يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

تميز المسوخ ذات الصلة بالأمراض من Kinases الأسرة سلاح الجو الملكي البريطاني باستخدام مجموعة من الأساليب العملية والممكنة

5.8K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/59795

⸱

يوليو 17, 2019

 ,  ,  ,  ,  , 
1The Laboratory of Cancer Signaling, Division of Cellular and Molecular Research, National Cancer Centre Singapore, 2The Cancer and Stem Cell Program, Duke-NUS Medical School

في هذه المقالة

ملخص

في هذه المقالة، قدمنا مجموعة من الطرق العملية والعملية لوصف المتحولين ذات الصلة بالأمراض من kinases الأسرة سلاح الجو الملكي البريطاني، والتي تشمل في المختبر اختبار كيناز، ومختبر التنشيط المشترك، وتكملة الانقسام لوسيفيراز اختبار.

الملخص

تلعب الكينازات العائلية السريعة التسارع (RAF) دوراً محورياً في بيولوجيا الخلايا ويؤدي اختلالها الوظيفي إلى السرطانات واضطرابات النمو. ومن شأنه أن يساعدنا توصيف المتحولين المرتبطين بالأمراض في سلاح الجو الملكي البريطاني على اختيار الاستراتيجيات العلاجية المناسبة لعلاج هذه الأمراض. وقد أظهرت الدراسات الحديثة أن الكيناس العائلية لسلاح الجو الملكي البريطاني لها أنشطة حفازة وأنشطة ألوستريك على حد سواء، والتي يتم تنظيمها بإحكام من خلال التمتميّز. هنا، قمنا ببناء مجموعة من الأساليب العملية والعملية لتحديد الأنشطة الحفازة وallosteric والتقارب/الاستقرار الخافت النسبي لقرابة أسرة سلاح الجو الملكي البريطاني ومسوخهم. أولا، قمنا بتعديل اختبار كيناز الكلاسيكية في المختبر عن طريق الحد من تركيز المنظفات في المخازن المؤقتة، وذلك باستخدام إجراء غسل سريع لطيف، واستخدام الجلوتاثيون S-transferase (GST) الانصهار لمنع الدمامل RAF من التفكك خلال تنقيه. وهذا يمكننا من قياس النشاط الحفاز للمتحولين سلاح الجو الملكي البريطاني النشط بشكل مناسب. ثانيا، قمنا بتطوير جديد سلاح الجو الملكي البريطاني في التفعيل المشترك لتقييم النشاط اللوستريك من متحولي سلاح الجو الملكي البريطاني ميتا كيناز باستخدام N-محطة اقتطاع البروتينات سلاح الجو الملكي البريطاني، والقضاء على متطلبات راس نشطة في البروتوكولات الحالية وبالتالي تحقيق أعلى حساسيه. وأخيراً، قمنا بتوليد عملية مسح منفصلة فريدة من نوعها لقياس التقارب/الاستقرار النسبي للمتحولين في سلاح الجو الملكي البريطاني، وهو أكثر موثوقية وحساسية مقارنة بالفحص التقليدي للمناعة. وباختصار، فإن هذه الأساليب لها المزايا التالية: (1) سهلة الاستخدام؛ (2) سهلة الاستخدام؛ (3) سهلة الاستخدام؛ (3) سهلة الاستخدام؛ (3) سهلة الاستخدام؛ (3) سهلة الاستخدام (2) قادرة على تنفيذ فعال دون معدات متقدمة؛ (3) فعالة من حيث التكلفة؛ (4) حساسة للغاية واستنساخها.

المقدمة

وkinases الأسرة سلاح الجو الملكي البريطاني هي عنصر رئيسي من RAS / RAF / MEK / ERK إشارة تتالي، والتي تنقل إشارة من RAS لتنشيط كيناز البروتين المنشط ميثوجن (MEK)1،2،3،4. هذه الأسرة من kinases تلعب دورا حاسما في نمو الخلايا والبقاء على قيدالحياة والتمايز، وتعديلاتها تحفز العديد من الأمراض، ولا سيما السرطان 5،6،7،8. في الآونة الأخيرة، حددت التسلسلات الجينية العديد من المتحولين RAF ذات الصلة بالأمراض التي تظهر خصائص مختلفة في انتقال إشارة RAS / RAF / MEK / ERK شلال9،10،11. وصف دقيق لمسوخ سلاح الجو الملكي البريطاني سوف تساعدنا على فهم الآليات الجزيئية لكيفية تغيير المتحولين RAF الناتج إشارة من RAS / RAF / MEK / ERK تتالي، في نهاية المطاف اختيار النهج المناسبة لعلاج مختلف الأمراض التي يحركها RAF متحولة.

وتشمل أسرة سلاح الجو الملكي البريطاني ثلاثة أعضاء، CRAF، BRAF، وARAF، والتيلديها هياكل جزيئية مماثلة ولكن قدرات مختلفة لتنشيط المصب إشارة 1،2،3،4. من بين هذه paralogs، BRAF لديها أعلى نشاط بحكم الفسفوريةالمكونة لها NtA (N -terminal acidic) عزر12،13،14،في حين أن ARAF لديه أدنى النشاط الناشئ عن عزر ها غير الكنسي APE15. وهذا قد يفسر ترددات الطفرة المختلفة من PARALOGS RAF في الأمراض: BRAF>CRAF>ARAF. وعلاوة على ذلك، فإن الطفرات في مواقع مختلفة، في إطار نفس paralog RAF، قد تؤدي إلى إشارات في المصب بطريقة متميزة، مما يضيف طبقة أخرى من التعقيد إلى تنظيم الكيناس العائلية لسلاح الجو الملكي البريطاني. وقد أظهرت الدراسات الحديثة أن جميع kinases RAF لديها كل من الأنشطة الحفازة وallosteric13،14،16،17،18. يقوم متحولو سلاح الجو الملكي البريطاني النشطون بشكل تأسيسي بتشغيل الإشارات إلى المصب مباشرة عن طريق الفسفوريلات MEK، في حين يمكن لمسوخي سلاح الجو الملكي البريطاني الميتين تحويل نظرائهم من النوع البري من خلال التمتميّز من جانب إلى جنب وتفعيل إشارة MEK-ERK16 ،19،20. التقارب/ الاستقرار هو المعلمة الرئيسية التي لا تحدد فقط النشاط اللوستريك من متحولي سلاح الجو الملكي البريطاني kinase الميت ولكن أيضا يؤثر على النشاط الحفاز من متحولين سلاح الجو الملكي البريطاني النشطة المكونة15،21، 22.يمكن للمتحولين سلاح الجو الملكي البريطاني kinase الميت مع تقارب ديمر عالية / الاستقرار تحويل RAFs البرية من نوع الذاتية مباشرة15، في حين أن تلك مع تقارب ديمر المتوسطة / الاستقرار يتطلب تنسيق راس نشطة أو مستوى مرتفع من جزيئات سلاح الجو الملكي البريطاني من النوع البري لتعمل13،15،20،21،23. وبالمثل، فإن متحولي سلاح الجو الملكي البريطاني النشطين بشكل تأسيسي فوسفوريلات MEK بطريقة تعتمد على ديمر، وأولئك الذين يعانون من انخفاض التقارب/الاستقرار الخافت يفقدون نشاطهم الحفاز في المختبر على الترسيب المناعي الذي يكسر ضعف سلاح الجو الملكي البريطاني15، 21،22. كما يحدد التقارب/الاستقرار الخافت حساسية متحولي سلاح الجو الملكي البريطاني لمثبطاتهم، ويرتبط بشكل إيجابي بمقاومة مثبطات سلاح الجو الملكي البريطاني24. ولذلك، لتوصيف المتحولين RAF ذات الصلة بالأمراض، فمن الضروري لقياس أنشطتهم الحفازة واللوستريك، وتقارب/استقرار خافت.

في السنوات الأخيرة، وقد وضعت مختبرنا وغيرها من الطرق المختلفة لتوصيف kinases الأسرة سلاح الجو الملكي البريطاني والمتحولين بهم. وفقا لمختبرنا وتجربة الآخرين، ونحن نعتقد أن الاختبارات الثلاثة التالية لها مزايا في تعريف المتحولين RAF ذات الصلة بالأمراض: (1) اختبار كيناز في المختبر التي يمكن تنفيذها بسهولة للكشف عن النشاط الحفاز من المكونة نشط [رف] متحولات15; (2) وسلاح الجو الملكي البريطاني المشاركة في تفعيل التقوله الذي هو وسيلة موثوقة ومريحة لقياس النشاط اللوستريك من kinase القتلى RAF متحولين13،15،21،22،23، 25; (3) الفحص لوسيفيراز الانقسام المجاني الذي لديه حساسية أعلى بكثير في قياس تقارب والاستقرار قاتمة نسبيا من متحولي سلاح الجو الملكي البريطاني على النقيض من الفحص التقليدي المشترك للمناعة، وقادرة على تنفيذ دون معدات متقدمة في على النقيض من الأساليب التحليليةالكمية مثل SPR (S urface Plasmon Resonance) تحليل15،22. الجمع بين هذه الاختبارات الثلاثة، يمكننا أن نفهم بسهولة كيف أن متحولة RAF ذات الصلة بالأمراض يغير الإشارات المصب وبالتالي استخدام استراتيجية علاجية مناسبة لعلاج المرض الناجم عن هذه الطفرة RAF.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1. في المختبر كيناز الاختبار لقياس النشاط الحفاز لمسوخ سلاح الجو الملكي البريطاني

  1. بناء ناقلات ترميز متحولات RAF (الشكل1A) مع العلامة FLAG (DYKDDDDK) في C-terminus باستخدام جيبسون الجمعية أو أساليب الاستنساخ الجزيئي التقليدية.
    1. إدخال علامة FLAG والطفرات في تسلسلات الترميز RAF بواسطة PCRs، ثم قم بإدراج تسلسلات كاملة في متجه pCDNA3.1(+) باستخدام تجميع Gibson أو ربط الحمض النووي T4 واتباع بروتوكولات التصنيع. استخدم الشروط التالية لتفاعلات PCR: (1) 95 درجة مئوية، 2 دقيقة؛ (2) 95 درجة مئوية، 30 ق؛ (3) 59 درجة مئوية، 30 ق؛ (4) 68 درجة مئوية، 3 دقائق؛ (5) 20 دورة من (2 إلى 4)؛ (6) 4 درجة مئوية عقد.
      ملاحظة: التمهيديات PCR للاستنساخ: 5- AAATTAATACCTCACTATAGGGACCC-3 و 5-CAGCGTGTTTAAACGCCCTCTTA-3.
    2. إدراج تسلسل الترميز GST upstream من تسلسلات الترميز متحولة RAF لتوليد ناقلات ترميز مسوخ RAF GST-fused باستخدام نفس الأساليب كما هو موضح في الخطوة 1.1.1.
    3. التحقق من صحة جميع المتجهات بواسطة تسلسل الحمض النووي قبل التغوط.
  2. لوحة 293T الخلايا في لوحات 6-جيدا في كثافة 5 × 105 خلايا / جيدا يوم واحد قبل التغوط. عندما تصل كثافة الخلية إلى 80 ~ 90٪ التقاء في اليوم الثاني، transfect مع ناقلات ترميز العلم الموسومة RAF كيناز أو المسوخ الخاصة بهممن الخطوة 1.1 إلى الخلايا باتباع بروتوكول تصنيع أجهزة الانقاشف transfection (جدول المواد).
  3. استبدال وسط الثقافة 24 ساعة بعد الانعطاف.
  4. يستنشق الثقافة متوسّطة 48 [ه] بعد [ترّفكأيشن] وأضفت 400 [فل/ولّ] من [ليسس] احتياطيّة (25 [م] [تريس] · حمض الهيدروكلوريك، 150 مل كلوريد الصوديوم، 1 مل حمض الإثيلين ديامينتيراسيتيك (EDTA)، 0.25٪ NP-40، درجة الحموضة 7.2) تستكمل مع البروتياز ومثبطات الفوسفاتيز لخلايا الليس على الجليد.
    ملاحظة: تركيز NP-40 في العازلة تحلل أمر بالغ الأهمية للكشف عن النشاط الحفاز من متحولين سلاح الجو الملكي البريطاني مع تقارب معتدل dimer / الاستقرار في المختبر. تركيز عال من المنظفات أو المنظفات القوية في العازلة تحلل قد كسر ديمور RAF وبالتالي قتل النشاط الحفاز من kinases سلاح الجو الملكي البريطاني أو المتحولين.
  5. نقل lysates الخلية إلى أنبوب 1.5 مل، وتدور بنسبة 12،000 × ز لمدة 10 دقيقة في 4 درجة مئوية لاستنفاد حطام الخلية.
  6. نقل 300 درجة مئوية لكل عينة من lysates خلية كاملة نظيفة إلى أنابيب 1.5 مل، إضافة 20 درجة مئوية لكل عينة من الخرز التقارب المضادة للعلم، وتناوب في غرفة باردة (4 درجة مئوية) لمدة 1 ساعة. أيضا تأخذ 40 درجة مئوية لكل عينة من الليسات الخلية كاملة نظيفة جانبا للكشف عن التعبير والنشاط (phospho-ERK1/2) من متحولين سلاح الجو الملكي البريطاني من قبل المناعية كما هو موضح أدناه.
  7. غسل الخرز المضادة للعلم مرة واحدة مع العازلة lysis، ثم مرة واحدة مع حاجز رد الفعلكيناز (20 M HePES، 10 M M MgCl 2، 0.5 mM Na3VO4،0.5 mM DTT، درجة الحموضة 7.2)، وإضافة 20 ميكرولتر من خليط رد الفعل كيناز (2 ميكروغرام من MEK1 (K97A) و 100 ميكرومتر ATP في 20 ميكرولتر من kinase re المخزن المؤقت للإجراء) لكل عينة.
    ملاحظة: يجب أن تكتمل غسل الخرزة بلطف وبسرعة، يجب أن يستنشق المخزن المؤقت المتبقي تماما قبل إضافة خليط رد الفعل kinase، وينبغي أن تنفذ جميع العمليات في هذه الخطوة في 4 درجة مئوية في غرفة باردة.
  8. احتضان ردود الفعل كيناز في درجة حرارة الغرفة (25 درجة مئوية) لمدة 10 دقائق، والوجه الأنابيب التي تحتوي على ردود الفعل كيناز مع الأصابع كل دقيقة أخرى أثناء الحضانة.
  9. إضافة 5 ميكرولتر من المخزن المؤقت نموذج SDS 5x (375 mM Tris· حمض الهيدروكلوريك، 9٪ كبريتات دودسيل الصوديوم (SDS)، 50٪ الجلسرين، 0.03٪ بروموفينول الأزرق) لكل عينة لوقف تفاعلات كيناز، ومن ثم تسخين العينات في 90 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
  10. تشغيل العينات في 9 ~ 12٪ بولياكريلاميد هلام الكهربائي (PAGE) مع 0.1٪ SDS، ونقل البروتينات إلى غشاء النيتروسيلولوز، والكشف عن مستويات فوسفو-MEK وRAF المسوخ في عينات من قبل المناعية.
    ملاحظة: ويمكن أيضا ً تحديد كمية phospho-MEK باستخدام γ32P-ATP التأسيس. باختصار، يتم إضافة 10 μM γ32P-ATP إلى المخزن المؤقت لرد الفعل kinase، ثم يتم قياس كمية MEK الفوسفورية بعد فصل PAGE باستخدام التصوير الشعاعي التلقائي القياسي أو التصوير الفوسفوري أو تقنيات عد التلألؤ السائل كما المناسبه.

2. سلاح الجو الملكي البريطاني المشاركة في تفعيل التقييم للنشاط اللوستريك من Kinase القتلى RAF المسوخ

  1. بناء ناقلات ترميز المتلقي RAF (CRAF المجال كيناز مع عزر NtA غير فوسفوريلابل، AAFF) أو المنشطات سلاح الجو الملكي البريطاني kinase الميت (سلاح الجو الملكي البريطاني المجال kinase مع الفسفور تقليد NtA عزر، SSDD، DDEE أو DGEE) (الشكل1A)كما الموضحة في الخطوة 1.1.
  2. خلايا Transfect 293T مع اثنين من المتجهات ترميز كل من المتلقي RAF والمنشط RAF kinase الميت أو ترميز ناقلات واحدة من البروتينات كما هو موضح في الخطوتين 1.2 و 1.3.
  3. استبدال وسط الثقافة في 24 ساعة بعد التغوط، وحصاد 293T transfectants في 48 ساعة لإعداد lysates الخلية بأكملها كما هو موضح في الخطوتين 1.4 و 1.5.
  4. يُمزج اللمعة الخلوية الكاملة النظيفة مع المخزن المؤقت للعينة SDS بمعدل 5 x بسرعة في درجة حرارة الغرفة (25 درجة مئوية) ثم يغلي عند 90 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
  5. تشغيل عينات الليسات الخلية الكاملة المسلوقة في 9 ~ 12٪ الصفحة مع 0.1٪ SDS، ونقل البروتينات إلى غشاء النيتروسيلولوز، والكشف عن مستويات فوسفو-ERK1/2 والبروتينات السيطرة من قبل المناعة.

3. مسح مجاني سبليت لوسيفيراز لقياس التقارب ديمر النسبية / الاستقرار من متحولي سلاح الجو الملكي البريطاني

  1. بناء ناقلات ترميز العلم الموسومة RAF المسوخ تنصهر إلى N-terminus من نلوك (N-terminus من لوسيفيراز اليراعة، aa2-416) أو C-terminus Cluc (C-terminus من لوسيفيراز اليراعة، aa398-550) كما هو موضح في الخطوة 1.1.
  2. Transfect 293T الخلايا مع زوج من المتجهات ترميز مختلف المسوخ Nluc-RAF والمتحولين Cluc-RAF كما هو موضح في الخطوة 1.2.
  3. في 24 ح بعد الإنحراف، لوحة 293T خلية transfectants في لوحات صورة سوداء كريستال في كثافة الخلية من 2X105 في بئر مع متوسط خال من الألوان (أي، DMEM دون الفينول الأحمر).
  4. 24 ح في وقت لاحق، إضافة D-لوسيفيرين (0.2 ملغ / مل) إلى 293T transfectants الخلية، وحضانة لمدة 30 دقيقة، وقياس إشارات لوسيفيراز باستخدام نظام الكشف المتعدد (جدولالمواد).
  5. بعد قياس إشارات لوسيفيراز، يستنشق الترانسفيكتات المتوسطة والليس 293T مع العازلة الليسيس لإعداد الليسات الخلية بأكملها كما هو موضح في الخطوتين 1.4 و 1.5.
  6. تشغيل عينات lysate الخلية بأكملها في 9 ~ 12٪ الصفحة مع 0.1٪ SDS والكشف عن مستويات التعبير من المسوخ Nluc-RAF والمسوخ Cluc-RAF من قبل المضادة للعلم المناعية كما هو موضح في الخطوة 2.5. يتم تحديد مستويات التعبير النسبي لكل من متحولة Nluc-RAF ومتحولة Cluc-RAF في 293T transfectants باستخدام الصورة J من مناعتهم.
  7. تطبيع إشارات لوسيفيراز من transfectants الخلية 293T وفقا لمستويات التعبير من المسوخ Nluc-RAF والمسوخ Cluc-RAF. وباختصار، يتحقق ذلك عن طريق تقسيم إشارة لوسيفيراز الخام عن طريق مستويات التعبير النسبي للمتحولين Nluc-RAF والمتحولين Cluc-RAF من الخطوة 3.6.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

لدى أسرة سلاح الجو الملكي البريطاني أنشطة محفزة وألوستريك على حد سواء، والتي تمكن المتحولين المرتبطين بالأمراض من تشغيل المصب الإشارات من خلال آليات مختلفة13،14،16،17 ،18. إن متحولي سلاح الجو الملكي البريطاني النشطين بشكل مباشر يقومون بالفوسفور على ركائزهم، في حين أن متحولي سلاح الجو الملكي البريطاني الذين ماتوا من كيناز يقومون بعملهم من خلال إعادة تنشيط نظرا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

في هذه المقالة، قدمنا ثلاث طرق لوصف المتحولين RAF ذات الصلة بالأمراض، والتي تشمل في المختبر اختبار كيناز، وسلاح الجو الملكي البريطاني اختبار التنشيط المشترك، ومجانية انقسام لوسيفيراز اختبار. وبما أن كيناز سلاح الجو الملكي البريطاني لها نشاط حفاز ونشاط أللوستريك على حد سواء، يمكن لمختلف المسوخ سلاح الجو الملكي البريطاني تنشيط الإشارات النهائية من خلال آليتين متميزتين13،14،16،17،

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ويعلن صاحبا البلاغ أنهما ليس لديهما مصالح مالية متنافسة.

شكر وتقدير

ويود المؤلفان أن يعترفا بزمالة سرطان الدم في الخلايا المشعرة لدعم يوان جيمين. وقد تم دعم هذا العمل من قبل صندوق آسيا لبحوث السرطان (AFCR2017/2019-JH)، وجائزة دوك-نوس خو لجسر التمويل (Duke-NUS-KBrFA/2018/0014)، والمنحة الانتقالية لـ NCCRF (NCCRF-YR2018-JUL-BG4)، والمنحة التجريبية لـ NCCRF (NCCRF-YR2017-JUL-PG3)، والطب الأكاديمي SHF منحة بحثية (AM/TP011/2018).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
تقنيات إشارات الخلايا المضادة للفوسفو ERK1 / 24370
تقنيات إشارات الخلية المضادة للفوسفو MEK1 / 29154
مكافحة ERK1 / 2AB النسيليةA0229
المضادة ل MEK1 / 2تقنيات إشارات الخلية9124
مضادة ل FLAG (الماوس)Sigma-AldrichF3165
مضاد ل HANovus BiologicalsMAB6875
إشارات الخليةالمضادة ل FLAG (الأرنب)14793
المضادة للبيتاSigma-AldrichA2228
الخرز المضادة ل FLAG (M2)Sigma-AldrichA4596
مختبراتIgG Jackson المترافقة المضادة للفأرHRP 115-035-003
HRP مترافقة مختبرات IgG Jackson المضادة للأرانب111-035-144
pcDNA3.1 (+)في الجسم الزجاجيV79020
جيبسون الجمعية الاستنساخ   ؛ كيتنيو إنجلاند بيولابسE5510
T4 الحمض النووي ليجاسنيو إنجلاند بيولابسM0202
ليبوفيكتامين 2000إنفيتروجين11668019
فوجين 6روش11 814 443 001
DMEM بدون فينول أحمرInvitrogen21063-029
D-luciferin GoldBioLUCK-100
6xhis-tagged MEK1 (K97A)  أعدت في دراساتنا السابقةN.A.المرجع 15.
نظام الكشف GloMax-Multi.بروميجاE7041
تقنيات

المراجع

  1. Chong, H., Vikis, H. G., Guan, K. L. Mechanisms of regulating the Raf kinase family. Cellular Signalling. 15 (5), 463-469 (2003).
  2. Wellbrock, C., Karasarides, M., Marais, R. The RAF proteins take center stage. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 5 (11), 875-885 (2004).
  3. Baccarini, M. Second nature: biological functions of the Raf-1 "kinase". FEBS Letter. 579 (15), 3271-3277 (2005).
  4. Lavioe, H., Therrien, M. Regulation of RAF protein kinases in ERK signaling. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 16 (5), 281-298 (2015).
  5. Schreck, R., Rapp, U. R. Raf kinases: oncogenesis and drug discovery. International Journal of Cancer. 119 (10), 2261-2271 (2006).
  6. Roberts, P. J., Der, C. J. Targeting the Raf-MEK-ERK mitogen-activated protein kinase cascade for the treatment of cancer. Oncogene. 26 (22), 3291-3310 (2007).
  7. McCubrey, J. A., et al. Roles of the Raf/MEK/ERK pathway in cell growth, malignant transformation and drug resistance. Biochemistry Biophysics Acta. 1773 (8), 1263-1284 (2007).
  8. Schubbert, S., Shannon, K., Bollag, G. Hyperactive Ras in developmental disorders and cancer. Nature Reviews Cancer. 7 (4), 295-308 (2007).
  9. Davies, H., et al. Mutations of the BRAF gene in human cancer. Nature. 417 (6892), 949-954 (2002).
  10. Garnett, M. J., Marais, R. Guilty as charged: B-RAF is a human oncogene. Cancer Cell. 6 (4), 313-319 (2004).
  11. Pandit, B., et al. Gain-of-function RAF1 mutations cause Noonan and LEOPARD syndromes with hypertrophic cardiomyopathy. Nature Genetics. 39 (8), 1007-1012 (2007).
  12. Mason, C. S., Springer, C. J., Cooper, R. G., Superti-Furga, G., Marshall, C. J., Marais, R. Serine and tyrosine phosphorylations cooperate in Raf-1, but not B-Raf activation. EMBO Journal. 18 (8), 2137-2148 (1999).
  13. Hu, J., et al. Allosteric activation of functionally asymmetric RAF kinase dimers. Cell. 154 (5), 1036-1046 (2013).
  14. Desideri, E., Cavallo, A. L., Baccarini, M. Alike but different: RAF paralogs and their signaling outputs. Cell. 161 (5), 967-970 (2015).
  15. Yuan, J., et al. The dimer-dependent catalytic activity of RAF family kinases is revealed through characterizing their oncogenic mutants. Oncogene. 37 (43), 5719-5734 (2018).
  16. Wan, P. T., et al. Mechanism of activation of the RAF-ERK signaling pathway by oncogenic mutations of B-RAF. Cell. 116 (6), 855-867 (2004).
  17. Shaw, A. S., Kornev, A. P., Hu, J., Ahuja, L. G., Taylor, S. S. Kinases and pseudokinases: lessons from RAF. Molecular and Cellular Biology. 34 (9), 1538-1546 (2014).
  18. Taylor, S. S., Shaw, A. S., Hu, J., Meharena, H. S., Kornev, A. P. Pseudokinases from a structural perspective. Biochemistry Society Transactions. 41 (4), 981-986 (2013).
  19. Rajakulendran, T., Sahmi, M., Lefrançois, M., Sicheri, F., Therrien, M. A dimerization-dependent mechanism drives RAF catalytic activation. Nature. 461 (7263), 542-545 (2009).
  20. Heidorn, S. J., et al. Kinase-dead BRAF and oncogenic RAS cooperate to drive tumor progression through CRAF. Cell. 140 (2), 209-221 (2010).
  21. Yuan, J., et al. Activating mutations in MEK1 enhance homodimerization and promote tumorigenesis. Science Signaling. 11 (554), 6795(2018).
  22. Yuan, J., et al. The AMPK inhibitor overcomes the paradoxical effect of RAF inhibitors through blocking phospho-Ser-621 in the C terminus of CRAF. Journal of Biological Chemistry. 293 (37), 14276-14284 (2018).
  23. Hu, J., et al. Kinase regulation by hydrophobic spine assembly in cancer. Molecular and Cellular Biology. 35 (1), 264-276 (2015).
  24. Poulikakos, P., et al. RAF inhibitor resistance is mediated by dimerization of aberrantly spliced BRAF(V600E). Nature. 480 (7377), 387-390 (2011).
  25. Hu, J., et al. Mutation that blocks ATP binding creates a pseudokinase stabilizing the scaffolding function of kinase suppressor of Ras, CRAF and BRAF. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (15), 6067-6072 (2011).
  26. Taylor, S. S., Kornev, A. P. Protein kinases: evolution of dynamic regulatory proteins. Trends Biochemistry Sciences. 36 (2), 65-77 (2011).
  27. Farrar, M. A., Alberol-Ila, J., Perlmutter, R. M. Activation of the Raf-1 kinase cascade by coumermycin-induced dimerization. Nature. 383 (6596), 178-181 (1996).
  28. Luo, Z., Tzivion, G., Belshaw, P. J., Vavvas, D., Marshall, M., Avruch, J. Oligomerization activates c-Raf-1 through a Ras-dependent mechanism. Nature. 383 (6596), 181-185 (1996).
  29. Weber, C. K., Slupsky, J. R., Kalmes, H. A., Rapp, U. R. Active Ras induces heterodimerization of cRaf and BRaf. Cancer Research. 61 (9), 3595-3598 (2001).
  30. Garnett, M. J., Rana, S., Paterson, H., Barford, D., Marais, R. Wild-type and mutant B-RAF activate C-RAF through distinct mechanisms involving heterodimerization. Molecular Cell. 20 (6), 963-969 (2005).
  31. Hatzivassiliou, G., et al. RAF inhibitors prime wild-type RAF to activate the MAPK pathway and enhance growth. Nature. 464 (7287), 431-435 (2010).
  32. Poulikakos, P. I., Zhang, C., Bollag, G., Shokat, K. M., Rosen, N. RAF inhibitors transactivate RAF dimers and ERK signalling in cells with wild-type BRAF. Nature. 464 (7287), 427-430 (2010).
  33. Kolch, W. Meaningful relationships: the regulation of the Ras/RAF/MEK/ERK pathway by protein interactions. Biochemistry Journal. 351, Pt 2 289-305 (2000).
  34. Cseh, B., Doma, E., Baccarini, M. "RAF" neighborhood: protein-protein interaction in the Raf/Mek/Erk pathway. FEBS Letters. 588 (15), 2398-2406 (2014).
  35. García-Gómez, R., Bustelo, X. R., Crespo, P. Protein-Protein Interactions: Emerging Oncotargets in the RAS-ERK Pathway. Trends Cancer. 4 (9), 616-633 (2018).
  36. Luker, K. E., Smith, M. C., Luker, G. D., Gammon, S. T., Piwnica-Worms, H., Piwnica-Worms, D. Kinetics of regulated protein–protein interactions revealed with firefly luciferase complementation imaging in cells and living animals. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (33), 12288-12293 (2004).
  37. Chen, S. H., et al. Oncogenic BRAF deletions that function as homodimers and are sensitive to inhibition by RAF dimer inhibitor LY3009120. Cancer Discovery. 6 (3), 300-315 (2016).
  38. Foster, S. A., et al. Activation mechanism of oncogenic deletion mutations in BRAF, EGFR, and HER2. Cancer Cell. 29 (4), 477-493 (2016).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

RAF GST
تميز المسوخ ذات الصلة بالأمراض من Kinases الأسرة سلاح الجو الملكي البريطاني باستخدام مجموعة من الأساليب العملية والممكنة
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.