تقدم هنا بروتوكولات لإنشاء الحويصلات أحادية اللاميلار الصغيرة القائمة على الببتيد قادرة على النمو. لتسهيل في إنتاج vesiculo من الببتيد الغشاء، وقد تم تجهيز هذه الحويصلات مع نظام ترجمة النسخ وبلازميد الببتيد ترميز.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
في فيسيكولو التوليف من السلائف غشاء الببتيد لنمو الحويصلة المستقلة
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
تجزئة التفاعلات البيوكيميائية هو جانب مركزي من الخلايا الاصطناعية. ولهذا الغرض، تعمل مقصورات التفاعل القائمة على الببتيد كبديل جذاب للدهون أو الحويصلات القائمة على الأحماض الدهنية. خارجيا أو داخل الحويصلات، يمكن التعبير عن الببتيدات بسهولة وتبسيط توليف السلائف الغشاء. كما هو منصوص عليه هنا بروتوكول لإنشاء الحويصلات بأقطار تبلغ حوالي 200 نانومتر استناداً إلى الببتيدات الشبيهة بالإيلاستين (ELP) باستخدام الإماهة من الخرز الزجاجي. كما تقدم بروتوكولات للتعبير ELP البكتيرية وتنقية عن طريق ركوب الدراجات في درجة الحرارة العكسية، فضلا عن وظيفية covalent مع الأصباغ الفلورية. وعلاوة على ذلك، يصف هذا التقرير بروتوكولا ً للتمكين من نسخ الحمض النووي الريبي aptamer dBroccoli داخل الحويصلات ELP كمثال أقل تعقيداً لتفاعل كيميائي حيوي. وأخيرا، يتم توفير بروتوكول، والذي يسمح في التعبير vesiculo من البروتينات الفلورية والببتيد الغشاء، في حين أن توليف هذا الأخير يؤدي إلى نمو الحويصلة.
المقدمة
عادة ما يتم الاقتراب من إنشاء النظم الخلوية الحية الاصطناعية من اتجاهين مختلفين. في الطريقة من أعلى إلى أسفل ، يتم تقليل جينوم البكتيريا إلى مكوناته الأساسية ، مما يؤدي في نهاية المطاف إلى الحد الأدنى من الخلية. في النهج من أسفل إلى أعلى، يتم تجميع الخلايا الاصطناعية دي نوفو من المكونات الجزيئية أو النظم الفرعية الخلوية، والتي تحتاج إلى دمجها وظيفيا في نظام ثابت مثل الخلية.
في نهج دي نوفو، وعادة ما يتحقق تجزئة المكونات البيوكيميائية اللازمة باستخدام الأغشية المصنوعة من الدهون الفوسفاتية أو الأحماض الدهنية1،2،3،4. ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1. التعبير عن الببتيدات مثل الإيلاستين
- اليوم الأول: إعداد ثقافة بداية واللوازم للتعبير الببتيد
- إعداد وقوارير ثقافة التعبير الأوتوكلاف (4 × 2.5 لتر) و 3 لتر من LB المتوسطة. ل1 لتر من LB المتوسطة، إضافة 25 غرام من مسحوق LB إلى 1 لتر من الماء النقي جدا.
- إعداد ثقافة كاتب مع 100 مل من LB المتوسطة، 50 ميكرولتر من معقمة تصفية (0.22 م مرشح) حل الكلورامفينيكول (25 ملغ / مل في EtOH)، و 50 ميكرولتر من معقمة تصفية (0.22 م مرشح) محلول carbenicillin (100 ملغ / مل في 50٪ EtOH و 50٪ المياه النقية).
- إضافة خط صغير من مخزون بكتيري مسبق الصنع يحتوي على سلالة القولونية E. BL21(DE3)pLysS مع التعبير pET20b(+) التعبير ناقلات....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
إنتاج الحويصلات
ويبين الشكل 1 صورة مجهرية إلكترونية للإرسال (TEM) لمن الحويصلات المعدة باستخدام حلول مختلفة للتورم وطريقة الخرز الزجاجي (انظر أيضاً Vogele et al.11). بالنسبة للعينة في الشكل 1A، تم استخدام PBS فقط كحل تورم لإثبات تشكيل الحويصلات وتحديد حجمها. عندما تم استخدام TX-TL كحل تورم (الشكل1B)،شكلت الحويصلات أيضا. تم إجراء قياسات تشتت الضوء الديناميكي (DLS) لإظهار أن طريقة الخرز الزج.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
الإماهة الفيلم هو إجراء شائع لخلق الحويصلات يونيلاميلار الصغيرة. المصدر الرئيسي للفشل هو التعامل الخاطئ مع المواد المستخدمة في الإجراء.
في البداية، يتم إنتاج ELPs من قبل خلايا القولونية E. . العائد بعد تنقية ELP يمكن أن تختلف اختلافا كبيرا اعتمادا على مدى دقة البروتوكول يتم خلال خطواته الحاسمة. هذه هي درجة الحرارة العكسية ركوب الدراجات (ITC) خطوة وإعادة تعليق ELPs بعد هطول الأمطار. لتنقية، قمنا بانهيار الببتيد الكاره .......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ولا يعلن صاحبا البلاغ عن أي مصالح مالية متنافسة.
شكر وتقدير
نعرب عن امتناننا للدعم المالي من خلال DFG TRR 235 (ظهور الحياة، المشروع P15)، ومجلس البحوث الأوروبي (اتفاق المنحة رقم 694410 AEDNA)، وكلية الدراسات العليا الدولية للعلوم والهندسة في TUM IGSSE (المشروع رقم 9.05) . نشكر إي فالغنهاور على مساعدتها في إعداد العينات. نشكر أ. دوبين وم. شوارتز شيلينغ على مساعدتهما في نظام TX-TL والمناقشات المفيدة. نشكر ن. ب. هولاند على المناقشات المفيدة.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| 2xYT | MP الطب الحيوي | 3012-032 | |
| 3-PGA | Sigma-Aldrich | P8877 | |
| 5PRIME Phase Lock Gel TM أنبوب | VWR | 733-2478 | |
| Cy3 | Sigma-Aldrich | 777331 | |
| المترافق بالألكين Cy5 | سيجما ألدريتش | 777358 | |
| ATP | سيجما ألدريتش | A8937 | |
| بنزامدين | كارل روث | CN38.2 | |
| BL21 رشيد 2 E. قولونية< إم > سلالة | نوفاجين | 71402 | |
| برادفورد BSA مجموعة فحص البروتين | Bio-rad | 500-0201 | |
| cAMP | سيجما ألدريتش | A9501 | |
| كاربينسيلين | كارل روث | 6344.2 | |
| كلورامفينيكول | سيجما ألدريتش | C1919 | |
| كلورامفينيكول | كارل روث | 3886.3 | |
| كلوروفورم | كارل روث | 4432.1 | |
| CoA | سيجما ألدريتش | C4282 | |
| CTP | USB | 14121 | |
| CuSO4< / sub> | Carl Roth | P024.1 | |
| DFHBI | Lucerna Technologies | 410 | |
| DMSO | كارل روث | A994.1 | |
| DNase I | NEB | M0303S | |
| DTT | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| الإيثانول | كارل روث | 9065.2 | |
| حمض الفولينيك | سيجما ألدريتش | F7878 | |
| خرز زجاجي مغسول بالحمض | سيجما ألدريتش | G1277 | |
| GTP | USB | 16800 | |
| هيبس | سيجما ألدريتش | H6147 | |
| IPTG (بيتا إيزوبروبيل ثيوجالاكتوزيد) | سيجما ألدريتش | I6758 | |
| KCl | كارل روث | P017.1 | |
| K-glutamate | سيجما ألدريتش | G1149 | |
| LB مرق | كارل روث | X968.2 | |
| ليزوزيم | سيجما ألدريتش | L6876 | |
| الميثانول | كارل روث | 82.2 | |
| MgCl2< / sub> | Carl Roth | KK36.3 | |
| Mg-glutamate | Sigma-Aldrich | 49605 | |
| أعمدة كروماتوغرافيا الميكرو الحيوية | Bio-Rad | 732-6204 | |
| NAD | Sigma-Aldrich | N6522 | |
| رابط NHS-azide (إستر أوكسي سوكسينيميد حمض y-azidobutyric) | Baseclick | BCL-033-5 | |
| PEG-8000 | Carl Roth | 263.2 | |
| خطوط الأس الهيدروجيني | كارل روث | 549.2 | |
| فينيل ميثيل سلفونيل فلوريد | كارل روث | 6367.2 | |
| محلول ملحي مخزن بالفوسفات | VWR | 76180-684 | |
| حمض | الفوسفوريكSigma-Aldrich | W290017 | |
| البولي إيثيلين إيثيلين | سيجما ألدريتش | 408727 | |
| محلول ثنائي القاعدة فوسفات البوتاسيوم | Sigma-Aldrich | P8584 | |
| محلول أحادي القاعدة لفوسفات البوتاسيوم | Sigma-Aldrich | P8709 | |
| Qiagen Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | |
| RNAPol المخزن المؤقت للتفاعل | NEB | B9012 | |
| الفئران المثبطة RNase | NEB | M0314S | |
| RNaseمناديل Zap | ThermoFisher | AM9788 | |
| rNTP | NEB | N0466S | |
| روتي-فينول / كلوروفورم / إيزواميل كحول | كارروث | A156.1 | |
| RTS عينات الأحماض الأمينية | 5 كاسيت غسيل | الكلى Prime 2401530 | |
| Slide-A-Lyzer ، 10 كيلو MWCO (طقم) | Thermo-Scientific | 66382 | |
| كلوريد الصوديوم | كارل روث | 9265.1 | |
| هيدروكسيد الصوديوم | كارل روث | 8655.1 | |
| سبيرميدين | سيجما ألدريتش | 85558 | |
| معقم مفلتر (0.22 وميكرو ؛ مرشح م) | كارل روث | XH76.1 | |
| T7 بوليميراز | NEB | M0251S | |
| TBTA (تريس (بنزيل تريازوليل ميثيل) أمين) | سيجما ألدريتش | 678937 | |
| TCEP (تريس (2-كربوكسي إيثيل) - هيدروكلوريد الفوسفين) | سيجما ألدريتش | C4706 | |
| قاعدة تريس | فيشر | BP1521 | |
| tRNA (من الإشريكية القولونية) | روش تطبيقي العلوم | MRE600 | |
| UTP | USB | 23160 |
المراجع
- Chen, I. A., Szostak, J. W. A kinetic study of the growth of fatty acid vesicles. Biophysical Journal. 87 (2), 988-998 (2004).
- Nourian, Z., Roelofsen, W., Danelon, C. Triggered gene expression in fed-vesicle microreactors with a multifunctional ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
الوسوم
