يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

في فيفو الفلورة المناعية توطين لتقييم التوزيع الحيوي للجسم المضاد العلاجي والتشخيصي في أبحاث السرطان

9K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/59810

⸱

سبتمبر 16, 2019

 , 
1Apoptosis, Cancer and Development Laboratory - Equipe labellisée 'La Ligue', LabEx DEVweCAN, Centre de Cancérologie de Lyon, INSERM U1052-CNRS UMR5286, Centre Léon Bérard, 2Department of Radiology/Molecular Imaging Program at Stanford, School of Medicine, Stanford University

في هذه المقالة

ملخص

يمكن استخدام طريقة توطين المناعة في الجسم الحي (IVIL) لفحص في التوزيع البيولوجي في الجسم الحي للأجسام المضادة وكدمات الأجسام المضادة لأغراض الأورام في الكائنات الحية باستخدام مزيج من استهداف الورم في الجسم الحي وتلطيخ المناعة في الجسم الحي اساليب.

الملخص

الأجسام المضادة أحادية النسيلة (mAbs) هي أدوات هامة في الكشف عن السرطان وتشخيصه وعلاجه. وهي تستخدم لكشف دور البروتينات في تكوين الأورام، ويمكن توجيهها إلى العلامات الحيوية للسرطان تمكين الكشف عن الورم والتوصيف، ويمكن استخدامها لعلاج السرطان كما mAbs أو الأجسام المضادة للأدوية المتقارنة لتنشيط الخلايا المُنفِّذة المناعية، لمنع إشارات مسارات، أو قتل مباشرة الخلايا التي تحمل مستضد معين. على الرغم من التقدم السريري في تطوير وإنتاج mAbs جديدة ومحددة للغاية، يمكن أن تضعف التطبيقات التشخيصية والعلاجية من تعقيد وعدم تجانس البيئة الدقيقة الورم. وهكذا، لتطوير العلاجات والتشخيصات الفعالة القائمة على الأجسام المضادة، من الأهمية بمكان تقييم التوزيع الحيوي والتفاعل بين المتقارن القائم على الأجسام المضادة مع البيئة الدقيقة للورم الحي. هنا، ونحن نصف في فيفو الفلورة توطين (IVIL) كنهج جديد لدراسة تفاعلات العلاجات القائمة على الأجسام المضادة والتشخيص في الظروف الفسيولوجية والمرضية في الجسم الحي. في هذه التقنية، يتم حقن جسم مضاد علاجي أو تشخيصي خاص بالمستضد عن طريق الوريد في الجسم الحي والجسم الحي السابق المترجم مع جسم مضاد ثانوي في أورام معزولة. وبالتالي، فإن IVIL يعكس التوزيع البيولوجي في الجسم الحي للأدوية المضادة وعوامل الاستهداف. ويرد وصف اثنين من تطبيقات IVIL تقييم التوزيع البيولوجي وإمكانية الوصول إلى عوامل التباين المستندة إلى الأجسام المضادة للتصوير الجزيئي لسرطان الثدي. سيسمح هذا البروتوكول للمستخدمين المستقبليين بتكييف طريقة IVIL لتطبيقات البحوث المستندة إلى الأجسام المضادة الخاصة بهم.

المقدمة

الأجسام المضادة أحادية النسيلة (mAb) هي بروتينات سكرية كبيرة (حوالي 150 كيلودا) من الأسرة الفائقة المناعية التي تفرزها الخلايا B ولها وظيفة أولية في الجهاز المناعي لتحديد وتمنع إما الوظيفة البيولوجية، أو علامة ل تدمير، ومسببات الأمراض البكتيرية أو الفيروسية، ويمكن التعرف على التعبير البروتين غير طبيعي على الخلايا السرطانية1. الأجسام المضادة يمكن أن يكون لها تقارب عالية للغاية إلى epitopes محددة وصولا الى تركيزات femtomolar مما يجعلها أدوات واعدة للغاية في الطب الحيوي2. مع تطوير تكنولوجيا الهجن من قبل ميلشتاين وKöhler (منحت جائزة نوبل في عام 1984)، أصبح إنتاج mAbs ممكن3. في وقت لاحق، تم إنشاء mAbs الإنسان باستخدام تكنولوجيا عرض phage أو سلالات الماوس المعدلة وراثيا وأحدثت ثورة في استخدامها كأدوات بحثية جديدة والعلاج4،5.

السرطان هو قضية صحية في جميع أنحاء العالم وسبب رئيسي للوفاة خلق الحاجة إلى نهج جديدة للوقاية والكشف والعلاج6. وحتى الآن، سمح الـ mAbs باستخراج دور الجينات وبروتيناتها في تكوين الأورام، وعندما تكون موجهة ضد العلامات الحيوية للسرطان، يمكن أن تمكن من الكشف عن الأورام وتحديد خصائص طبقات المريض. لعلاج السرطان، يتم تطوير mAbs ثنائية محددة، وكدمات الأجسام المضادة للمخدرات، وشظايا الأجسام المضادة أصغر كعلاجات، ولتسليم المخدرات المستهدفة لتعزيز الفعالية العلاجية7. بالإضافة إلى ذلك، تعمل الأجسام المضادة لاستهداف العلامات الحيوية لعوامل التباين لطرائق التصوير الجزيئي مثل الجراحة الموجهة بالفلورة، والتصوير الصوتي الضوئي (PA)، والتصوير الجزيئي بالموجات فوق الصوتية (الولايات المتحدة)، وانبعاث البوزيترون المستخدم سريرياً التصوير المقطعي (PET) أو انبعاث فوتون واحد التصوير المقطعي المحوسب (SPECT)8. وأخيرا، يمكن أيضا استخدام الأجسام المضادة كعوامل ثيرانوستيك تمكين الطبقية من المرضى ورصد الاستجابة للعلاجات المستهدفة9. ولذلك، بدأت mAbs رواية تلعب دورا حاسما في الكشف عن السرطان، والتشخيص، والعلاج.

على الرغم من التقدم الحاسم في تطوير وإنتاج mAbs جديدة ومحددة للغاية، يمكن أن تصبح التطبيقات التشخيصية والعلاجية غير فعالة بسبب تعقيد بيئة الورم. تفاعلات الأجسام المضادة تعتمد على نوع الظهارة،أي، سواء كان خطيًا أو توافقيًا10. بالإضافة إلى الاعتراف بالمستضدات ، تحتاج الأجسام المضادة إلى التغلب على الحواجز الطبيعية مثل جدران الأوعية ، والأغشية القاعدية ، والورم ستروما للوصول إلى الخلايا المستهدفة التي تعبر عن المستضد. الأجسام المضادة تتفاعل مع الأنسجة ليس فقط من خلال متغير جزء مستضد ملزم (فاب) المجال ولكن أيضا من خلال جزء بلوري ثابت (Fc) مما يؤدي كذلك إلى التفاعلات خارج الموقع11. كما أن الاستهداف معقد بسبب التعبير غير المتجانس لعلامات الورم في جميع أنحاء الجزء الأكبر من الورم وعدم التجانس في الأوعية الدموية الورم ية ونظام اللمفاويات12،13. وبالإضافة إلى ذلك، يتكون الورم microenvironment من الخلايا الليفية المرتبطة بالسرطان التي تدعم الخلايا السرطانية، والخلايا المناعية الورم التي تقمع ردود الفعل المناعية المضادة للورم، والبطانة الورم الذي يدعم نقل الأكسجين والمواد الغذائية، وجميع التي تتداخل مع اختراق وتوزيع وتوافر العلاجات القائمة على الأجسام المضادة أو التشخيص. بشكل عام، يمكن أن تحد هذه الاعتبارات من الفعالية العلاجية أو التشخيصية، والحد من استجابة العلاج، وقد تؤدي إلى مقاومة الورم.

لذلك، لتطوير العلاجات والتشخيصات الفعالة القائمة على الأجسام المضادة، من الأهمية بمكان تقييم التوزيع الحيوي والتفاعل بين المتقارن القائم على الأجسام المضادة داخل البيئة الدقيقة للورم. حاليا، في الدراسات ما قبل السريرية، يتم تحليل التعبير علامة في نماذج البحوث الورم في الجسم الحي السابق عن طريق الفلورة المناعية (IF) تلطيخ أقسام الورم14. يتم تنفيذ تلطيخ IF القياسية مع الأجسام المضادة الأولية محددة علامة والتي يتم تسليط الضوء عليها بعد ذلك من قبل الأجسام المضادة الثانوية وصفت الفلورسنت على شرائح الأنسجة الورم ية في الجسم الحي السابق التي تم عزلها عن الحيوان. تسلط هذه التقنية الضوء على الموقع الثابت للعلامة في وقت تثبيت الأنسجة ولا توفر نظرة ثاقبة حول كيفية توزيع أو تفاعل العلاجات أو التشخيصات المستندة إلى الأجسام المضادة في الظروف الفسيولوجية. التصوير الجزيئي من قبل PET، SPECT، الولايات المتحدة، والسلطة الفلسطينية يمكن أن توفر معلومات حول توزيع عامل التباين الأجسام المضادة المترافقة في النماذج الحية قبل السريرية8،15. وبما أن طرائق التصوير هذه غير غازية، يمكن إجراء دراسات طولية، كما يمكن جمع بيانات حساسة للوقت مع الحد الأدنى من عدد الحيوانات لكل مجموعة. ومع ذلك، هذه النهج التصوير الجزيئي غير الغازية ليست حساسة بما فيه الكفاية وليس لديها ما يكفي من القرار لتوطين توزيع الأجسام المضادة على المستوى الخلوي. بالإضافة إلى ذلك ، قد يتم تغيير الخصائص الفيزيائية والبيولوجية للجسم المضاد الأولي بشكل جذري عن طريق اقتران عامل التباين16.

من أجل أخذ الظروف الفسيولوجية والمرضية في الجسم الحي في الاعتبار كيفية تفاعل العلاجات والتشخيصات القائمة على الأجسام المضادة داخل بيئة الورم والحصول على توزيع خلوي عالي الدقة وحتى دون الخلوية ملامح الأجسام المضادة غير المترافقة، نقترح نهج IF، يعتبر في توطين المناعة في الجسم الحي (IVIL)، الذي يتم حقن الأجسام المضادة الخاصة بالمستضد عن طريق الوريد في الجسم الحي. وينتقل العلاج أو التشخيص القائم على الأجسام المضادة، الذي يعمل كجسم مضاد أساسي، في الأوعية الدموية الوظيفية ويربط بالبروتين المستهدف في بيئة الورم الحية الدقيقة للغاية. بعد عزل الأورام التي تحمل اسم الجسم الحي مع الأجسام المضادة الأولية، يتم استخدام جسم مضاد ثانوي لتوطين الكدمات المتراكمة والاحتفاظ بها. هذا النهج يشبه نهج علم الأنسجة IF وصفها سابقا حقن الأجسام المضادة المسمى الفلورسنت17. على الرغم من هنا، فإن استخدام الأجسام المضادة غير المترافقة يتجنب التغيير المحتمل في خصائص التوزيع البيولوجي الناجم عن تعديل الأجسام المضادة. وعلاوة على ذلك، فإن تطبيق الجسم الحي السابق للجسم المضاد الثانوي الفلورسنت يتجنب احتمال فقدان إشارة الفلورة أثناء جمع الأنسجة ومعالجتها ويوفر تضخيم كثافة إشارة الفلورة. يعكس نهج وضع العلامات لدينا في التوزيع البيولوجي في الجسم الحي للأدوية المستندة إلى الأجسام المضادة والعوامل المستهدفة ويمكن أن يوفر رؤى هامة لتطوير عوامل تشخيصية وعلاجية جديدة.

هنا، نقوم بوصف تطبيقين لطريقة IVIL كما تم تطبيقها في الدراسات السابقة التي تحقق في التوزيع البيولوجي وإمكانية الوصول إلى عوامل التباين المستندة إلى الأجسام المضادة لطرق التصوير الجزيئي للكشف عن سرطان الثدي. أولاً، التوزيع الحيوي لصبغة الأشعة تحت الحمراء القريبة من الأجسام المضادة (الأجسام المضادة للأشعة تحت الحمراء- H3 المرتبطة بصبغة الفلورة بالأشعة تحت الحمراء القريبة، والأخضر الإندوذيانين، وB7-H3-ICG) وعامل التحكم في نوع الإيزوتايب (Iso-ICG) للفلورة والجزيئية الصوتية الضوئية يتم استكشاف التصوير18. يتم وصف أسلوب هذا التطبيق في البروتوكول. بعد ذلك، يتم تحديد نتائج التوزيع الحيوي لجسم مضاد حساس بشكل متزامن إلى netrin-1، عادة لا يمكن الكشف عنها مع التصوير IF التقليدي، المستخدم مع التصوير الجزيئي بالموجات فوق الصوتية، ويتم عرضها في النتائج التمثيلية19. في ختام هذه الورقة البروتوكول، يجب أن يشعر القراء بالراحة اعتماد طريقة IVIL لتطبيقات البحوث المستندة إلى الأجسام المضادة الخاصة بهم.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

تمت الموافقة على جميع الطرق الموضحة هنا من قبل الفريق الإداري المؤسسي المعني بالعناية بالحيوانات المختبرية (APLAC) من جامعة ستانفورد.

1. نموذج الماوس المعدلة وراثيا لتطوير سرطان الثدي

  1. مراقبة الفئران من نموذج السرطان المطلوب لنمو الورم المناسب عن طريق قياس الجس أو الفرجار قبل المضي قدما.
    ملاحظة: هنا، تم استخدام نموذج المورين المعدلة وراثيا من تطوير سرطان الثدي (FVB / N-Tg (MMTV-PyMT) 634Mul/J) (MMTV-PyMT). هذه الحيوانات تلقائيا تطوير سرطان الثدي الغازية بين 6 و 12 أسبوعا من العمر في كل غدة الثدي20. وقد استخدمت الغدد الثديية الطبيعية كضوابط من القمامة عبر الجينات السلبية، ومطابقة العمر.

2. الحقن الوريدي لعوامل الأجسام المضادة محددة وغير محددة

  1. تنقية الأرنب المضادة للماوس B7-H3 والأرنب IgG الأجسام المضادة للتحكم isotype على عمود إزالة الأملاح (على سبيل المثال، PD-10) لإزالة المواد الحافظة ومخازن التخزين المؤقتة بعد تعليمات الشركة المصنعة.
    ملاحظة: قد تحتاج بعض الأجسام المضادة إلى مزيد من التنقية مع الخرز البروتين-A أغاروز على أساس بروتوكول21.
  2. جرعات Aliquot من 33 ميكروغرام من كل جسم مضاد متقارن في أنابيب الطرد المركزي الصغيرة الفردية.
    ملاحظة: الجرعة من وكيل تدار قد تختلف اعتماداً على التطبيق ويطابق الجرعات التي يتم استخدام conjugate الأجسام المضادة بشكل روتيني. مطلوب تركيز حلول الأجسام المضادة إذا كان حجم أكثر من 100 درجة مئوية لسلامة الحيوان.
  3. في النقطة الزمنية المطلوبة قبل جمع الأنسجة، هنا 96 ح، التخدير الحيوان تحمل الورم مع 2٪ isoflurane تتدفق في الأكسجين في 2 L / دقيقة، ووضع على مرحلة ساخنة 37 درجة مئوية. قم بقرصة اصبع القدم للتأكد من الوصول إلى المستوى المناسب من التخدير قبل الإجراء.
  4. للتحضير لتلقيح الوريد الذيل من حلول الأجسام المضادة، وتطهير ذيل الحيوان عن طريق مسح ثلاث مرات مع مسح الكحول. تمدد الأوردة التيل عن طريق الاحترار مع وسادة الحرارة لمدة 30 s. تجنب تسخين الحيوان بأكمله. مسح الذيل مرة أخرى مع مسح الكحول بعد إزالة وسادة الحرارة.
  5. باستخدام قسطرة الوريد الذيل 27G، أدخل إبرة الفراشة في واحدة من الأوردة ذيل الجانبية اثنين وإصلاح بعناية الذيل مع إبرة إدراجها إلى المرحلة مع قطعة من الشريط الجراحي.
    ملاحظة: يشير تدفق الدم المرئي إلى القسطرة إلى الموقع الصحيح للإبرة داخل الوريد الذيل.
  6. اغسل القسطرة بـ 25 ميكرولتر من محلول ملحي معقم من الفوسفات (PBS)، ثم قم بحقن محلول الأجسام المضادة في القسطرة باستخدام محاقن الأنسولين. اغسل القسطرة مرة أخرى بـ 25 ميكرولتر من PBS المعقمة.
  7. إزالة الإبرة من الذيل وتطبيق الضغط لوقف أي نزيف.
  8. إيقاف التخدير ومراقبة الحيوان حتى مستيقظا تماما عن أي علامات الشدة.

3. جمع وإعداد أنسجة الورم المستهدفة

  1. في النقطة الزمنية المطلوبة، قتل الحيوان إنسانيا وفقا للإجراء المؤسسي المقبول، هنا، عن طريق الاستنشاق التدريجي ل100٪ من ثاني أكسيد الكربون2 من خزان غاز مضغوط مع معدل تدفق الإزاحة غرفة من 10-30٪ حجم / دقيقة.
    ملاحظة: تتطلب بعض تطبيقات تقنية IVIL القتل الرحيم عن طريق التسريب القلبي مع PBS لإزالة الأجسام المضادة المتداولة بحرية19،22.
  2. بعد تأكيد القتل الرحيم الإنساني عن طريق وقف الحركة التنفسية والقلبية، وعدم استجابة قرصة اصبع القدم، والرمادي من الأغشية المخاطية، وأنسجة الورم المكوس باستخدام مقص الجراحية والملقط على النحو التالي:
    1. وضع الماوس في موقف supine واستيعاب فقط الطبقة الخارجية من الجلد بين مجموعة من الغدد الثديية الأقرب إلى الذيل (5ال)مع ملقط، وجعل شق صغير مع زوج من مقص الجراحية.
    2. إدخال مقص مغلق في قطع وفتح ببطء غيض لفصل الجلد بعناية من غشاء جدار البطن الكامنة الحفاظ على سليمة.
    3. إجراء شق عمودي في البطن، والاستمرار في فصل الجلد عن الغشاء الداخلي. بينالغدد الثديية الثالثة والرابعة، قم بإجراء قطع أفقي عبر البطن للسماح بتراجع الجلد وتصور الغدد الثديية.
      ملاحظة: تقع الأورام والغدد الثديية بشكل سطحي تحت الجلد.
    4. فهم كل ورم أو غدة طبيعية مع ملقط، وتقليم بعناية بعيدا الجلد المرفقة باستخدام مقص الجراحية.
  3. وضع الأنسجة المقتطعة في قوالب قاعدة الأنسجة القابل للتصرف، والمسمى مسبقا ومليئة درجة الحرارة القطع الأمثل (OCT) تضمين المتوسطة وتجميد القوالب بسرعة عن طريق وضع على الجليد الجاف. من أجل دراسة التسليم خارج الهدف، استئصال الأنسجة الأخرى أو الأجهزة ذات الأهمية(علىسبيل المثال، الكبد أو الرئتين).
    ملاحظة: لإيقاف البروتوكول مؤقتاً عند هذه النقطة تخزين كتل الأنسجة المجمدة في -80 درجة مئوية حتى تصبح جاهزة للمتابعة.
  4. باستخدام cryostat، قسم كتل الأنسجة المجمدة في سمك 10 درجة مئوية ووضع المقاطع المجاورة على الشرائح الزجاج التصاق المسمى مسبقا.
    ملاحظة: لإيقاف البروتوكول مؤقتاً عند هذه النقطة تخزين الشرائح في -80 درجة مئوية حتى جاهزة للمتابعة.

4. السابقين بروتوكول تلطيخ الجسم الحي

ملاحظة: للمقارنة الكمية بين الصور المجهرية الفلورية، يتم تلوين كافة الشرائح في نفس الوقت مع نفس الحلول المعدة.

  1. شطف الشرائح الأنسجة المجمدة مع درجة حرارة الغرفة PBS لمدة 5 دقائق لإزالة OCT.
  2. إزالة حدود أقسام الأنسجة مع قلم حاجز كاره للماء للحد من حجم الحلول اللازمة أثناء تلطيخ.
    ملاحظة: يجب الحرص على عدم السماح للقلم لتشغيل أكثر من عينات الأنسجة كما أنه قد إما إزالة الأنسجة من الشريحة أو منع تلطيخ السليم على جزء الأنسجة المتأثرة. لا تسمح لأقسام الأنسجة بالجفاف في أي وقت.
  3. إصلاح أقسام الأنسجة مع 4٪ حل بارافورمالدهايد لمدة 5 دقائق.
  4. شطف الشرائح في PBS لمدة 5 دقائق.
  5. أقسام الأنسجة نفاذية مع 0.5٪ تريتون-X 100 في PBS لمدة 15 دقيقة.
  6. شطف الشرائح في PBS لمدة 5 دقائق.
  7. سد الأنسجة مع 3٪ ث / الخامس الزلال المصل البقري (BSA) و 5٪ الخامس / الخامس مصل الماعز، وكلاهما في PBS (حل حجب) لمدة ساعة في درجة حرارة الغرفة.
    ملاحظة: تطابق المصل حل حظر إلى الحيوان المضيف الأجسام المضادة الثانوية.
  8. شطف الشرائح في PBS لمدة 5 دقائق.
  9. احتضان الأقسام مع الأجسام المضادة الأولية لحفظ السجلات على النحو المطلوب، وربما النووية المشتركة (على سبيل المثال، DAPI)، والأوعية الدموية (على سبيل المثال، CD31)، أو علامة السيتوبلازمية (على سبيل المثال، أكتين). هنا، تم استخدام الفئران CD31 المضادة للماوس (علامة الأوعية الدموية) في تخفيف 1:100 وفقا لتعليمات الشركة المصنعة في حل حظر بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية محمية من الجفاف على علبة الشرائح.
    ملاحظة: لا تقم بإضافة جسم مضاد أساسي إضافي أو متقارن الأجسام المضادة. المتقارنة التي تم حقنها وسمح لها أن تتراكم في الأنسجة في الجسم الحي بمثابة الأجسام المضادة الأولية.
  10. شطف الشرائح في PBS لمدة 5 دقائق ثلاث مرات، وتغيير PBS في كل مرة.
  11. احتضان الشرائح مع الأجسام المضادة الثانوية لتسمية الأجسام المضادة الأولية. لهذا التطبيق، تصور المضادة للB7-H3 الأجسام المضادة باستخدام AlexaFluor-546 المترافقة الماعز المضادة للأرنب الأجسام المضادة (1:200 تخفيف، الأمثل وفقا لتعليمات الشركة المصنعة) وCD31 مع AlexaFluor-488 الماعز المضادة للفئران الأجسام المضادة للفئران الثانوية (1:200 تخفيف، الأمثل وفقا لتعليمات الشركة المصنعة) في حل حجب، محمية من الضوء والجفاف على علبة الشريحة، لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
    ملاحظة: الأجسام المضادة الثانوية هي من نفس الحيوان المضيف ولكن تطابق تقارب الأجسام المضادة الثانوية إلى الأنواع المضيفة للجسم المضاد الأساسي المعني. الشرائح محمية من الضوء من هذه النقطة فصاعدا.
  12. شطف الشرائح في PBS لمدة 5 دقائق ثلاث مرات، وتغيير PBS في كل مرة.
  13. تطبيق قطرة واحدة من المتوسطة تصاعد في وسط شريحة الأنسجة ووضع بعناية غطاء تجنب فخ فقاعات الهواء.
  14. ختم حواف غطاء مع طلاء الأظافر واضحة والسماح لتجف.
    ملاحظة: لإيقاف البروتوكول مؤقتاً لمدة تصل إلى أسبوع عند هذه النقطة، قم بتخزين الشرائح عند -20 درجة مئوية حتى تصبح جاهزة للمتابعة.

5. التصوير المجهري البؤري وتحليل الصور الكمية

ملاحظة: يعتمد إعداد المجهر البؤري ومعلمات التصوير على نظام البؤرة المستخدمة. تم شراء المجهر المستخدم هنا تجارياً (على سبيل المثال، نظام Zeiss LSM 510 Meta) واستخدم برنامج الاقتناء المرتبط به (على سبيل المثال، Zen 2009). ومع ذلك، فإن العديد من هذه الخطوات تنطبق على أي مجهر البؤري وتفترض المعرفة المجهرية البؤرية الأساسية.

  1. بعد تشغيل النظام وتسخينه، حدد الهدف المطلوب؛ هنا تم استخدام هدف 20x (الفتحة العددية = 0.8).
  2. قم بتحميل شريحة تحكم إيجابية، والانزلاق على الغطاء لأسفل، للسماح بوضع التحسين لألمع إشارة. التصوير في القناة الحمراء، تركيز النظام على العينة في وضع التصوير المباشر.
  3. لكل قناة ليزر المستخدمة، وتحسين كثافة الليزر، ومكاسب رئيسية، وحجم الثقب على النحو التالي:
    1. قم بالتبديل إلى الوضع المستمر للتصوير.
    2. تحسين كثافة الليزر (الذي يتحكم في قوة الليزر) وكسب (ماجستير) (الذي يتحكم في الجهد لأنبوب المضاعف الضوئي) أشرطة الشريحة أثناء مراقبة البحث عن الجدول (LUT) الرسم البياني. اضبط هذين الإعدادات حتى يتم تعبئة النطاق الديناميكي للرسم البياني دون تشبع وحدات البكسل.
      ملاحظة: إذا كانت كثافة الليزر عالية جداً سوف يحدث تبييض الصور. إذا كان الكسب (الرئيسي) مرتفعًا جدًا، ستصبح الصورة صاخبة. من الناحية المثالية، فإن الربح (ماجستير) يكون في منتصف نطاقها.
    3. تعيين الثقب إلى 1 وحدة متجدد الهواء (AU)، والذي يعطي أعلى دقة وأنحف z-شريحة.
    4. حرك شريط الإزاحة الرقمية لتقليل أرضية الضوضاء على الرسم البياني LUT للحصول على خلفية سوداء حقيقية.
      ملاحظة: بمجرد تحسين إعدادات الفحص المجهري لكل قناة ليزر والهدف، والحفاظ عليها ثابتة طوال جلسة التصوير وتصوير جميع الشرائح، للسماح للمقارنة الكمية بين الشرائح.
  4. ضمن علامة التبويب وضع الاكتساب، ضمن متوسط، حدد الرقم المطلوب وعمق البت. انقر فوق الزر الأمثل لتعيين حجم البكسل الأمثل.
  5. استخدم زر الحصول على انطباق لجمع صورة عالية الجودة. هنا، تم اختيار مجالات رؤية عشوائية من داخل الورم، ولكن قد تنطبق مجالات أخرى ذات أهمية على تطبيقات مختلفة (الأوعية، هوامش الورم، عمق الاختراق، وما إلى ذلك)
  6. حفظ ملفات الصور بالتنسيق المستخدم من قبل برنامج confocal (هنا، ".lsm") للمعالجة دون اتصال والقياس الكمي.
    ملاحظة: إذا لم يتم تصوير كافة الشرائح أثناء نفس جلسة العمل حفظ الإعدادات وإعادة تحميلها في الزيارات اللاحقة على الرغم من أن إعادة تصوير نفس الشريحة غير مستحسن بسبب تبييض الصور.
  7. إجراء قياسات كثافة الفلورة الكمية. فتح فيجي (فيجي هو مجرد ImageJ البرمجيات)19،23 وتحميل ملف صورة .lsm عن طريق سحب إلى شريط المعلومات.
  8. تقسيم بيانات قناة اللون. انتقل إلى الصورة > مكدسات > قنوات سبليت.
  9. قم بالمعالجة المسبقة للصور الفلورية حسب الحاجة، أي طرح إشارة الخلفية(عملية > طرح الخلفية)أو تقليل الضوضاء عبر طريقة التصفية.
  10. تقسيم قناة اللون المقابلة للبروتين المرجعي (الأوعية الدموية، النووية، وصمة عار الخلوية) عن طريق وضع عتبة على كثافة إشارة (صورة > ضبط > عتبة).
    ملاحظة: العتبات اليدوية يدخل الذاتية في تحليل الصورة، وبالتالي، باستخدام خوارزمية عتبة تلقائية أو الرجوع إلى الرسم التخطيطي للصور يجعل نتائج تحليل الصورة أقل تحيزاً.
  11. استخدم هذه العتبة لإنشاء قناع ثنائي (عملية > ثنائي > تحويل إلى قناع).
  12. قياس وتسمية ROIs داخل القناع(تحليل > تحليل الجسيمات > التحقق من إضافة إلى مدير > موافق).
  13. تطبيق عائد الفائدة على قناة الألوان المقابلة للجسم المضاد للاهتمام (انقر فوق صورة القناة، تحليل > أدوات > مدير عائد الاستثمار > قياس). سيؤدي هذا إلى تطبيق ROIs القناع على صورة الأجسام المضادة وتوفير قياسات الصورة لمقاطع التسمية في إطار النتائج. حفظ نافذة النتائج (ملف > حفظ).
  14. حساب الإحصاء المطلوب من الفائدة، مثل متوسط كثافة الفلورة كما هو موضح هنا24.
  15. تنفيذ كافة خطوات المعالجة بشكل متطابق مع كل صورة ضمن مجموعة من الشرائح. إنشاء ماكرو للقيام بذلك تلقائياً لدفعات صورة كبيرة23.
  16. لعرض الصورة فقط بعد القياسات الكمية، وتطبيق تعديلات الصورة النوعية لتحسين التصور من أنماط التوزيع البيولوجي عن طريق ضبط الحد الأدنى، والحد الأقصى، والسطوع، والتباين مع نفس المستويات على جميع الشرائح(صورة > ضبط > السطوع / التباين).
  17. حوّل نوع الصورة (صورة > نوع > RGB Color)واحفظ الملفات في نوع صورة بدون فقدان مثل .tiff (ملف > حفظ باسم > Tiff...) لاستخدامها في العروض التقديمية والمنشورات.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

تم استخدام طريقة IVIL هنا لفحص التوزيع البيولوجي في الجسم الحي وتفاعل الأنسجة من B7-H3-ICG وIso-ICG، من خلال السماح للعوامل، بعد الحقن الوريدي في الحيوان الحي، للتفاعل مع الأنسجة المستهدفة لمدة 96 ساعة، وبعد ذلك مرة واحدة هي الأنسجة حصادها ، لتكون بمثابة الأجسام المضادة الأولية خلال التلطيخ المناعي في الجسم الحي السابق. كما تمت مقارنة طريقة IVIL مع معيار الجسم الحي السابق IF تلطيخ الأنسجة لعلامة B7-H3. الغدد الثديية المورين العادية لا تعبر عن علامة B7-H3، وأكد في الجسم الحي السابق، معيار ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

ولهذا الأسلوب عدة خطوات حاسمة ويتطلب تعديلات محتملة لضمان التنفيذ الناجح. أولاً، يجب أن تكون الجرعة وتوقيت الأجسام المضادة / الأجسام المضادة المترافقة الحقن الوريدي مصممة لتطبيق معين. عموما, يجب استخدام جرعات التي تتفق مع كيفية استخدام conjugate الأجسام المضادة عادة, أي مطابقة جرعات من الأجسام المضادة العلاجية أو عامل التباين القائم على الأجسام المضادة. كما ينبغي النظر بعناية في توقيت جمع الأنسجة المستهدفة. الأجسام المضادة والأجسام المضادة conjugates لها أوقات دوران أطول من الأدوية القياسية وعوامل التباين، ومع ذلك، هذه ه...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

نشكر الدكتور أندرو أولسون (خدمة الفحص المجهري لعلوم الأعصاب في ستانفورد) على المناقشات واستخدام المعدات. نشكر الدكتور يورغن ك. ويلمان على توجيهه. وقد تم دعم هذه الدراسة من قبل NIH R21EB022214 منحة (KEW)، NIH R25CA118681 منحة التدريب (KEW)، وNIH K99EB023279 (KEW). تم دعم خدمة الفحص المجهري لعلوم الأعصاب في ستانفورد من قبل NIH NS069375.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
<قوي > نموذج حيواني < / قوي >
FVB / N-TG (MMTV-PyMT) 634MUL / Jمختبر جاكسون002374الإناث ، 4-6 أسابيع من العمر
< قوي > مستلزمات مناولة < / قوي >
27G قسطرةVisualSonicsيرجى الاتصال لطلبمجموعة
قنية الوصول إلى الوريد الذيل Vevo MicroMarkerمناديل الكحولفيشر Scientific22-246073
إسفنج شاش (4 × 4 بوصة 16 رقائق)كاردينال هيلث2913
مصباح حراريمورغانفيل العلمي  ؛ HL0100
IsofluraneHenry Schein Animal Health29404
مرهم العيونفيشر الشريط الجراحيالعلمي NC0490117
3M1530-1
مجموعة الأنسجة< / قوي>
قوالب قاعدة يمكن التخلص منهافيشر Scientific22-363-556
درجة حرارة القطع المثلى (OCT) متوسطةفيشر العلمية23-730-571
ملقط لندنالجراحي أدوات العلوم الدقيقة11080-02
أدوات العلوم الدقيقة للمقص الجراحي14084-08
<قوي > الأجسام المضادة < / قوي>
AlexaFluor-488 الماعز المضاد للفئران IgGLife TechnologiesA-11006
AlexaFluor-546 الماعز المضاد للأرانب IgGLife TechnologiesA-11010
AlexaFluor-594 الماعز المضاد للإنسان IgGLife TechnologiesA11014
التحكم في النمط النظيريالبشري IgG Novus BiologicalsNBP1-97043
جسم مضاد مضاد للنيترين -1 متوافق مع البشر   ؛نيتريس فارماcontact@netrispharma.com
أرنب مضاد للفأر CD276 (B7-H3) Abcamab134161EPNCIR122 استنساخ
الفئران المضادة للفأر CD31BD Biosciences550274MEC 13.3 استنساخ
<قوي > الكواشف < / قوي >
ألبومين مصل البقر (BSA)سيجما ألدريتشA2153-50G
مسمار شفاف تلميعأي متجر صيدلية محلي
إندوسيانين أخضر - NHSIntrace MedicalICG-NHS إستر
تصاعد متوسطThermoFisher ScientificTA-006-FM
مصل الماعز العاديفيشر ICN19135680
البارافورمالدهيد العلمي (PFA)فيشر AAJ19943K2
الفوسفات المعقم محلول ملحي مخزن (PBS) ThermoFisherScientific14190250
Triton-X 100Sigma-AldrichT8787
Supplies< / strong>
التصاق الشرائح الزجاجيةVWR48311-703
تحلية الأعمدةفيشر العلمي45-000-148
زلات الغطاء الزجاجيفيشر علمي12-544G
قلم حاجز مسعورتيد بيلا22311
أنابيب الطرد المركزيالدقيقة فيشر Scientific05-402-25
صينية تلطيخ الشرائحVWR87000-136
Software< / strong>
FIJILOCI ، UW-MADISON.الإصدار 4.0https://fiji.sc/

المراجع

  1. Forthal, D. N. Functions of Antibodies. Microbiology Spectrum. 2 (4), 1-17 (2014).
  2. Boder, E. T., Midelfort, K. S., Wittrup, K. D. Directed evolution of antibody fragments with monovalent femtomolar antigen-binding affinity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (20), 10701-10705 (2000).
  3. Köhler, G., Milstein, C. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature. 256 (5517), 495-497 (1975).
  4. Lonberg, N., et al. Antigen-specific human antibodies from mice comprising four distinct genetic modifications. Nature. 368 (6474), 856-859 (1994).
  5. McCafferty, J., Griffiths, A. D., Winter, G., Chiswell, D. J. Phage antibodies: filamentous phage displaying antibody variable domains. Nature. 348 (6301), 552-554 (1990).
  6. Ferlay, J., et al. Cancer incidence and mortality worldwide: sources, methods and major patterns in GLOBOCAN 2012. International Journal of Cancer. 136 (5), E359-E386 (2015).
  7. Reichert, J. M., Valge-Archer, V. E. Development trends for monoclonal antibody cancer therapeutics. Nature Reviews Drug Discovery. 6 (5), 349-356 (2007).
  8. Kircher, M. F., Willmann, J. K. Molecular Body Imaging: MR Imaging, CT, and US. Part I. Principles. Radiology. 263 (3), 633-643 (2012).
  9. Fleuren, E. D. G., et al. Theranostic applications of antibodies in oncology. Molecular Oncology. 8 (4), 799-812 (2014).
  10. Forsström, B., Bisławska Axnäs, B., Rockberg, J., Danielsson, H., Bohlin, A., Uhlen, M. Dissecting Antibodies with Regards to Linear and Conformational Epitopes. PLoS ONE. 10 (3), (2015).
  11. Woof, J. M., Burton, D. R. Human antibody-Fc receptor interactions illuminated by crystal structures. Nature Reviews Immunology. 4 (2), 89-99 (2004).
  12. Brooks, J. D. Translational genomics: The challenge of developing cancer biomarkers. Genome Research. 22 (2), 183-187 (2012).
  13. Tabrizi, M., Bornstein, G. G., Suria, H. Biodistribution Mechanisms of Therapeutic Monoclonal Antibodies in Health and Disease. The AAPS Journal. 12 (1), 33-43 (2009).
  14. Duraiyan, J., Govindarajan, R., Kaliyappan, K., Palanisamy, M. Applications of immunohistochemistry. Journal of Pharmacy & Bioallied Sciences. 4 (Suppl 2), S307-S309 (2012).
  15. Gambhir, S. S. Molecular imaging of cancer with positron emission tomography. Nature Reviews. Cancer. 2 (9), 683-693 (2002).
  16. Freise, A. C., Wu, A. M. In vivo Imaging with Antibodies and Engineered Fragments. Molecular Immunology. 67 (200), 142-152 (2015).
  17. Cilliers, C., Menezes, B., Nessler, I., Linderman, J., Thurber, G. M. Improved Tumor Penetration and Single-Cell Targeting of Antibody-Drug Conjugates Increases Anticancer Efficacy and Host Survival. Cancer Research. 78 (3), 758-768 (2018).
  18. Wilson, K. E., et al. Spectroscopic Photoacoustic Molecular Imaging of Breast Cancer using a B7-H3-targeted ICG Contrast Agent. Theranostics. 7 (6), 1463-1476 (2017).
  19. Wischhusen, J., et al. Ultrasound molecular imaging as a non-invasive companion diagnostic for netrin-1 interference therapy in breast cancer. Theranostics. 8 (18), 5126-5142 (2018).
  20. Guy, C. T., Cardiff, R. D., Muller, W. J. Induction of mammary tumors by expression of polyomavirus middle T oncogene: a transgenic mouse model for metastatic disease. Molecular and Cellular Biology. 12 (3), 954-961 (1992).
  21. Hober, S., Nord, K., Linhult, M. Protein A chromatography for antibody purification. Journal of Chromatography B. 848 (1), 40-47 (2007).
  22. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents. Journal of Visualized Experiments JoVE. (65), (2012).
  23. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  24. Bachawal, S. V., et al. Earlier detection of breast cancer with ultrasound molecular imaging in a transgenic mouse model. Cancer Research. 73, 1689-1698 (2013).
  25. Fitamant, J., et al. Netrin-1 expression confers a selective advantage for tumor cell survival in metastatic breast cancer. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (12), 4850-4855 (2008).
  26. Kennedy, T. E., Serafini, T., de la Torre, J. R., Tessier-Lavigne, M. Netrins are diffusible chemotropic factors for commissural axons in the embryonic spinal cord. Cell. 78 (3), 425-435 (1994).
  27. Ryman, J. T., Meibohm, B. Pharmacokinetics of Monoclonal Antibodies. CPT: Pharmacometrics & Systems Pharmacology. 6 (9), 576-588 (2017).
  28. Scalia, C. R., et al. Antigen Masking During Fixation and Embedding, Dissected. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 65 (1), 5-20 (2017).
  29. Robertson, R. T., et al. Use of labeled tomato lectin for imaging vasculature structures. Histochemistry and Cell Biology. 143 (2), 225-234 (2015).
  30. Chen, C. Y., et al. Blood flow reprograms lymphatic vessels to blood vessels. The Journal of Clinical Investigation. 122 (6), 2006-2017 (2012).
  31. Anderson, K. G., et al. Intravascular staining for discrimination of vascular and tissue leukocytes. Nature Protocols. 9 (1), 209-222 (2014).
  32. de Boer, E., et al. In Vivo Fluorescence Immunohistochemistry: Localization of Fluorescently Labeled Cetuximab in Squamous Cell Carcinomas. Scientific Reports. 5, (2015).
  33. Jenkins, R. W., Barbie, D. A., Flaherty, K. T. Mechanisms of resistance to immune checkpoint inhibitors. British Journal of Cancer. 118 (1), 9-16 (2018).
  34. Rexer, B. N., Arteaga, C. L. Intrinsic and acquired resistance to HER2-targeted therapies in HER2 gene-amplified breast cancer: mechanisms and clinical implications. Critical Reviews in Oncogenesis. 17 (1), 1-16 (2012).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

الأجسام المضادة العلاجيةالأجسام المضادة التشخيصيةالمجهر البؤريتقطيع الأنسجةصبغ الأجسام المضادة الثانويةالأوعية الدموية الورميةالتوصيل خارج الهدف
في فيفو الفلورة المناعية توطين لتقييم التوزيع الحيوي للجسم المضاد العلاجي والتشخيصي في أبحاث السرطان
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.