تعتبر تفاعلات البروتين والبروتين (PPIs) أساسية لتوليد التأثيرات البيولوجية. يرتبط العديد منها ارتباطا وثيقا بالأمراض ، ويتم الاعتراف بها بشكل متزايد على أنها تقدم أهدافا مهمة للعمل الدوائي1. تتوفر العديد من التقنيات لدراسة تفاعلات البروتين هذه ، والتي تمت مناقشة بعضها في هذه المجموعة أو في مقالات JoVE الأخرى. كل تقنية لها مزاياها وقيودها2. ومع ذلك ، لا توجد تقنية واحدة مثالية لجميع PPIs بسبب التنوع الهائل لهذه التفاعلات التي تحدث في مقصورات مختلفة تحت الخلية ، مع مجموعة واسعة من الصلات (picomolar إلى millimolar) ، وقد تكون عابرة بطبيعتها فقط.
فحوصات كيناز في المختبر هي نهج غير مباشر لدراسة PPIs التي يمكن استخدامها لتحليل كيفية أداء الكينازات لدورها الوظيفي في نقل مجموعة الفوسفات من ATP إلى الركيزة. يستخدم Cui et al.3 هذه التقنية ، إلى جانب الهضم التربتيكي وقياس الطيف الكتلي ، لتحديد مواقع الفسفرة الخاصة بالكيناز-1 المعتمدة على السيكلين على جزء من بروتين السنترومير البشري F (CENP-F). للتحقق الوظيفي من مواقع الفسفرة الجديدة ، يستخدم المؤلفون مقايسة ملزمة ، يجمع بين CENP-F الذي يحتوي على طفرة محاكاة الفوسفومية و α الكاريوفيرين ، وهو مستقبل نقل نووي ، وبالتالي يوفر التحقق المتبادل.
الترسيب المناعي هو طريقة مستخدمة على نطاق واسع لدراسة مثبطات مضخة البروتون حيث يتم استخدام جسم مضاد لالتقاط هدف معين مع أي جزيئات بروتين أخرى مرتبطة به. يطبق Zheng وزملاؤه4 هذه التقنية لدراسة العوامل المحفزة لنقص الأكسجة (HIFs) التي تعمل كعوامل غير متجانسة تتكون من وحدة فرعية α منظمة بالأكسجين ووحدة فرعية β معبرا عنها بشكل أساسي تعرف أيضا باسم ARNT3. ملاحظة مثيرة للاهتمام حول بروتوكولهم هي أن الخلايا يتم تحفيزها وحصادها في ظل ظروف نقص الأكسجين ، ثم يتم ترسيب البروتينات الداخلية من الكسور النووية بشكل مناعي. كما لاحظ المؤلفون ، فإن أحد قيود الطريقة هو أنها لا تستطيع تحديد ما إذا كانت PPIs مباشرة أم غير مباشرة.
يقدم Nolan et al.5 بروتوكولا لقياس عدد الجزيئات وسطوعها في صور الفحص المجهري الفلوري "العدد والسطوع" (N & B) ، والذي يمكن تطبيقه للكشف عن قلة قلة البروتين المتجانسة. يمكن استخدام هذه التقنية في المختبر وفي الجسم الحي وقد تم تطبيقها لتحديد الحالة القليلة القليلة بدقة ل FKBP12F36V المسمى ب mVenus قبل وبعد إضافة دواء مزي. يناقش المؤلفون مزايا التقنية المتعلقة بالتقنيات ذات الصلة ويسلطون الضوء على أهمية تصحيح التبييض وتقلبات الشدة على المدى الطويل. تجعل المجاهر متحد البؤر المزودة بأجهزة الكشف الرقمية القياس الكمي أسهل ، ولكن N & B ممكن أيضا مع أجهزة الكشف التناظرية.
كان تنقية تقارب المجمعات متعددة البروتينات ، جنبا إلى جنب مع تحديد مكوناتها ، تقنية مستخدمة على نطاق واسع لفهم وظائف هذه البروتينات المعقدة. في البروتوكول الصادر عن Luzarowski et al.6 ، تم اتخاذ هذه التقنية خطوة إلى الأمام من خلال توصيف كل من PPIs وتفاعلات مستقلب البروتين (PMIs) في نفس الوقت في الخلايا النباتية نبات الأرابيدوبسيس المعدلة وراثيا. كينازات ثنائي فوسفات النيوكليوسيد الموسومة هي تقارب يتم تنقيتها بواسطة إجراء علامة تنقية التقارب الترادفي (TAP) مع البروتينات الملتقطة والجزيئات الصغيرة التي يتم تحديدها لاحقا عن طريق قياس الطيف الكتلي. تفرد هذا البروتوكول هو القدرة على تحديد كل من الروابط الكارهة للماء والمحبة للماء. إنه بروتوكول استخراج ثلاثة في واحد يمكن من دراسة كل من PPIs و PMIs ويطبق تنقية التقارب على زراعة الخلايا.
يتميز مقايسة ربط القرب باستخدامه للكشف عن التفاعلات بين البروتينات الداخلية في الخلايا والأنسجة. يستخدم Karchugina و Chernoff7 هذه التقنية لإظهار وجود غير متجانسة من kinases MST1 و MST2 في خلايا شوان البشرية (HSCs) وخلايا الكلى الجنينية البشرية (HEK-293). تحتوي مقالتهم على العديد من المؤشرات القيمة حول كيفية أداء هذه التقنية بنجاح. مطلوب الأجسام المضادة الأولية المناسبة التي يتم تربيتها في أنواع مختلفة ضد كل بروتين متفاعل ، وبما أن خصوصية وحساسية الأجسام المضادة هي المفتاح ، يجب ضبط تركيزات الأجسام المضادة بدقة. وجد المؤلفون أن شرائح الغرفة الزجاجية ملائمة لتحليل خطوط الخلايا المتعددة ومجموعات الأجسام المضادة ، لكنهم لاحظوا أنه من الضروري إزالة كل إدراج السيليكون بين الآبار لتجنب الاختلافات في المسافة متحد البؤر أثناء الفحص المجهري. بالإضافة إلى ذلك ، يتم استخدام العديد من الضوابط الإيجابية والسلبية للتحقق من صحة النتائج.
التحليل الطيفي بالرنين المغناطيسي النووي (NMR) هو اختبار حساس يمكن استخدامه لتوفير دقة على المستوى الذري ومعلومات كمية حول تفاعلات البروتين وتفاعلات البروتين والترابط. يستخدم Winkelaar وزملاؤه8 هذه التقنية لدراسة تفاعل بروتينين (vimentin و envoplakin) الموجودين في الديسموسومات ، وهي هياكل خلوية تشارك في التصاق خلية إلى خلية والتي توجد عادة في الأنسجة التي تعاني من إجهاد ميكانيكي شديد. يستخدم المؤلفون مجال vimentin المسمى 15N ويحصلون على طيف ثنائي الأبعاد باستخدام ارتباط كمي أحادي غير متجانس (HSQC). في وجود مجال من envoplakin ، لوحظ توسيع الخط على نطاق واسع واختفاء الذروة ، بما يتفق مع تفاعل البروتين. يبحث المؤلفون أيضا في أساس التفاعل باستخدام الطفرات والرحلان الحراري المجهري (MST) لتوفير المعلومات الكمية.
تشتت الأشعة السينية بزاوية صغيرة (SAXS) هي تقنية يمكن استخدامها لتوفير معلومات حول حجم ومطابقات الجزيء الكبير في المحلول وتوليد غلاف جزيئي من مجمعات كبيرة أو متعددة المجالات أو بروتينية بدقة منخفضة. في البروتوكول من قبل Mrozowich et al.9 ، يتم استخدام هذه التقنية لتوليد بنية منخفضة الدقة من nidogen-1 و laminin γ-1 في المركب. قد تكون هذه التقنية ذات أهمية للباحثين الذين يدرسون PPIs في بروتينات كبيرة ذات مجالات كروية متعددة كبيرة جدا بالنسبة للتحليل الطيفي بالرنين المغناطيسي النووي ويصعب تبلور لعلم البلورات بالأشعة السينية.
تشير التقديرات إلى أن هناك حوالي 650.000 تفاعل في التفاعل البشري10 - وهو ما يكفي لإبقاء الباحثين في هذا المجال مشغولين لبعض الوقت في المستقبل. التطور الأخير ، الذي أصبح ممكنا بفضل التقدم في الفحص المجهري ، وقياس الطيف الكتلي ، والتعلم الآلي ، هو البروتينات المكانية التي قد توفر نظرة ثاقبة في هذا المجالفي المستقبل. ستساعد هذه المجموعة من طرق PPI الباحثين على مواجهة هذا التحدي المهم مع تجنب المزالق المحتملة.