرقام، وقدرات الخطوات، وتنسيق الأطراف الخلفية، والذيل موقف. درجة التقييم مستمدة من مقياس تصنيف باسو وبيتي وبريسناهان (BBB) المفتوح المدى المصمم لتقييم الأداء الحركي بعد كدمة الصدر²¹. يتم تكييفها لتقييم دقيق وموثوق بها على حد سواء وظيفة اللوكوموتور، ويسمح لتقييم مستقل لمختلف المعلمات التهديف التي لا يمكن أن تكون قابلة للحصول على سجل هرمي من BBB، ويوفر الانتعاش الخطي الملف الشخصي¹⁰. بالإضافة إلى ذلك، بالمقارنة مع BBB، درجة التقييم حساسة وموثوق بها في نماذج الإصابات أكثر شدة^{10،11،20،22}. وقد استخدمت درجة التقييم لتقييم ضعف الحركية في الفئران بعد عنق الرحم^10،12 والصدر⁹ SCI وحدها وبالاشتراك مع إصابات الدماغ الصادمة²³.

نقدم هنا بروتوكولاً مفصلاً خطوة بخطوة لإجراء عملية استئصال الأنسجة الصدرية SCI على مستوى الفقرات T8 في الفئران ذات الأطراف الطويلة، ولتقييم تعافي اللورومي الخلفي في الحقل المفتوح.

أجريت التجارب الموصوفة في هذه المقالة وفقا للمبادئ التوجيهية للمجلس الكندي لرعاية الحيوان ووافقت عليها لجنة الأخلاقيات في جامعة مونتريال.

1. جراحة استئصال الأنف الصدري

1. ارتداء معدات واقية مناسبة (القفازات، قناع، وثوب) للحفاظ على بيئة مطهرة للجراحة. تنظيف المنطقة الجراحية مع مناديل الكحول، ووضع الستائر الجراحية العقيمة على المجال الجراحي. تعقيم الأدوات الجراحية ومكان في المجال الجراحي.
2. التخدير الفئران تحت خليط من غاز الإسفلوران (3٪ التعريفي، 0.5-3٪ صيانة) والأكسجين (1 لتر / دقيقة). تأكد من عمق التخدير الجراحي السليم عن طريق التحقق من عدم وجود قرصة اصبع القدم والاستجابات المنعكسة القرنية. مراقبة الفئران باستمرار خلال العملية بأكملها، وضبط كمية الولادة مخدر كما هو مطلوب للحفاظ على عمق التخدير الجراحي.
3. اقطع الجذع الظهري بين الورك والرقبة، وضع الفأر في المجال الجراحي، وتطهير موقع الشق بمناديل الكحول وحل بروفيوديود، والحفاظ على درجة حرارة الجسم الأساسية عند 37 درجة مئوية باستخدام وسادة تدفئة يتم التحكم فيها بواسطة المستقيم الحراره.
4. ضع مرهم العيون على العينين للحفاظ على ترطيبها وإعادة تطبيقها في جميع أنحاء الجراحة كما هو مطلوب.
5. قم بعمل شق بحجم 2.5 سم في الجلد يتراكب مع الفقرات T6−T10 مع مشرط. سحب الجلد والدهون السطحية باستخدام مقص تشريح حادة.
   ملاحظة: يمكن تحديد الأجزاء الفقرية T6−T10 إما عن طريق الجس لطيف من الأجزاء الشوكية الظهرية من قاعدة الجمجمة بدءا ً من البروز الملحوظ للفقرات الصدرية^{الثانية 24}، أو بواسطة caudally جس الضلع العائم الأكثر الخلفي الذي سوف تحفز الحركة في الفقرات الصدرية 13.
6. افصل العضلات شبه الفقرية التي تدخل على الجانب الظهري من فقرات T7−T9 باستخدام مقص تشريح حاد وجرار ذاتي الاحتفاظ. إزالة العروس ومسح أي الأنسجة المتبقية باستخدام ملقط غرامة والقطن يميل التطبيقات لفضح العمليات الشائكة ولامينا الفقرات.
   ملاحظة: هذا، والخطوات التالية يساعدها إلى حد كبير التصور المجهري (~ 5−15x).
7. قطع بعناية الأوجه (المفاصل zygapophysial) ثنائيا على الفقرات T7 و T8 مع الانتهازي العظام الحساسة. قطع النسيج الضام الظهري بين T8 و T9 laminae الفقرات سطحيا مع مشرط (عمق 1 ملم) الحرص على عدم إصابة الحبل تحت.
8. إزالة العملية العرضية من الفقرة T8 مع الانتهازي العظام. مع ملقط الهيموستاتيك المنحنية فرضت بعناية على عملية سبينوس T7، تدوير نهاية caudal من Laminae rostrally قليلا (~ 20 درجة)، إدراج الانتهازي العظام تحت لامينا T8، وجعل قطع خط الوسط تمتد على طول لامينا. مواصلة استئصال الصفيحة عن طريق تكرار التخفيضات على الجانب الأيسر والأيمن من اللامينا الفقراتي ة إلى العمليات العرضية لفضح الحبل الشوكي.
   ملاحظة: كن حذراً لإزالة كافة شظايا العظام التي تم إنشاؤها من استئصال الصفيحة.
9. ليدوكائين بالتنقيط (2٪، 0.1 مل) في القناة الشوكية المكشوفة وإزالة دورا تراكب الجزء الشوكي T8 باستخدام ملقط غرامة ومقص استئصال القزحية. كرر إدارة الليدوكائين إلى الحبل المكشوف وحدد خط الوسط للسلك من خلال تصور خط الوسط الذي تم إنشاؤه بين العمليات العرضية التي تمتد بين الفقرات T7−T9 المكشوفة.
   ملاحظة: جنبا إلى جنب مع العمليات العرضية على T7 و T9، يمكن أيضا استخدام العقد الجذرية الظهرية المكشوفة على T8 للمساعدة في تحديد خط الوسط ويمكن وضع إبرة 30 G في خط الوسط من الحبل للمساعدة في استئصال النخاع اللاحقة.
10. استئصال الحبل الشوكي من خط الوسط نحو جانب واحد بسكين تشريح. يجب الحرص على عدم قطع من خلال الشريان الشوكي الأمامي على الجانب البطني (لا تطبق ضغط ثابت على الجسم الفقري). باستخدام مقص استئصال القزحية، قطع بعناية من خلال أي الأنسجة المتبقية على الجانب الآفة من الحبل الشوكي لضمان مقطع ية البطين بشكل مناسب.
11. ضع الاسفنج الهيموستاتيك المعقمة المنقوع بالمالحة (~6 × 2 مم) في التجويف المكشوف فوق الحبل الشوكي وخياطة طبقات العضلات (4-0 بوليغلكتين 910). بعد ذلك، خياطة الجلد حول موقع الشق.
12. توفير مسكن كاف (البوبرينورفين 0.05 ملغ / كغ تحت الجلد [s.c.])، والمضادات الحيوية (enrofloxacin، 10 ملغ / كغ s.c.)، وتجديد السوائل المفقودة مع 5 سم مكعب محلول الرنين الرضاعة (داخل الصفاق [i.p.]) مباشرة بعد الجراحة.
13. إزالة الفئران من التخدير. ضع الجرذ في بيئة دافئة تحت وسادة التدفئة أو المصباح (~ 33 درجة مئوية) حتى يستيقظ الحيوان تماما.
14. توفير التسكين التكميلي يوميا على مدى الأيام الثلاثة الأولى بعد الجراحة ومراقبة باستمرار لعلامات الألم، وفقدان الوزن، micturition غير لائق، والعدوى، ومشاكل مع التئام الجروح، أو autophagia.

2. إجراء الاختبار في الميدان المفتوح وسجل الأداء الحركي

1. التعامل مع الفئران يوميا لمدة أسبوع واحد والعادة لهم إلى الساحة لمدة دورتين 5 دقيقة قبل اختبار للتأقلم إلى أن التقطت، بلطف من منتصف الجذع، بينما في الميدان المفتوح وضمان موثوقية القياس أثناء الاختبار.
2. ضع كاميرا على مستوى الأرض تواجه ساحة المجالات المفتوحة في زجاج شبكي دائري لتسجيل جلسات الاختبار للتحليل دون اتصال (30-60 إطار/ث كحد أدنى).
3. بدء تسجيل الفيديو ووضع الفئران في وسط الساحة تحت ظروف الضوء الخافت لتشجيع النشاط الحركي.
4. استمر في جلسة الاختبار لمدة 4 دقائق لضمان كمية كافية من نوبات المحرك للتحليل. التقاط واستبدال الفئران في وسط الساحة عندما تبقى ثابتة لفترة أطول من 20 ق لتعزيز الحركة.
5. تسجيل الأداء الحركي لجلسة الاختبار المسجلة من خلال إكمال القاعدة المقدمة فيالجدول 1وفقا للمعلمات في الأقسام الفرعية التالية.
   ملاحظة: من المفيد تسجيل كل معلمة بشكل منفصل عن طريق عرض متكرر لجلسة الاختبار المسجلة باستخدام البرامج التي تسمح لسرعة التشغيل المتغيرة وتحليل إطار بإطار (على سبيل المثال، مشغل وسائط VLC).
   1. بالنسبة لحركات الأطراف المفصلية، يسجل حركات المفاصل الخلفية أثناء الحركة التلقائية بشكل منفصل للكاحل والركبة والورك إما كأمر طبيعي (أكثر من نصف نطاق الحركة، والنتيجة الممنوحة = 2)، طفيفة (أقل من نصف نطاق الحركة، والنتيجة الممنوحة = 1)، أو غائبة (النتيجة الممنوحة = 0).
   2. لدعم الوزن، تقييم قدرة العضلات الموسعة الخلفية على التعاقد ودعم وزن الجسم المحملة عندما يكون الطرف على الأرض بشكل منفصل عندما يكون الفئران ثابتة وكذلك أثناء الحركة النشطة. منح درجة 1 عندما يكون دعم الوزن موجودا ً ودرجة 0 عند غياب دعم الوزن.
      ملاحظة: يعتبر دعم الوزن الثابت perquisite لدعم الوزن النشط.
   3. بالنسبة للموضع الرقمي، قم بتقييم موضع الأرقام الخلفية بينما يكون الجرذ ثابتًا وأثناء الحركة. منح درجة 2 عندما يتم تمديد الأرقام الخلفية، متباعدة بعيدا عن بعضها البعض، ومنشط أثناء الحركة في أكثر من 50٪ من فترة الاختبار (تعتبر طبيعية). منح درجة 1 عندما تبقى الأرقام في الغالب فليكس ودرجة 0 عندما تبقى الأرقام في الغالب atonic.
   4. للخطوة، أكمل هذه المعلمة فقط إذا كان الجرذ يمكنه دعم وزن الجسم أثناء التنقل. تقييم خطوة من خلال تصنيف اتجاه وضع مخلب الطرف الخلفي في وقت الاتصال الأولي وعند الإقلاع من الأرض بالإضافة إلى سيولة مرحلة التأرجح أثناء التنقل.
      ملاحظة: هناك 3 درجات لهذه المعلمة الموضحة في الأقسام الفرعية التالية تقييم منفصل: 1) التوجه المحوري لوضع مخلب في اتصال الأطراف (وضع الدوراتية / الأخمصية)، 2) التوجه الطولي لوضع مخلب عند الاتصال الأولي وأثناء الرفع (بالتوازي مع محور الجسم أو استدارة داخليا / خارجيا)، و 3) نوعية حركة الأطراف أثناء التأرجح (العادية أو غير النظامية).
      1. لوضع مخلب في اتصال الأطراف، ويسجل التوجه المحوري لوضع مخلب عند اتصال الأطراف كما 0 عندما تحدث مواضع الظهر في أكثر من 50٪ من الخطوات.
         ملاحظة: يعتبر موضع الأخمص ية بمثابة موقع لتسجيل اتجاه الكفة عند الاتصال والرفع (الخطوة 2-5-4-2)، وحركة التأرجح (الخطوة 2-5-4-3)، وتنسيق الأطراف الخلفية (الخطوة 2-5-5).
      2. لتوجيه مخلب في اتصال الطرف ورفع، منح درجة من 2 عندما مخلب طولية ومحاور الجسم هي موازية ودرجة 1 عندما يتم تدوير الطرف خارجيا أو داخليا، بشكل منفصل لكلا الاتصال الطرف ورفع.
      3. لحركة التأرجح، منح درجة من 2 عندما تتحرك المفاصل الخلفية بطريقة متناغمة ومنتظمة أثناء التأرجح ودرجة 1 عندما تحدث الحركات المتشنجة أو التشنجية للمفاصل أثناء التأرجح.
   5. لتنسيق الأطراف الأمامية والخلفية، أكمل هذه المعلمة فقط إذا حدثت 4 خطوات متتالية أثناء الاختبار وإذا كانت الأطراف يمكن أن تدعم بنشاط وزن الجسم. منح درجة 3 عندما يكون التنسيق متسقاً (>90% من الخطوات)، أو 2 عند تكرار (50-90% من الخطوات)، أو 1 عند عرضية (<50% من الخطوات)، أو 0 عند غياب (0% من الخطوات).
      ملاحظة: يتم تعريف التنسيق بين الأطراف الخلفية والطرف الخلفي على أنه تناوب منتظم في التنقل بين الطرف الخلفي الذي يتم تسجيله والطرف السفلي على نفس الجانب من الجسم.
   6. لموقف الذيل، وتقييم موقف الذيل أثناء الحركة إما صعودا (من الأرض، منحت درجة = 1) أو أسفل (لمس الأرض، منحت درجة = 0).
      ملاحظة: موقف ذيل مرتفعة أثناء الحركة هو مؤشر على استقرار الجذع في الفئران. بعد استئصال الهُمس، يُعقد الذيل عادةً بالقرب من الأرض أو لمسها مع ضعف استقرار الجذع.
   7. إضافة الدرجات الفردية من كل معلمة لتوفير إجمالي لكل طرف خلفي بحد أقصى 20 نقطة.
      ملاحظة: درجة 20 يشير إلى الأداء الحركي العادي. الدرجات <20 تمثل كميات متزايدة من ضعف الحركية ودرجة 0 يشير إلى شلل الأطراف.

يمكن توليد الآفات القابلة للاستنساخ مع درجة عالية من الاتساق مع تقنية استئصال الأنسجة. لتقييم ومقارنة أحجام الآفات بين المجموعات التجريبية ، يمكن حساب المساحة القصوى للآفة كنسبة مئوية من إجمالي المقطع العرضي للحبل الشوكي بسهولة مع تلطيخ النسيج ية لأقسام الحبل الشوكي. ويبين الشكل 1 آفة تمثيلية للهيميكورد الأيسر وتراكب اعلى نسبة من منطقة الآفة القصوى المشتركة بين الفئران مع متوسط حجم الآفة من 47.3٪ ± 4.0٪ من منطقة الحبل المقطعي (ن = 6).

الشكل 1: الآفات التّبيّنية في العمود الفقري. (أ) صورة دقيقة لقسم العمود الفقري الإكليلي في مركز الآفة من فأر مشقوق ملطخ بالبنفسج الكريسيل (أجسام الخلايا، الأرجواني) والأزرق السريع لوكسول (الملين والأزرق) مما يشير إلى تلف المادة الرمادية والبيضاء المركزة في اليسار hemicord. D, dorsal; V, ventral; L، اليسار؛ آر)، صحيح) شريط المقياس: 1مم (B) تراكب تخطيطي للنسبة المشتركة من منطقة الآفة القصوى في مجموعة من الفئران (ن = 6). موقع الجهاز القشري الشوكي المتقاطع في الجنب الظهري على الجانب الأيمن مظلل باللون الأسود. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

النتيجة الأولية للاستئصال هو الشلل الأولي للأطراف الخلفية على جانب الآفة خلال اليومين أو الثلاثة الأولى بعد العملية الجراحية. يحسن الأداء الحركي للأطراف الخلفية الأكثر تضررا بسرعة في الفئران بعد استئصال الفص خلال الأسابيع القليلة الأولى بعد الإصابة. عادة ما يلاحظ العجز الصغير في الطرف الخلفي المقابل في البداية بعد استئصال الهُم الذي يمكن أن يعكس التعويض عن الطرف الأكثر تضرراً، أو العجز الناجم عن عدم الاستقرار الوضعي، ودعم الوزن، والتنقل المستمر. ومن شأن العجز الكبير والمستمر في الطرف الخلفي المعاكس أن يشير إلى آفة ثنائية تمتد إلى hemicord المتعارضة.

ويرد في الجدول 1 نموذج لسجل الأداء الحركي.

الجدول 1: ورقة تسجيل العينات. عينة من قاعدة تسجيل الأداء الحركي. لكل معلمة، تتم الإشارة إلى الدرجات المحتملة بين قوسين. أنا، الداخلية؛ هاء، خارجي؛ P، موازية؛ FL-HL، الطرف الخلفي. الرجاء النقر هنا لتحميل هذا الملف.

يتم تصوير مسار الوقت للتغيرات التمثيلية في الأداء الحركي في الحالة السليمة وعلى مدى الأسابيع الخمسة الأولى بعد استئصال الفص في الجانب الأيسر في مجموعات منفصلة من الفئران (n = 6 لكل مجموعة) في الشكل 2.

الشكل 2: مسار الوقت التمثيلي للتغيرات في الأداء الحركي الخلفي في الميدان المفتوح في الحالة السليمة ولمدة خمسة أسابيع بعد استئصال الفص الصدري في الجانب الأيسر. أداء الطرف الخلفي الأيسر(A) يضعف بشكل ملحوظ من القيم السليمة خلال الأسابيع الثلاثة الأولى بعد استئصال الهُم، والطرف الخلفي الأيمن (B) خلال الأسبوع الأول بعد استئصال الهُم. يتم رسم البيانات على أنها متوسط المجموعة ± الانحراف المعياري (SD; n = 6 لكل مجموعة). وقد أجريت تحليلات إحصائية مع اختبارات كروسكال-واليس غير البارامترية التي استكملت باختبارات المقارنة المتعددة التي أجرتها دان لتقييم الاختلافات الجماعية بين النقاط الزمنية. *p < 0.05, ***p < 0.001. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.