هنا، نقدم بروتوكول اعادة الاستئصال الطرفية للفأر الكبار للتحقيق في تكوين الببلاسيما الثدييات وتحجر داخل الهستيرين، وتحليلها من قبل الكيمياء المناعية الفلورية والتتابع في الجسم الحي التصوير المقطعي المجهري.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
الكبار الماوس أرقام بتر وتجديد: نموذج بسيط للتحقيق في تكوين بلاسيما الثدييات والتحجر intramembranous
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
هنا، نقدم بروتوكول من الكبار الماوس البعيدة محطة phalanx (P3) بتر، نموذج الثدييات بسيطة إجرائيا واستنساخها من التجدد epimorphic، والذي ينطوي على تشكيل blastema والتحجر داخل التحجر تحليلها من قبل الكيمياء المناعية الفلورية والتصوير المقطعي المجهري المتسلسل في الجسم الحي (μCT). ويقتصر تجديد الثدييات على عمليات بتر الأطراف التي تنقل المنطقة البعيدة من الفالانكس الطرفي (P3)؛ الأرقام المبتورة في مستويات أكثر شبه ية تفشل في تجديد والخضوع للشفاء الليفي وتشكيل ندبة. يتم التوسط في استجابة التجديد عن طريق تشكيل انفجار التكاثري، تليها تجديد العظام عن طريق التحجر داخل العظام لاستعادة طول الهيكل العظمي المبتور. P3 بتر هو نموذج ما قبل السريرية للتحقيق في التجدد الشكلي في الثدييات، وهو أداة قوية لتصميم الاستراتيجيات العلاجية لاستبدال الشفاء الليفي مع استجابة تجديدية ناجحة. يستخدم بروتوكولنا الكيمياء المناعية الفلورية إلى 1) تحديد مجموعات الخلايا البلاسالتيما في وقت مبكر ومتأخر، 2) إعادة الأوعية الدموية في سياق التجدد، و 3) التحقيق في التحجر داخل العظام دون الحاجة إلى العظام المعقدة أجهزة التثبيت. كما نبرهن على استخدام التسلسلة في الجسم الحي μCT لإنشاء صور عالية الدقة لدراسة التغيرات المورفولوجية بعد البتر، فضلا عن قياس حجم وطول التغيرات في نفس الرقم على مدى التجديد. ونحن نعتقد أن هذا البروتوكول يوفر فائدة هائلة للتحقيق في كل من الاستجابات النضوجية والأنسجة التجديدية في الثدييات.
المقدمة
الثدييات، بما في ذلك البشر والفئران، لديها القدرة على تجديد نصائح من أرقامها بعدبتر القاصي للphalanx الطرفية (P3) 1،2،3. في الفئران، استجابة التجديد تعتمد على مستوى البتر; عمليات بتر الأرقام القريبة بشكل متزايد تظهر استجابة تجديدية مخففة تدريجيًا حتى فشل تجديدي كامل عند بتر الأطراف وتنتقل والقريبة إلى مصفوفة الأظافر P34و5و6 , 7 , 8.يتم التوسط تجديد P3 عن طريق تشكيل blastema، ويعرف بأنه مجموعة من الخلايا المتكاثرة ا....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
وكانت جميع عمليات استخدام الحيوانات وتقنياتها متوافقة مع إجراءات التشغيل الموحدة للجنة المؤسسات لرعاية الحيوانات واستخدامها التابعة لجامعة تكساس A&M.
1. الكبار ماوس هند أطرافه القاصي P3 بتر
- تخدير ماوس CD-1 من 8 إلى 12 أسبوعًا (جدولالمواد)باستخدام غاز الإيسوفيلوران في الأكسجين؛ في البداية التخدير في 3٪ في غرفة، تليها 2٪ isoflurane المقدمة من قبل أنفcone على مدى مدة الجراحة. تطبيق مرهم العيون على العينين لمنع الجفاف أثناء التخدير.
ملاحظة: يتم إجراء دراسات بتر P3 للبالغين الموحدة في مختبرنا على الفئران التي تعمر من 8 إلى 12 أسبوعًا، ويتم الحفاظ على استجابة التجديد في جميع السلالات المختبرة.
....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
الماوس الكبار تجديد أرقام P3 في 6/7 DPA (الشكل 2A-D)،9 DPA (الشكل2E-H)،و 10 DPA (الشكل2I-L)كانت ملطخة بالمناعة مع الأجسام المضادة لRunx2، OSX، و PCNA لتصور العظام داخل العظام تجديد، والمناعية مع الأجسام المضادة لCXCR4 وvWF لتصور تشكيل blastema. الرسومات التمثيلية للأرقام الممسوحة ضوئيًا قبل البتر وفي نقاط زمنية مختلفة على مدار فترة التجديد (الشكل3A،
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
يصف هذا البروتوكول إجراءً موحداً لبتر P3 القاصي للماوس البالغين، وتلطيخ الفلورسنت المناعي الكيميائي لتصور وتحرّي تشكيل البلازيما والتحجر داخل الجسم، والمسح المتسلسل داخل الجسم والأشعة المقطعية إلى تحديد العظام المورفولوجية، وحجم، وطول التغييرات بعد البتر. P3 بتر هو نموذج فريد من نوعه، بسيطة إجرائيا، واستنساخ لتحليل بيئة الجرح المؤيدة للتجدد الذي يؤدي إلى تشكيل blastema. وعلاوة على ذلك، فإن نموذج أرقام P3 يقدم العديد من المزايا على نماذج إصابات العظام التقليدية للتحقيق في التحجر داخل العظام.
ول.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.
شكر وتقدير
نشكر أعضاء مختبر مونيوكا ومعهد تكساس للطب الجينومي (TIGM). وقد تم دعم هذا العمل من قبل جامعة تكساس A & M.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| مصل كتلة البروتين الخالي | من DAKO | X0909 | جاهز للاستخدام |
| الجسم المضاد للفأر المضاد | PCNA Abcam | ab29 | 1: 2000 تخفيف |
| الجرذ المضاد للجسم المضاد CXCR4 | R & D Systems | MAB21651 | 1: 500 التخفيف |
| الأرنب المضاد للإنسان vWF XIII الجسم المضاد | DAKO | A0082 | 1: 800 التخفيف |
| الأرانب المضادة للوستاريكس ، SP7 الجسم المضاد | Abcam | ab22552 | 1: 400 التخفيف |
| الأرانب المضادة للجسم المضاد Runx2 | Sigma-Aldrich Co. | HPA022040 | 1:250 التخفيف |
| Alexa Fluor 647 الماعز المترافق المضاد للفأر IgG (H + L) | Invitrogen | A21235 | 1:500 التخفيف |
| Alexa Fluor 488 الماعز المترافق المضاد للأرانب IgG (H + L) | Invitrogen | A11008 | 1:500 التخفيف |
| Alexa Fluor 568 الماعز المترافق المضاد للفئران IgG (H + L) | Invitrogen | A11077 | 1: 500 التخفيف |
| إطالة كاشف | الذهب المضاد للبهتانInvitrogen | P36930 | جاهز للاستخدام |
| Surgipath Decalicifier 1 | Leica Biosystems | 3800400 | جاهز للاستخدام |
| Z-Fix ، مثبت فورمالين الزنك المائي المخزن | Anatech LTD | 174 | جاهز للاستخدام |
| CD-1 أنثى ماوس | Envigo | ICR (CD-1) | عمر 8-12 أسبوعا |
| vivaCT 40 | SCANCO Medical |
المراجع
- Douglas, B. S. Conservative management of guillotine amputation of the finger in children. Australian Paediatric Journal. 8, 86-89 (1972).
- Illingworth, C. M. Trapped fingers and amputated finger tips in children. Journal of Pediatric Surgery. <....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
