البطانة الظهارة الظهارية الظهارة من الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات في حالة محددة خالية من التغذية وXeno

Ryo Ohta; Ryohichi Sugimura; Akira Niwa; Megumu  K. Saito

doi:10.3791/59823

مقالة منهجية

البطانة الظهارة الظهارية الظهارة من الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات في حالة محددة خالية من التغذية وXeno

DOI:

10.3791/59823

⸱

يونيو 16, 2019

Ryo Ohta^*¹ , Ryohichi Sugimura^*¹ , Akira Niwa¹ , Megumu K. Saito¹

¹Center for iPS cell research and application (CiRA)

^* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا، نقدم بروتوكولا لتشكيل البطانة هيوجينيك على وجه التحديد من الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات في حالة التغذية وخالية من الزينو. وسيكون لهذه الطريقة تطبيقات واسعة في نمذجة الأمراض وفحص المركبات العلاجية.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

اشتقاق الخلايا الجذعية والسلف الوظيفية المكونة للدم (HSPCs) من الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات (PSCs) كانت هدفابعيد المنال لعمليات الزرع الذاتية لعلاج أمراض الدم والاضطرابات الخبيثة. البطانة هيمنية (HE) هي منصة قابلة لإنتاج HSPCs وظيفية عن طريق عوامل النسخ أو للحث على الخلايا الليمفاوية بطريقة قوية. ومع ذلك، فإن الأساليب الحالية لاستخلاص HE إما مكلفة أو متغيرة في الغلة. في هذا البروتوكول، أنشأنا طريقة فعالة من حيث التكلفة ودقيقة لاستخلاص HE في غضون 4 أيام في حالة التغذية خالية وxeno محددة. وخضع HE الناتجة عن انتقال البطانة إلى المكونة وإنتاج CD34⁺CD45⁺ الجينات المكونة للدم الكلونية. القدرة المحتملة لمنصتنا لتوليد HSPCs وظيفية سيكون لها تطبيقات واسعة في نمذجة الأمراض وفحص المركبات العلاجية.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد أعاق تطوير علاجات جديدة للاضطرابات الدموية والمناعية بسبب عدم وجود منصات قوية لنمذجة الأمراض وفحص المخدرات عالية الإنتاجية مع الخلايا الجذعية المكونة للدم الذاتية (HSCs) المستمدة من المريض الخلايا الجذعية متعددة القدرات (PSCs). إن اختراق التكنولوجيا المستحثة (i)PSC يبشر بنمذجة الأمراض من خلايا المرضى، ولكن إنشاء مراكز الصحة والصحة والرعاية الصحية الوظيفية من iPSCs المريض كان بعيد المنال. من أجل استخلاص HSCs من مراكز دعم البرامج البشرية، فإن الاستقراء السليم لبرامج النقوش الجنينية والنسخية هو المفتاح¹^،²^،³^،⁴^،⁵^،⁶^، ⁷^,⁸. وقد أظهر التقدم الذي أحرز مؤخرا في تطوير المكونة للدم دور البطانة هيموجيني (HE) في تطوير HSC⁹. يمكن أن يكون مستحثا من PSCs وهو قادر على التدخل في المصب مثل نقل الجينات¹⁰^،¹¹^،¹²^،¹³. باستخدام HE كمنصة، والجمع بين 5 عوامل النسخ(ERG، HOXA5، HOXA9، LCOR، RUNX1)تسبب بنجاح HSCs الوظيفية التي engraft على المدى الطويل والتفريق في سلالات متعددة¹⁴. ومع ذلك، فقد أعاق جيل متغير وغير فعال من HE من PSCs التلاعب المنهجي وتحليل الخلايا جنبا إلى جنب مع الإنتاج على الرف والحث على نطاق واسع من الخلايا المكونة للدم للاستخدام السريري.

هنا، نحن نوصف طريقة فعالة من حيث التكلفة ودقيقة لاستخلاص HE في 4 أيام مع وحدة تغذية خالية من وxeno شرط محدد. في هذه الطريقة، تشكيل كروي وإعادة تسطيح عفوية على iMarix-511 يضمن كثافة متسقة من المستعمرات PSC، وهو أمر حاسم للحث كفاءة خلايا HE.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1- الكواشف

خطوط الخلايا (الخلايا البشرية: الحصول على الخلايا الجذعية الجنينية (ESCs) أو خطوط iPSC 409B2 و 201B7 (317-9)) و CBA11.
تحضير الكواشف
1. وسط التصفيح بالقبة السماوية( PSC: مزيج من وسط صيانة PSC مع 10 ميكرومتر Y-27632 وتخزينها في 4 درجة مئوية.
2. وسط بلاط SPHEROID PSC: مزيج من وسط صيانة PSC مع 625-1,250 نانوغرام/مل البشري المؤتلف Laminin-511 E8 جزء (LM511-E8) (اعتمادا على خط الخلية) قبل الاستخدام مباشرة.
  ملاحظة: يمكن خلط LM511-E8 في الوسائط^15. مصفوفة أخرى مثل كامل طول laminin-511 يحتاج إلى أن تكون مغلفة مسبقا، وحتى فعلت ذلك، فإنها لا تدعم الأورغانويدات المتوسطة الالتزام أثناء عملية التمايز.
3. يوم 0 متوسط التمايز: مزيج المتوسطة القاعدية المتوسطة مع 2 سم CHIR99021، 80 نانوغرام / مل العظام البروتين مورفوجيني4 (BMP4) و 80 نانوغرام / مل عامل نمو الأوعية الدموية (VEGF).
4. اليوم 2 متوسط التمايز: مزيج المتوسطة القاعدية هيماجينيك مع 1 ميكرومتر SB431542، 80 نانوغرام / مل VEGF و 100 نانوغرام / مل عامل الخلايا الجذعية (SCF).
5. إعداد الفوسفات العازلة المالحة (PBS) دون الكالسيوم أو المغنيسيوم (انظر جدول المواد).
6. 1 m الإيثيلين ديينتيتراسيتيك حمض (EDTA) العازلة: إضافة 1 مل من 0.5 M EDTA إلى 500 مل من PBS.
7. EHT متوسطة: مزيج المتوسطة القاعدية Hematopoietic مع 50 نانوغرام / مل SCF، 20 نانوغرام / مل الثروبويتين (TPO)، 50 نانوغرام / مل FMS ذات الصلة التيروزين كيناز 3 ليجان (Flt-3L)، 20 نانوغرام / مل Interleukin-6/Interleukin-6 مستقبلات ألفا (IL-6/IL-6Rα)، الأنسولين-نقل-سيلينيوم-إيثانولامين, L-الجلوتامين والبنسلين/ستربتوميسين/أمفوتيريسين ب.
8. العازلة FACS: مزيج PBS مع 2٪ مصل العجل الجنين و 1 M EDTA.
9. إعداد عازلة فصل المغناطيسي (انظر جدول المواد).
10. إعداد الوسائط المستندة إلى ميثيل سيلولوز (انظر جدولالمواد).

2. تشكيل مستعمرة PSC

تنمو hPSCs إلى 70 - 80٪ confluency على 0.5 ميكروغرام سم^-2 LM511-E8-المغلفة 6-لوحة الآبار في mTeSR1 في حاضنة 37 درجة مئوية مع 5٪ CO₂.
فصل مركز القبة السماوية العلمي (اليوم - 4)
1. يستنشق المتوسطة ويغسل الخلايا مع PBS مرتين. شطف الخلايا مع حل الانفصال. احتضان في 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة (الخلايا لن تسيل في هذا الوقت).
2. تعليق الخلايا في وسط صيانة PSC، ونقل تعليق إلى أنبوب الحجم المناسب والطرد المركزي الخلايا في 200 x ز لمدة 3 دقائق، واستنشق الفوق وتعليق الخلايا في وسط الطلاء PSC.
لوحة تعليق PSC بكثافة 48,000 - 70,000 خلية سم^-2 (اعتمادا على خط الخلية) على وعاء من البلاستيك الصغيرة الصنع واحتضان بين عشية وضحاها في حاضنة 37 درجة مئوية مع 5% CO₂.
ملاحظة: نوصي 100 ميكرولتر جيدا^-1 من تعليق الخلية في وعاء من البلاستيك الصغيرة 96 بئر. سوف عادة البذور 20,000 الخلايا جيدا^-1 في لوحة 96 جيدا لإنتاج ما يقرب من 100 كروية.
بلاط SPHEROIDs PSC على LM511-E8 (اليوم -3)
1. جمع الكرويات PSC في أنبوب مخروطي 15 مل عن طريق الأنابيب بلطف باستخدام P1000 micropipetter وترك spheroids للوقوف في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 دقيقة لترسب من قبل الجاذبية. ازهب الـ (سوبرنانت)
2. تعليق في التصفيح كروية المتوسطة، الاستغناء عن تعليق في لوحة ثقافة 6-well غير مغلفة في كثافة 4-كرويس سم^-2 والثقافة في حاضنة 37 درجة مئوية مع 5٪ CO₂ لمدة ثلاثة أيام.

3. التعريفي هيماجيني (يوم 0)

استنشق الوسط، أضف متوسط تمييز Day0 والثقافة في حاضنة 37 درجة مئوية مع 5% O₂ و 5% CO₂(حاضنة نقص الأكسجين).
بعد يومين من الثقافة في المتوسط تمييز Day0، يستنشق المتوسط، ثم أضف متوسط تمييز Day2 والثقافة في حاضنة نقص الأكسجين.

4. عزل البطانة الظهارة الدموية (اليوم 4)

بعد يومين، يستنشق المتوسط ويغسل الخلايا مع PBS مرتين. شطف الخلايا مع حل الانفصال. احتضان في حاضنة 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني₂ لمدة 30 دقيقة.
تعليق بلطف الخلايا في 1 m EDTA لالانفصال إلى مستوى خلية واحدة، ونقل التعليق إلى أنبوب مخروطي 50 مل والطرد المركزي الخلايا في 200 x ز لمدة 3 دقائق. المخزن المؤقت.
إضافة 100 μL من CD34⁺ microbeads وpipet بلطف. احتضان لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. يمكن استخدام ما يصل إلى 20 مليون خلية لكل CD34 + 100 ميكرولتر.
قم بتصفية التعليق من خلال مصفاة خلية 40 ميكرومتر.
افصل الخلايا CD34⁺ باستخدام فاصل مغناطيسي.

5. الحث على انتقال البطانة إلى المكونة للدم (EHT)

طلاء الفيبوينكتين
1. إعداد حجم المطلوبة من 5 ميكروغرام / مل فيبرونيكتين الطلاء الحل عن طريق تخفيف 1 ملغ / مل فيبرونيكتين في PBS.
2. اوزع 0.5 مل من محلول الطلاء في كل بئر من لوحة ثقافة 24 بئر. احتضان لوحة في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.
جهاز طرد مركزي CD34 + فرز الخلايا في 200 × ز لمدة 3 دقائق.
تحديد كثافة الخلايا القابلة للحياة مع عداد الخلية. ضبط كثافة الخلية إلى 200،000 الخلايا مل^-1 عن طريق إضافة EHT المتوسطة.
استنشق وتخلص من محلول الطلاء من بئر الفيبرونيكتين المغلفة. الاستغناء عن 0.5 مل من CD34⁺ تعليق الخلية في كل فيبرونيكتين المغلفة جيدا.
احتضان في حاضنة نقص الأكسجين لمدة أسبوع واحد.

6. تحليل التدفق الخلايا من خلايا المكونة للدم

مجموعة الخلايا العائمة: نقل وسط الثقافة إلى أنبوب مخروطي 15 مل. جهاز طرد مركزي في المتوسط في 200 x ز لمدة 3 دقائق.
مجموعة الخلايا الملتصقة
1. غسل الخلايا مع 0.5 مل من PBS مرتين.
2. شطف الخلايا مع حل الانفصال واستنشاق السائل الفائض.
3. احتضان لوحة في حاضنة 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
4. إعادة تعليق الخلايا في 1 مل من العازلة FACS.
اخلط يُخلط الخلايا العائمة والخلايا الملتصقة.
طارد الخلايا في 200 x ز لمدة 3 دقائق. إعادة تعليق في 50 μL من العازلة FACS. احتضان الخلايا مع مكافحة CD34 ومكافحة CD45 الأجسام المضادة لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة في الظلام.
غسل الخلايا مع PBS مرتين والطرد المركزي في 200 x ز لمدة 3 دقائق.
قياس CD34 و CD45 التعبير عن طريق تدفق السيتومتر.

7. وحدة تشكيل مستعمرة (CFU) تقييم خلايا المكونة للدم

جمع خلية المكونة للدم: نقل المتوسطة من الثقافة إلى أنبوب مخروطي 15 مل. شطف جيدا بلطف مرتين مع PBS.
طارد الخلايا في 200 x ز لمدة 3 دقائق. إعادة تعليق في 1 مل من EHT المتوسطة. تحديد رقم الخلية مع عداد الخلية.
إضافة تعليق حجم ما يعادل 10000 خلية إلى 3 مل من الوسائط القائمة على ميثيل سيلولوز تستكمل بالمضادات الحيوية وتخلط جيدا 5 مرات مع 16 G أو 18 G حقنة.
قم بتوزيع تعليق الوسائط القائم على ميثيل سيلولوز بأكمله في كل بئر من طبق من 6 آبار.
احتضان في حاضنة 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني₂ لمدة أسبوعين مع الحفاظ على رطبة. لا تزعج الطبق. المستعمرات حساسة للحركة
بعد أسبوعين، عد المستعمرات تحت المجهر.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويصور مخطط من تشكيل مستعمرات PSC في الشكل 1A. يتم تشكيل كرويات PSC على وعاء بلاستيكي صغير الصنع ليوم واحد. ونتيجة لذلك، يمكن معالجة 000 20 خلية من الخلايا 409 B2 لكل 96 من السفن البلاستيكية الصغيرة الصنع، على الرغم من أن خطوط الخلايا الأخرى قد تتطلب كثافة أعلى (000 30-000 40 خلية لكل 96 من السفن البلاستيكية الصغيرة الصنع). يتم تسطيح هذه المجالات تلقائيا إلى ثقافة ثنائية الأبعاد تقريبا عندما مطلية على طبق الثقافة في وجود LM511-E8.

يتم توضيح التخطيط ية من الحث هيماجينيفي الشكل 1B. عندما تنمو مستعمرات PSC إلى قطر 750 ميكرومتر، يتم تغيير المتوسط بالتتابع للحث على الأورغانويدات المتوسطة. سوف تصبح مستعمرات PSC تدريجيا ً هيكل اعلى من الجانب المشمس خلال التمايز مع الأورغانيات المتوسطة بواسطة تغيير متسلسل ةيالي متوسط حتى اليوم الرابع. في اليوم 4، يتم تحديد بطانة هيموجينيك من الأورغانويدات الجلدية المتوسطة عن طريق الفرز المغناطيسي ومطلية في وقت لاحق على فيبرونيكتين في وسط EHT. 5-10 مليون CD34⁺CD45^- ومن المتوقع الخلايا من كروية تحتوي على 1 مليون PSCs (الشكل1C).

ويلاحظ أن الخلايا تتغير من الخلايا البطانية إلى الخلايا المكونة للدم (فيديو تكميلي 1). تظهر صورة تمثيلية على النقيض من الخلايا السلفية المكونة للدم عند التحفيز مع كوكتيل المكون ة في اليوم 7 في الشكل 2A. ظهرت مستعمرات الخلايا المكونة للدم في الثقافة.

يظهر مخطط قياس السيل تدفق تمثيلي في الشكل 2B. يتم تحفيز الثقافة كلها مع كوكتيل المكونة للدم وفي اليوم 7 يتم تحليل للتعبير عن CD34 و CD45 عن طريق تدفق السيتومتر. خلايا السلف المكونة للدم تعبر عن CD34 و CD45.

وأظهرت اختبار CFU توليد المستعمرات المحببة / البلبلة من CD34⁺ CD45⁺ خلايا السلف المكونة للدم (الشكل 2C). يقدر عدد مستعمرة 38 CFU-G / M لكل 10000 خلية (الشكل 2D)

figure-results-1
الشكل 1: مخطط لمستعمرات بلاط PSC وما تُتّبع من تمايز المكون الدموي عن طريق بطانة الدم الوَمية. (أ) عملية التخطيط ية لتشكيل مستعمرات PSC. يتم الاحتفاظ بـ PSCs على لوحة 6-well المغلفة من LM511-E8 في وسط صيانة PSC. في اليوم -4، يتم فصل الخلايا وفصلها إلى مستوى خلية واحدة باستخدام حل فصل، ومطلية في وقت لاحق على سفينة بلاستيكية صغيرة الصنع في وسط صيانة PSC مع Y-27632 ومثقف بين عشية وضحاها لتشكيل كروية. في اليوم -3، يتم طلاء الكرويات في وسط صيانة PSC مع LM511-E8 ومثقف لمدة ثلاثة أيام. بحلول اليوم 0، يتم تسطيح كروية عفويا إلى ثقافة ثنائية الأبعاد تقريبا. مقياس أشرطة = 200 μm. (B) في يوم 0, يتم استبدال المتوسطة مع متوسط تمييز Day0 ومثقف في حاضنة نقص الأكسجة. في اليوم 2 من التمييز, استبدلت الوسط مع يوم 2 تمييز وسط. في اليوم 4 من الأندوال الظهارة الظهارة الظهارية الظهارية، يتم فرز CD34⁺ الخلايا مغناطيسيا ومثقف على لوحة 12-well المغلفة في فيفينيكتين في وسط EHT لمدة 6 أيام. (ج) مخطط قياس التدفق التمثيلي من CD45 و CD34 التعبير عن الخلايا اليوم 4 فرزها بواسطة CD34. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-2
الشكل 2: تحليل الممتلكات المكونة للدم. (أ) صورة تمثيلية على النقيض من مرحلة خلايا السلف المكونة للدم بعد التحفيز مع كوكتيل المكونة للدم في اليوم 7. شريط مقياس = 200μm. ( B) مخطط تدفق السيتومترية التمثيلية من CD45 و CD34 التعبير عن الثقافة بأكملها على التحفيز مع كوكتيل المكونة للدم في اليوم 7. (C) صورة تمثيلية على النقيض من مرحلة مستعمرة المحببة/البلبلة التي تم إنشاؤها من الخلايا السلفية المكونة للدم في اليوم 11. شريط مقياس = 500μm. ( D) عدد CFUs لكل 10000 خلية. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-3
فيديو تكميلي 1: EHT فيديو. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

توفر طريقة الحث المعرّف خالية من التغذية والزينو منصة دقيقة وفعالة من حيث التكلفة لحث خلايا HE بطريقة قابلة للتطوير. وقد أعاقت تشكيل المؤمنين من البطانة هيماجينيفية في البروتوكولات التقليدية¹⁰^،¹¹^،¹²^،¹³^،¹⁴ بسبب عدم وجود سيطرة دقيقة على كثافة مستعمرة PSC وحجمها ، الذي يؤثر على كفاءة التمايز الموجه القائم على المورتوجين/السيتوكين. لقد شهدنا عدم اتساق في الحث البطانة هيموجينيك في كل دفعة مستقلة من البروتوكولات التقليدية. البروتوكول الجديد يتيح تنظيم محكم من كثافة مستعمرة PSC وحجمها، وبالتالي يتغلب على عدم اتساق التعريفي البطانة هيموجينيك.

استغلنا تشكيل الكروية النظامية ونقلنا فيما بعد شرط ًا محدداً خالياً من التغذية وxeno لتشكيل HE في مجموع 4 أيام. وأكدنا باستخدام ثلاثة خطوط خلايا مستقلة أن تشكيل كروي يضمن تشكيل ثابت من خلايا HE. ونتيجة لذلك، أسفرت خطوط الخلايا 409B2 12.7%-23.6% CD34⁺ كفاءة الخلايا على أساس ثلاث تجارب مستقلة. العامل الحاسم لبلاط كرويات PSC LM511-E8. نحن لا نوصي باستبدال هذا مع مصفوفة أخرى، مثل ماتريغل أو منتجات لامينين كاملة الطول في تجاربنا. لقد اختبرنا أن الأورغانويدات الجلدية النخاعية كانت منفصلة بسهولة عن ماتريغل وفقدت أثناء عملية التمايز. ولا ماتريغل أو كامل طول لامينين لا مرساة الخلايا دون ما قبل الطلاء.

والقصور المحتمل لهذا البروتوكول هو أننا نعتمد على وسيط صيانة PSC للحفاظ على الشركات الأمنية الخاصة. لقد اختبرنا وسائل الإعلام الأخرى مثل StemFit، لكننا للخطر التعريفي هيموجينيك. يفترض أن الخلايا كانت مقاومة للخروج من حالة متعددة القدرات في وقت قصير لدينا (4 أيام) بروتوكول التعريفي. إذا كان أحد يحافظ على PSCs في وسائل الإعلام الأخرى، فإننا نوصي بتكييف الخلايا في وسط صيانة PSC وإجراء بضع مقاطع قبل التمايز. هذه المنصة سوف تسمح بالتلاعب المنهجي وتحليل الخلايا، والإنتاج خارج على الرف والحث على نطاق واسع من الخلايا المكونة للدم للاستخدام السريري المحتمل. والهدف الطويل الأجل لهذا النظام هو وضع نموذج لأمراض نقص المناعة في نماذج الفأرة التي تُصنع من الأنسنة للتحقيق في الآليات الخلوية والجزيئية المسؤولة وإجراء فحوص للعقاقير.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ولم يعلن أصحاب البلاغ عن أي تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ونحن ممتنون لآلينا لي وسايكو بينو على مساعدتهما التقنية. ونود أيضا أن نشكر السيدة هارومي واتانابي على تقديم المساعدة الإدارية، والدكتور بيتر كاراغيانيس على تحرير هاوية الورقة. وقد تم دعم هذا العمل من قبل المركز الأساسي لبحوث الخلايا iPS لشبكة مركز البحوث لتحقيق الطب التجديدي من الوكالة اليابانية للبحث والتطوير الطبي (AMED) [M.K.S.] ، برنامج أبحاث الأمراض المستعصية استخدام. خلايا iPS الخاصة بالأمراض من AMED (17935423) [M.K.S.] ومركز الابتكار في وكالة العلوم والتكنولوجيا اليابانية (JST) [R.O. وM.K.S.].

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
0.5 م EDTA	ثيرمو فيشر العلمي	15575	0.5 م EDTA
40 & مصفاة الخلايا m	Corning	352340	40 & mu ؛ مصفاة خلية M
6 ألواح بئر	Corning	353046	6 ألواح آبار
مضاد حيوي مضاد للفطريات	Thermo Fisher Scientific	15240-112	البنسلين / الستربتومايسين / الأمفوتريسين B
الأجسام المضادة المضادة ل CD34	بيكمان كولتر	A07776	الأجسام المضادة
المضادة ل CD34 الأجسام المضادة ل CD45	Biolegend	304012	الأجسام المضادة المضادة ل CD45
BMP4	R & أنظمة D	314-BP-010	BMP4
CD34 ميكروبيدات	Miltenyi	130-046-703	CD34 ميكروبيدات
CHIR99021	واكو	038-23101	CHIR99021
أساسي 6	ثيرمو فيشر Scientific	A15165-01	قاعدة متولد الدم
أساسي 8	ثيرمو فيشر Scientific	A15169-01	الأديم المتوسط القاعدي
Ezsphere SP Microplate 96well	AGC	4860-900SP	وعاء بلاستيكي دقيق التصنيع ;
FCS	Biosera	FB-1365/500	FCS
Fibronectin	Millipore	FC010-100MG	Fibronectin
Flt-3L	R & D Systems	308-FK-005	Flt-3L
Glutamax	Thermo Fisher Scientific	35050-061	L-Glutamine
IL-6 / IL-6R & alpha ؛	R & D Systems	8954-SR	IL-6 / IL-6R & alpha ؛
iMatrix-511	Matrixome	892 001	LM511-E8
ITS-X	Thermo Fisher Scientific	51500-056	الأنسولين ترانسفيرين السيلينيوم والإيثانولامين
MACS العازلة	Miltenyi	130-091-221	عازلة الفصل المغناطيسي
Methocult 4435MethoCult & trade ؛ H4435 تقنيات	الخلايا الجذعية	المخصبة 04435	الوسائط القائمة على ميثيل السليلوز
mTeSR1	تقنيات الخلايا الجذعية	85850	PSC وسيط
الصيانة PBS	nacalai tesque	14249-24	PBS
SB431542	واكو	031-24291	SB431542
SCF	R& D Systems	255-SC-010	SCF
Stemline II توسيع الخلايا الجذعية المكونة للدم متوسط	سيجما ألدريتش	S0192-500ML	مكونة للدم القاعدية
TPO	R & D Systems	288-TPN	TPO
TrypLE Express	Thermo Fisher Scientific	12604-021	حل التفكك
VEGF	R & أنظمة D	293-VE-010	VEGF
Y-27632	واكو	253-00513	Y-27632

متوسط متوسط متوسط

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pereira, C. F., et al. Induction of a hemogenic program in mouse fibroblasts. Cell Stem Cell. 13, 205-218 (2013).
Lancrin, C., et al. The haemangioblast generates haematopoietic cells through a haemogenic endothelium stage. Nature. 457, 892-895 (2009).
Loh, K. M., et al. Mapping the Pairwise Choices Leading from Pluripotency to Human Bone, Heart, and Other Mesoderm Cell Types. Cell. , 451-467 (2016).
Ng, E. S., et al. Differentiation of human embryonic stem cells to HOXA+ hemogenic vasculature that resembles the aorta-gonad-mesonephros. Nature Biotechnology. 34, 1168-1179 (2016).
Batta, K., et al. Direct reprogramming of murine fibroblasts to hematopoietic progenitor cells. Cell Reports. 9, 1871-1884 (2014).
Sturgeon, C. M., et al. Defining the path to hematopoietic stem cells. Nature Biotechnology. 31, 416-418 (2013).
Ivanovs, A., et al. Human haematopoietic stem cell development: from the embryo to the dish. Development. 144, 2323-2337 (2017).
Blaser, B. W., Zon, L. I. Making HSCs in vitro: don't forget the hemogenic endothelium. Blood. , (2018).
Speck, N., Dzierzak, E. Of lineage and legacy: the development of mammalian hematopoietic stem cells. Nature imunology. , (2008).
Niwa, A., et al. A novel serum-free monolayer culture for orderly hematopoietic differentiation of human pluripotent cells via mesodermal progenitors. PLoS One. 6, e22261(2011).
Sturgeon, C. M., et al. Wnt signaling controls the specification of definitive and primitive hematopoiesis from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 32, 554-561 (2014).
Ditadi, A., et al. Human definitive haemogenic endothelium and arterial vascular endothelium represent distinct lineages. Nature Cell Biology. 17, 580-591 (2015).
Kennedy, M., et al. T lymphocyte potential marks the emergence of definitive hematopoietic progenitors in human pluripotent stem cell differentiation cultures. Cell Reports. 2, 1722-1735 (2012).
Sugimura, R., et al. Haematopoietic stem and progenitor cells from human pluripotent stem cells. Nature. 545, 432-438 (2017).
Miyazaki, T., et al. Efficient Adhesion Culture of Human Pluripotent Stem Cells Using Laminin Fragments in an Uncoated Manner. Scientific Reports. 7, 41165(2017).

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

CD34 LM511 E8 EHT

البطانة الظهارة الظهارية الظهارة من الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات في حالة محددة خالية من التغذية وXeno

في هذه المقالة

ملخص

الملخص

المقدمة

البروتوكول

النتائج

المناقشة

الإفصاحات

شكر وتقدير

المواد

المراجع

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

مقالات ذات صلة