مقالة منهجية

التسجيلات الكهرولوجية للتيارات الأيونية أحادية الخلية تحت ضغط القص المحدد جيداً

6K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/59776

⸱

أغسطس 2, 2019

 , 
1Department of Medicine, Division of Pulmonary, Critical Care, Sleep and Allergy, University of Illinois at Chicago

في هذه المقالة

ملخص

والهدف من هذا البروتوكول هو وصف تعديل غرفة تدفق لوحة موازية لاستخدامها في التحقيق في الوقت الحقيقي تفعيل قنوات أيون mechanosensitive عن طريق الإجهاد القص.

الملخص

ومن المعروف جيدا الإجهاد القص السائل للعب دور رئيسي في وظيفة بطانة الرحم. في معظم أسرّة الأوعية الدموية، يؤدي ارتفاع ضغط القص الناتج عن الزيادات الحادة في تدفق الدم إلى سلسلة إشارة تؤدي إلى توسع الأوعية مما يخفف من الضغط الميكانيكي على جدار الأوعية الدموية. ومن المعروف جيدا أن نمط الإجهاد القص أن يكون عاملا حاسما في تطوير تصلب الشرايين مع الإجهاد القص laminar يجري atheroprotective واضطراب الإجهاد القص كونها المؤيدة للأثيروجينيك. في حين أن لدينا فهم مفصل لمختلف مسارات إشارة الخلية المتوسطة، لا يتم فهم المستقبلات التي تترجم أولا التحفيز الميكانيكي إلى وسطاء الكيميائية تماما. القنوات الأيونية المشانية حاسمة في الاستجابة للقص وتنظيم إشارات الخلايا التي يسببها القص وبالتالي السيطرة على إنتاج الوسطاء vasoactive. هذه القنوات هي من بين أقدم مكونات الإشارات المنشطة للقص، وقد تم ربطها بتوسع الأوعية الناجم عن القص من خلال تعزيز إنتاج أكسيد النيتريك (على سبيل المثال، تصحيح داخلي K+ [Kir] ومستقبلات عابرة المحتملة [TRP] القنوات) وعامل فرط الاستقطاب البطانة (على سبيل المثال، كير والكالسيوم تنشيط K+ [KCa] القنوات) والقص الناجم ة مضيق للأوعية من خلال آلية غير محددة التي تنطوي على قنوات بيزو. فهم الآلية البيوفيزيائية التي يتم من خلالها تنشيط هذه القنوات من قبل قوى القص (أي مباشرة أو من خلال مستقبلات الميكانو الأولية) يمكن أن توفر أهدافا جديدة محتملة لحل الفيزيولوجيا المرضية المرتبطة باختلال البطانة والتكوين الهيروي. لا يزال تحديا كبيرا لتسجيل تدفق الناجمة عن تفعيل قنوات أيون في الوقت الحقيقي باستخدام الفيزيولوجيا الكهربائية. الطرق القياسية لتعريض الخلايا لإجهاد القص محددة جيدا، مثل مخروط ولوحة مقياس الرطوبة وأغلقت غرفة تدفق لوحة موازية لا تسمح دراسة في الوقت الحقيقي من تنشيط قناة أيون. والهدف من هذا البروتوكول هو وصف تعديل غرفة تدفق لوحة موازية التي تسمح في الوقت الحقيقي تسجيل الكهربائية الفسيولوجية من قنوات أيون mechanosensitive تحت الإجهاد القص محددة جيدا.

المقدمة

ومن المعروف جيدا أن القوى الهيمودينامية الناتجة عن تدفق الدم تلعب أدوارا رئيسية في وظيفة البطانة والأوعية الدموية1،2. ومن المعروف جيدا أيضا أن عدة أنواع من القنوات أيون تستجيب بشكل حاد للتغيرات في الإجهاد القص3،4،5 مما يؤدي إلى فرضية أن قنوات أيون يمكن أن تكون أجهزة استشعار الإجهاد القص الأولية. في الآونة الأخيرة، أظهرنا نحن وآخرون أن قنوات الأيون المشانية الحساسة تلعب أدوارًا حاسمة في العديد من وظائف الأوعية الدموية الحساسة للقص الإجهاد، بما في ذلك الاستجابة الوعية الدموية لإجهاد القص6و7و8 ، وتكوين الأوعية التنموية9. ومع ذلك، فإن آليات حساسية الضغط على القص لقنوات الأيون غير معروفة تماماً تقريباً. ومن المرجح أن تكون هذه الفجوة في المعرفة بسبب الصعوبة التقنية في أداء التسجيلات الفسيولوجية الكهربائية تحت ضغط القص المحدد جيداً. في هذه المقالة، لذلك، ونحن نقدم خطوة خطوة بروتوكول مفصل ةيتم تنفيذها بشكل روتيني في مختبرنا لتحقيق هذا الهدف 6،7،10،11.

الهدف العام لهذه الطريقة هو السماح بالتحقيق في الوقت الحقيقي من قناة أيون mechanoactivation تحت الإجهاد القص محددة جيدا في النطاق الفسيولوجي. ويتحقق ذلك عن طريق تعديل غرفة تدفق لوحة موازية القياسية للسماح للماصة الكهربائية الفسيولوجية ليتم خفضها في الغرفة والوصول إلى الخلايا المزروعة على لوحة أسفل خلال التعرض في الوقت الحقيقي للتدفق، وتوفير نهج فريد لتحقيق هذا الهدف6و7و11. وعلى النقيض من ذلك، يمكن استخدام غرف تدفق اللوحة المتوازية القياسية، الموصوفة في المنشورات السابقة لتحليل التصوير في الوقت الحقيقي للخلايا المعرضة لقوى القص12 أو غيرها من النهج غير الغازية13،14 ولكن ليس ل الفيزيولوجيا الكهربائية. وبالمثل، مخروط ولوحة الجهاز، نهج قوي آخر لفضح الخلايا لالإجهاد القص15،16 ليست أيضا مناسبة للتسجيلات الكهرولوجية. وبالتالي، فإن هذه الأجهزة تدفق لا تسمح بالتحقيق في حساسية الإجهاد القص من قنوات أيون. وصعوبة إجراء التسجيلات الكهرولوجية تحت التدفق هي السبب الرئيسي لندرة المعلومات عن الآليات المسؤولة عن هذه الآثار الحاسمة.

وفيما يتعلق بالنهج البديلة لتحقيق نفس الهدف، لا توجد أي نُهج دقيقة أو خاضعة للرقابة. حاولت بعض الدراسات السابقة تسجيل نشاط قناة أيون تحت التدفق عن طريق تعريض الخلايا لتيار من السائل القادم من ماصة أخرى جلبت إلى محيط خلية من فوق17،18. هذا هو غير الفسيولوجية للغاية، والقوى الميكانيكية التي تم إنشاؤها في ظل هذه الظروف لديها القليل من القواسم المشتركة مع الملامح الفسيولوجية للإجهاد القص في الأوعية الدموية. وتنطبق شواغل مماثلة على محاولات محاكاة الإجهاد الفسيولوجي للقص عن طريق التسريب من الغرف المفتوحة. كما نوقش بالتفصيل في دراستنا السابقة10، واجهة الهواء السائل مفتوحة يخلق اضطرابات متعددة وإعادة تدوير ، والتي هي غير الفسيولوجية. لمعالجة كل هذه المخاوف، قمنا بتصميم لوحة موازية معدلة (MPP) غرفة تدفق، ويشار إليهاأيضا باسم "جهاز تدفق طفيفالتوغل" في دراساتنا السابقة 6،7،10،11،أدلى من الاكريليك وتستخدم على نطاق واسع في مختبرنا. ومع ذلك، على الرغم من حقيقة أن الوصف الأصلي للتصميم قد نشرت منذ ما يقرب من 20 عاما، وهو جهاز التدفق الوحيد الذي يسمح بإجراء تسجيلات الكهرولوجيسية تحت الإجهاد القص محددة جيدا، لم تكن هذه المنهجية التي اعتمدتها مختبرات أخرى، وهناك فقط عدد قليل جدا من الدراسات التي تحاول تسجيل التيارات تحت التدفق. ولذلك، نعتقد أن تقديم وصف مفصل لاستخدام غرفة تدفق MPP سيكون عونا كبيرا للبحوث الذين يهتمون قنوات أيون mechanosensitive وبيولوجيا الأوعية الدموية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

تمت الموافقة على استخدام الحيوانات في دراساتنا من قبل جامعة إلينوي في شيكاغو لجنة رعاية الحيوان (#16-183).

1. الجمعية من تعديل غرفة تدفق لوحة موازية

ملاحظة: يرجى الرجوع إلى الجدول 1 والشكل 1 للحصول على البطاقات الشخصية لقطعة غرفة التدفق MPP. يرجى الرجوع إلى الشكل 1 للحصول على مخطط بالتفصيل اتجاه قطع الغرفة للتجميع.

  1. التمسك الزجاج غطاء مستطيلة، قطعة D، إلى الجزء السفلي من قطعة C، أولا جعل محلول الاستومر سيليكون عن طريق خلط تماما 500 ميكرولتر عامل الاستومر سيليكون في 5 مل من قاعدة الاستومر سيليكون.
  2. تطبيق طبقة رقيقة من محلول الاستومر سيليكون حول حواف الفضاء مستطيلة من قطعة C ووضع بلطف غطاء مستطيل ة قطعة الزجاج D مباشرة على محلول الاستومر مثل أن قطعة D يغطي تماما مساحة مستطيلة مفتوحة من قطعة C. امسح محلول الاستومر الزائد من السيليكون بعناية.
  3. كرر الخطوة 1.2 للانضمام إلى الزجاج غطاء مستطيلة، قطعة F، إلى الجزء السفلي من قطعة E والسماح للحل الاستومر سيليكون لعلاج أكثر من الليل في درجة حرارة الغرفة.
    ملاحظة: وبمجرد الشفاء، سيبقى زجاج الغلاف المستطيل ملتصقاً لمدة تصل إلى ستة أشهر قبل الحاجة إلى استبداله.
  4. بدءا من قطعة الغرفة السفلى، قطعة E، وتجميع غرفة تدفق MPP عن طريق وضع بالتتابع كل قطعة على رأس السابق في الترتيب التالي: قطعة E (أسفل)، قطعة C، قطعة B، قطعة A (أعلى).
  5. محاذاة الثقوب المسمار من كل قطعة في زوايا والمسمار بإحكام القطع معا لمنع تسرب من الحدوث أثناء إدارة تدفق إلى غرفة تدفق MPP.

2. إعداد الخلايا والبذر في غرفة تدفق MPP

ملاحظة: اتبع الخطوات 2.1-2.7 للخلايا البطانية المستزرعة. اتبع الطريقة المفصلة في الخطوات 2.8−2.14 لعزل الخلايا البطانية من الممرات الشريانية الماسيرية للماوس وإعداد الخلايا البطانية المعزولة حديثاً.

  1. في لوحة 6-جيدا، وضع أربعة إلى خمسة 12 مم تغطية الدوائر الزجاجية / جيدا وخلايا البذور بين 10٪ و 30٪ من الملاءمة بحيث يمكن الوصول إلى خلايا واحدة للتسجيلات الكهرولوجية.
  2. حضانة الخلايا في ظل ظروف الثقافةالقياسية (5٪ CO 2، 37 درجة مئوية) لمدة لا تقل عن 2 ساعة للسماح للخلايا التمسك ولا يزيد عن 24 ساعة كما الخلايا البطانية في تجربة المؤلفين تصبح مسطحة جدا ويصعب تصحيحها عند البذر في دون الوصان لأكثر من 24 ح.
  3. إزالة غطاء الزجاج الذي يحتوي على الخلايا الملتصقة من بئر من لوحة 6 آبار، شطف بسرعة في الفوسفات المخزنة المالحة (PBS)،ونقل إلى طبق بيتري 35 ملم تحتوي على 2 مل حل حمام الكهرولوجيولوجية (الجدول 2) قبل نقل إلى تدفق MPP غرفه.
  4. نقل دائرة الزجاج غطاء إلى الزجاج غطاء مستطيلة، قطعة D، الذي يتم الالتزام به إلى قطعة C من غرفة تدفق MPP على يقين من أن الحل المناسب يبقى على الزجاج غطاء بحيث الخلايا لا تصبح عرضة للهواء. إضافة الحل الحمام المطلوب (~ 250 درجة مئوية) إلى الخلايا بحيث يتم غمر دائرة الزجاج الغطاء والخلايا تماما في الحل.
  5. وضع دائرة الزجاج الغطاء بحيث تقع في النصف الأقرب إلى الجانب خزان فراغ بحيث الخلايا سوف تكون في خط مع فتحات الشق من قطعة B. تأكد من أن دائرة الغطاء الزجاجي تلتزم قطعة D من خلال التصاق الحل الزجاجي بحيث تطبيق تدفق إلى الغرفة لا يعطل موقف دائرة الزجاج الغطاء.
  6. تجميع غرفة تدفق MPP عن طريق الشد القطع معا في الترتيب المناسب، كما هو موضح في الخطوتين 1.4 و 1.5 وكما هو مبين في الشكل1. نقل الغرفة إلى مرحلة المجهر وperfuse على الفور الغرفة مع حل حمام مثل هذا الحل يصل إلى خزان فراغ للطموح (~ 10 مل).
  7. تحديد خلية صحية للتجربة عن طريق تحديد خلية ذات حدود داكنة ونواة واضحة. تجنب الخلايا التي يبدو أنها تتطفل أو الخلايا التي هي على اتصال مع خلايا أخرى.
    ملاحظة: في مختبر المؤلفين، يتم استخدام الخلايا البطانية الأبهرية البشرية والخلايا البطانية البطانة الماوس الأولية في الثقافة. ومع ذلك، يمكن استخدام أي نوع آخر من الخلايا الملتصقة التي تهم احتياجات بحثية محددة بنفس الطريقة.
  8. غسل الممرات الشريانية المعزولة فيحل التفكك (الجدول 2). نقل الممر إلى أنبوب الطرد المركزي 2 مل تحتوي على 2 مل من قبل الدفء (37 درجة مئوية) حل التفكك (وصفة لحل التفكك هو مبين في الجدول2) التي تحتوي على البروتياز محايدة (0.5 ملغ / مل) وelastase (0.5 ملغ / مل). الحضانة لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية مع هز لطيف كل 10 دقائق.
  9. إزالة 1 مل من البروتياز محايدة / elastase حل التفكك وإضافة 1 ملغ / مل كولاجيناز نوع 1. إرجاع محلول الكولاجين إلى الحل الذي يحتوي على الشرايين لتركيز الكولاجين النهائي من النوع 1 من 0.5 ملغ /مل. الحضانة لمدة 2-3 دقائق عند 37 درجة مئوية.
  10. باستخدام ملقط 5 الصف، حرك الممر بسرعة على طبق بيتري قطره 35 مم يحتوي على قطرة 750 درجة مئوية من محلول التفكك الطازج المبرد. مزيد من فصل الأنسجة باستخدام اثنين من الإبر حقنة 20 G لتحرير الخلايا البطانية ميكانيكيا من الشرايين المهضومة الأنزيمية.
  11. باستخدام 9 "القابل للتصرف باستور زجاج pipet، triturate حل الخلية 10X قبل نقل الخلايا إلى أنبوب الطرد المركزي 1.5 مل جديدة باستخدام الأنابيب الزجاجية.
  12. اغسل طبق بيتري بـ 750 ميكرولتر آخر من محلول التفكك ونقلها إلى نفس الأنبوب. باستخدام الماصة الزجاجية، مزيد من تفريق ميكانيكيا الخلايا عن طريق الأنابيب ما لا يقل عن 10X لخلق تعليق خلية واحدة الحرص على عدم إدخال فقاعات التي قد تضر سلامة الخلايا البطانية.
  13. أضف 750 درجة مئوية من تعليق الخلايا البطانية (حوالي 500−1000 خلية) مباشرة إلى القطعة D من غرفة تدفق MPP على النصف الأقرب إلى جانب فراغ الخزان. السماح للخلايا البطانية التمسك بين 45 دقيقة و 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
  14. تجميع غرفة تدفق MPP عن طريق الشد القطع معا في الترتيب المناسب كما هو موضح في الخطوتين 1.4 و 1.5 وكما هو مبين في الشكل1. نقل الغرفة إلى مرحلة المجهر وperfuse على الفور الغرفة مع حل حمام مثل هذا الحل يصل إلى طموح فراغ (~ 10 مل). تحديد الخلايا البطانية التي يمكن الوصول إليها من خلال النمط الظاهري الخام والدائري19،20.
    ملاحظة: وقد استخدمت مجموعة متنوعة من طرق الهضم والكوكتيلات الإنزيم لعزل الخلايا البطانية من الأسرة الشريانية المختلفة. انظر الجدول 3 للاطلاع على الأوصاف التفصيلية للبروتوكولات التي استخدمتها مجموعة متنوعة من المحققين لعزل الخلايا البطانية للربط بالفيزيولوجيا الكهربائية للقنوات الأيونية الحساسة للمشانية. هذه الطرق من المحتمل أن تكون مناسبة للاستخدام مع غرفة تدفق MPP.

3. السيطرة على الإجهاد القص إلى غرفة تدفق MPP للتسجيلات الفسيولوجية الكهربائية من قنوات الأيون Mechasensitive تنشيط القص

  1. إقامة نظام ضخ الجاذبية عن طريق ربط اسطوانة حقنة تخرج 30 مل إلى قفل luer 3-way مزودة أنابيب microbore (القطر الداخلي: 0.05 بوصة، القطر الخارجي: 0.09 بوصة) مناسبة للإدراج في ثقب مدخل قطرها 3 مم من قطعة A من MPP غرفه.
  2. إرفاق الاسطوانة المتخرجة على الوجه الخارجي لقفص فاراداي المحيطةتلاعب الفيزيولوجيا الكهربائية (الشكل 2) باستخدام الشريط على الوجهين. قبل إدخال الأنابيب في غرفة MPP، قم بتعبئة الحقنة والأنابيب مسبقًا مع محلول الحمام (راجع الجدول 2 للاطلاع على حل الحمام المستخدم في التحقيق في تصحيح K+ قنوات في الخلايا البطانية داخليًا). إدراج الأنابيب في فتحة مدخل غرفة تدفق MPP من قطعة A.
  3. قبل ملء غرفة تدفق MPP مع حل مثل هذا الحل يتم إزالتها في خزان فراغ. وقف التدفق إلى الغرفة وإعادة ملء اسطوانة تخرج إلى العلامة العليا. حساب معدلات التدفق يدويا عن طريق السماح للحل لتدفق من خلال الغرفة واستخدام وقف ووتش لحساب مل / ث في ارتفاع اسطوانة حقنة معينة.
  4. رفع أو خفض الحقنة لتغيير التدفق، وبالتالي القص في الغرفة، ومواصلة هذه العملية حتى يتم العثور على المستوى المطلوب من الإجهاد القص.
  5. حساب الإجهاد القص في غرفة موازية باستخدام المعادلة التالية21:
    = 6 μQ / ساعة2ث
    حيث μ = اللزوجة السائلة (g/cm·s)، Q = معدل التدفق (مل/ثانية)، وعرض غرفة اللوحة المتوازية (w = 2.2 سم) والارتفاع (h = 0.1 سم).
    ملاحظة: في نظام التسريب الجاذبية الحالية، في ارتفاع اسطوانة حقنة (كما تقاس من أعلى الاسطوانة) من 57 سم فوق مرحلة المجهر، ومعدل التدفق هو 0.3 مل / ث. القص محسوبة في الغرفة في هذا ارتفاع اسطوانة حقنة ومعدلالتدفق هو 0.7 dyn/cm 2. وتجدر الإشارة أيضا إلى أن نظم التسريب الأخرى، مثل مضخة تمعجية، يمكن استخدامها للسيطرة على تدفق إلى غرفة تدفق MPP. ومع ذلك، قد تضيف هذه الأجهزة الاضطرابات غير المرغوب فيها وتؤثر على استقرار قياسات الفيزيولوجيا الكهربائية تحت التدفق، وبالتالي، باستخدام نظام التسريب الجاذبية الموضحة هنا.
  6. نقل غرفة مجمعة تحتوي على الخلايا الملتصقة إلى مرحلة المجهر من جهاز الفيزيولوجيا الكهربائية وإدراج الأنابيب المملوءة مسبقا مع حل الحمام في حفرة من قطعة A. في وقت واحد ملء الغرفة وغسل الخلايا مع 10 مل من حل الحمام من قبل تحول قفل luer 3-way مثل هذا الحل يتدفق إلى الغرفة.
  7. مرة واحدة يتم الحصول على تكوين التصحيح المطلوب بنجاح السماح تيارات القناة لتحقيق الاستقرار في حمام ثابت في درجة حرارة الغرفة. مرة واحدة وقد استقرت التيارات، وتطبيق القص بطريقة خطوة الحكمة مما يسمح الزيادات في التيار لتحقيق الاستقرار قبل زيادة الخطوة التالية في الإجهاد القص.
    ملاحظة: يجد المؤلفون النجاح الأكبر في تكوين التصحيح المثقب عند دراسة قنوات الأيون المثقبة في الخلايا البطانية. لإجراء تكوينات تصحيح الخلية الكاملة المثقبة، أضف 5 ميكرولتر من أمفوتيريسين B مخزون 60 ملغم/مل في كبريتيد ثنائي الميثيل (DMSO) إلى 1 مل من 0.2 م محلول ماصة معقمة مصفاة. بعد إنشاء ختم جيجا أوم في التكوين المتصل بالخلايا، تتشكل بقع الخلايا الكاملة المثقبة في غضون 2−5 دقائق.
  8. إزالة التعرض القص إلى الخلايا عن طريق وقف التدفق إلى الغرفة مما يسمح تيارات قناة mechanosensitive للعودة إلى التيارات الأساسية لوحظ في الحمام ثابت.
  9. عزل التيارات قناة أيون mechanosensitive من الاهتمام عن طريق تغيير التكافؤ الحل (على سبيل المثال، 60 مل K+ في حل حمام مع 0 كاليفورنيا2 + في حل ماصة لدراسة تصحيح داخليا K + القنوات. ويبين الجدول 2 وصفات المحلول المثال) و/أو تثبيط الدوائية للمصادر الحالية التي يحتمل أن تلوث.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

تظهر في الشكل 1صور متعددة تظهر وجهات نظر مختلفة لغرفة تدفق MPP على مرحلة المجهر (اللوحة العليا) وتمثيل تخطيطي لغرفة تدفق MPP (اللوحة السفلية). تفاصيل المخطط أبعاد الجهاز بأكمله وغرفة التدفق. يظهر الشكل 2 صورة لنظام التسريب الجاذبية إلى غرفة تدفق MPP في مختبرنا (اللوحة العليا). كما يظهر تمثيل تخطيطي لنظام التدفق (لوحة أسفل) تهدف إلى تسليط الضوء على الخطوات التي عزل الخلايا في غرفة التدفق من الاندفاع من الحل من نظام التسريب ومن قوة...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

يتعرض نظام الأوعية الدموية باستمرار لقوى الهيمودينامية النشطة، والتي تنشط القنوات الأيونية mechanosensitive3،22 ولكن الأدوار الفسيولوجية لهذه القنوات في القص الناجم عن الإجهاد mechanotransduction هو فقط بدأت تظهر4،6،8. الآليات المسؤولة عن حساسية المشانوية للقنوات التي تعمل بالإجهاد القص لا تزال غير معروفة. يصف البروتوكول المفصل هنا طريقة التحقيق المباشر في قنوات الأيون ا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

تم تمويل هذا العمل من قبل المعهد الوطني للقلب والرئة والدم (R01 HL073965، IL) و (T32 HL007829-24، ISF). كما يود المؤلفون أن ينوه بمتجر الآلات العلمية في جامعة إلينوي في شيكاغو لتوليد أحدث غرف تدفق MPP لدينا.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
0.2 وميكرو ؛ مرشحات الحقنة المعقمة مVWR28145-501تستخدم لتصفية محلول الماصة الكهربية الفيزيائية
5 ملقط درجاتأدوات علمية دقيقة1252-30تستخدم لنقل الشرايين المهضومة إلى محلول طازج
9 "Pasteur PipetFisher Scientifc13-678-20Dتستخدم لتعطيل الشرايين المهضومة ميكانيكيا ونقل الخلايا الداخلية المعزولة حديثا   ؛
12 مم تغطية دوائر زجاجيةFisher Scientifc12-545-80للاستخدام مع الدراسات التي تنطوي على خلايا مستنبتة وعلاجات متعددة. تستخدم الخلايا الملتصقة بزجاج الغطاء لتحليلات مشبك التصحيح
24 مم × 40 مم زجاج غطاء مستطيلSigma-AldrichCLS2975224غطاء زجاجي ليتم إضافته إلى قطع غرفة تدفق MPP C (الشكل 1)
24 مم × 50 مم زجاج غطاء مستطيلSigma-AldrichCLS2975245غطاء زجاج لإضافته إلى غرفة تدفق MPP E (الشكل 1)
إبر حقنة 20 GBecton Dickinson and Co305175للاستخدام في التعطيل الميكانيكي للشرايين المساريقية المهضومة
35 مم طبق بتريجينيسي العلمي32-103للاستخدام في التعطيل الميكانيكي للشرايين المساريقية المهضومة
أمفوتريسين ب القابل للذوبانسيجما-ألدريتشA9528-50MGيستخدم لتوليد تكوين تصحيح الخلية الكاملة المثقوب.
كولاجيناز ، النوع الأولورثينجتون بيوكيميائي100 مجم -إنزيم LS004194 يستخدم في مختبرنا كعملية هضم قصيرة بعد الكوكتيل الأولي للبروتياز المحايد والإيلاستاز
ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO)فيشر ساينتيفك67-68-5مذيب للأمفوتريسين ب المستخدم في مشبك التصحيح المثقب للخلية الكاملة
الإيلاستاز ، المجفف بالتجميدورثينجتون الكيمياء الحيوية25 مجم - LS002290  ؛إنزيم يستخدم في مختبرنا في كوكتيل مع البروتياز المحايد / التباين لبدء هضم الشرايين لعزل الخلايا البطانية.
لوحة ثقافة أنسجة الصقر ، 6 بئر ، قاع مسطح مع غطاء تبخر منخفض   ؛كورنينج353046للاستخدام مع الدراسات التي تنطوي على خلايا مستنبتة وعلاجات متعددة
البروتياز المحايد / التباينورثينجتون الكيمياء الحيوية10 مجم - LS02100 50 مجم - LS02104إنزيم يستخدم في مختبرنا في كوكتيل مع الإيلاستاز لبدء هضم الشرايين لعزل الخلايا البطانية
SylGard & nbsp ؛الدقةالعالمية SYLG184المطاط الصناعي السيليكوني للالتصاق بزلة الغطاء المستطيل بقطع غرفة تدفق MPP C و E (الشكل 1)
Tygon ND 10-80 أنابيبMicroboreAAQ04133ID: 0.05 بوصة ، OD: 0.09 بوصة ، أنابيب نضح مدخل لتدفق إداري إلى الغرفة
قطر أدوات

المراجع

  1. Green, D. J., Hopman, M. T., Padilla, J., Laughlin, M. H., Thijssen, D. H. Vascular Adaptation to Exercise in Humans: Role of Hemodynamic Stimuli. Physiological Reviews. 97 (2), 495-528 (2017).
  2. Gimbrone, M. A. Jr, Topper, J. N., Nagel, T., Anderson, K. R., Garcia-Cardena, G. Endothelial dysfunction, hemodynamic forces, and atherogenesis. Annals of the New York Academy of Sciences. 902, discussion 239-240 230-239 (2000).
  3. Olesen, S. P., Clapham, D. E., Davies, P. F. Haemodynamic shear stress activates a K+ current in vascular endothelial cells. Nature. 331 (6152), 168-170 (1988).
  4. Barakat, A. I., Lieu, D. K., Gojova, A. Secrets of the code: do vascular endothelial cells use ion channels to decipher complex flow signals? Biomaterials. 27 (5), 671-678 (2006).
  5. Beech, D. J. Endothelial Piezo1 channels as sensors of exercise. Journal of Physiology. 596 (6), 979-984 (2018).
  6. Ahn, S. J., et al. Inwardly rectifying K(+) channels are major contributors to flow-induced vasodilatation in resistance arteries. Journal of Physiology. 595 (7), 2339-2364 (2017).
  7. Fancher, I. S., et al. Hypercholesterolemia-Induced Loss of Flow-Induced Vasodilation and Lesion Formation in Apolipoprotein E-Deficient Mice Critically Depend on Inwardly Rectifying K(+) Channels. Journal of the American Heart Association. 7 (5), (2018).
  8. Rode, B., et al. Piezo1 channels sense whole body physical activity to reset cardiovascular homeostasis and enhance performance. Nature Communications. 8 (1), 350(2017).
  9. Li, J., et al. Piezo1 integration of vascular architecture with physiological force. Nature. 515 (7526), 279-282 (2014).
  10. Levitan, I., Helmke, B. P., Davies, P. F. A chamber to permit invasive manipulation of adherent cells in laminar flow with minimal disturbance of the flow field. Annals of Biomed Engineering. 28 (10), 1184-1193 (2000).
  11. Fang, Y., et al. Hypercholesterolemia suppresses inwardly rectifying K+ channels in aortic endothelium in vitro and in vivo. Circulation Research. 98 (8), 1064-1071 (2006).
  12. Shetty, S., Weston, C. J., Adams, D. H., Lalor, P. F. A flow adhesion assay to study leucocyte recruitment to human hepatic sinusoidal endothelium under conditions of shear stress. Journal of Visualized Experiments. (85), e51330(2014).
  13. Man, H. S. J., et al. Gene Expression Analysis of Endothelial Cells Exposed to Shear Stress Using Multiple Parallel-plate Flow Chambers. Journal of Visualized Experiments. (140), e58478(2018).
  14. White, L. A., et al. The Assembly and Application of 'Shear Rings': A Novel Endothelial Model for Orbital, Unidirectional and Periodic Fluid Flow and Shear Stress. Journal of Visualized Experiments. (116), e54632(2016).
  15. Franzoni, M., et al. Design of a cone-and-plate device for controlled realistic shear stress stimulation on endothelial cell monolayers. Cytotechnology. 68 (5), 1885-1896 (2016).
  16. Dewey, C. F. Jr, Bussolari, S. R., Gimbrone, M. A. Jr, Davies, P. F. The dynamic response of vascular endothelial cells to fluid shear stress. Journal of Biomechanical Engineering. 103 (3), 177-185 (1981).
  17. Hoger, J. H., Ilyin, V. I., Forsyth, S., Hoger, A. Shear stress regulates the endothelial Kir2.1 ion channel. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (11), 7780-7785 (2002).
  18. Moccia, F., Villa, A., Tanzi, F. Flow-activated Na(+)and K(+)Current in cardiac microvascular endothelial cells. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 32 (8), 1589-1593 (2000).
  19. Crane, G. J., Walker, S. D., Dora, K. A., Garland, C. J. Evidence for a differential cellular distribution of inward rectifier K channels in the rat isolated mesenteric artery. Journal of Vascular Research. 40 (2), 159-168 (2003).
  20. Hannah, R. M., Dunn, K. M., Bonev, A. D., Nelson, M. T. Endothelial SK(Ca) and IK(Ca) channels regulate brain parenchymal arteriolar diameter and cortical cerebral blood flow. Journal of Cereberal Blood Flow and Metabolism. 31 (5), 1175-1186 (2011).
  21. Lane, W. O., et al. Parallel-plate flow chamber and continuous flow circuit to evaluate endothelial progenitor cells under laminar flow shear stress. Journal of Visualized Experiments. (59), e3349(2012).
  22. Lieu, D. K., Pappone, P. A., Barakat, A. I. Differential membrane potential and ion current responses to different types of shear stress in vascular endothelial cells. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 286 (6), C1367-C1375 (2004).
  23. Le Master, E., et al. Proatherogenic Flow Increases Endothelial Stiffness via Enhanced CD36-Mediated Uptake of Oxidized Low-Density Lipoproteins. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 38 (1), 64-75 (2018).
  24. Kim, J. G., et al. Measurement of Ion Concentration in the Unstirred Boundary Layer with Open Patch-Clamp Pipette: Implications in Control of Ion Channels by Fluid Flow. Journal of Visualized Experiments. (143), e58228(2019).
  25. Kim, J. G., et al. Fluid flow facilitates inward rectifier K(+) current by convectively restoring [K(+)] at the cell membrane surface. Scientific Reports. 6, 39585(2016).
  26. Malek, A. M., Alper, S. L., Izumo, S. Hemodynamic shear stress and its role in atherosclerosis. Journal of the American Medical Association. 282 (21), 2035-2042 (1999).
  27. Jacobs, E. R., et al. Shear activated channels in cell-attached patches of cultured bovine aortic endothelial cells. Pflugers Archiv. European Journal of Physiology. 431 (1), 129-131 (1995).
  28. Barakat, A. I., Leaver, E. V., Pappone, P. A., Davies, P. F. A flow-activated chloride-selective membrane current in vascular endothelial cells. Circulation Research. 85 (9), 820-828 (1999).
  29. Fitzgerald, T. N., et al. Laminar shear stress stimulates vascular smooth muscle cell apoptosis via the Akt pathway. Journal of Cellular Physiology. 216 (2), 389-395 (2008).
  30. Ueba, H., Kawakami, M., Yaginuma, T. Shear stress as an inhibitor of vascular smooth muscle cell proliferation. Role of transforming growth factor-beta 1 and tissue-type plasminogen activator. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 17 (8), 1512-1516 (1997).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة