يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

في فيسيكولو التوليف من السلائف غشاء الببتيد لنمو الحويصلة المستقلة

5.1K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/59831

⸱

يونيو 28, 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Physics of Synthetic Systems - E14, Physics-Department and ZNN, Technische Universität München, 2Departmant of Chemistry, Center for Integrated Protein Science (CIPSM), Technische Universität München, 3Nanosystems Initiative Munich

في هذه المقالة

ملخص

تقدم هنا بروتوكولات لإنشاء الحويصلات أحادية اللاميلار الصغيرة القائمة على الببتيد قادرة على النمو. لتسهيل في إنتاج vesiculo من الببتيد الغشاء، وقد تم تجهيز هذه الحويصلات مع نظام ترجمة النسخ وبلازميد الببتيد ترميز.

الملخص

تجزئة التفاعلات البيوكيميائية هو جانب مركزي من الخلايا الاصطناعية. ولهذا الغرض، تعمل مقصورات التفاعل القائمة على الببتيد كبديل جذاب للدهون أو الحويصلات القائمة على الأحماض الدهنية. خارجيا أو داخل الحويصلات، يمكن التعبير عن الببتيدات بسهولة وتبسيط توليف السلائف الغشاء. كما هو منصوص عليه هنا بروتوكول لإنشاء الحويصلات بأقطار تبلغ حوالي 200 نانومتر استناداً إلى الببتيدات الشبيهة بالإيلاستين (ELP) باستخدام الإماهة من الخرز الزجاجي. كما تقدم بروتوكولات للتعبير ELP البكتيرية وتنقية عن طريق ركوب الدراجات في درجة الحرارة العكسية، فضلا عن وظيفية covalent مع الأصباغ الفلورية. وعلاوة على ذلك، يصف هذا التقرير بروتوكولا ً للتمكين من نسخ الحمض النووي الريبي aptamer dBroccoli داخل الحويصلات ELP كمثال أقل تعقيداً لتفاعل كيميائي حيوي. وأخيرا، يتم توفير بروتوكول، والذي يسمح في التعبير vesiculo من البروتينات الفلورية والببتيد الغشاء، في حين أن توليف هذا الأخير يؤدي إلى نمو الحويصلة.

المقدمة

عادة ما يتم الاقتراب من إنشاء النظم الخلوية الحية الاصطناعية من اتجاهين مختلفين. في الطريقة من أعلى إلى أسفل ، يتم تقليل جينوم البكتيريا إلى مكوناته الأساسية ، مما يؤدي في نهاية المطاف إلى الحد الأدنى من الخلية. في النهج من أسفل إلى أعلى، يتم تجميع الخلايا الاصطناعية دي نوفو من المكونات الجزيئية أو النظم الفرعية الخلوية، والتي تحتاج إلى دمجها وظيفيا في نظام ثابت مثل الخلية.

في نهج دي نوفو، وعادة ما يتحقق تجزئة المكونات البيوكيميائية اللازمة باستخدام الأغشية المصنوعة من الدهون الفوسفاتية أو الأحماض الدهنية1،2،3،4. وذلك لأن أغشية الخلايا "الحديثة" تتكون أساسا من الدهون الفوسفاتية، في حين تعتبر الأحماض الدهنية المرشحين معقولة من حاويات غشاء بريبيوتيك5،6. لتشكيل أغشية جديدة أو لتسهيل نمو الغشاء، يجب توفير كتل البناء amphiphilic من الخارج7 أو من الناحية المثالية من خلال الإنتاج داخل مقصورة membranous باستخدام عمليات الابتنائية المقابلة4 ،8.

في حين أن تخليق الدهون هو عملية التمثيل الغذائي معقدة نسبيا، يمكن أن تنتج الببتيدات بسهولة جدا باستخدام ردود الفعل التعبير الجيني خالية من الخلايا9،10. وبالتالي، فإن أغشية الببتيد التي شكلتها الببتيدات amphiphilic تمثل بديلا للاهتمام للأغشية الدهنية كما مرفقات لتقليد الخلايا الاصطناعية التي هي قادرة على النمو11.

البوليمرات المركبة التي تشبه الإيلاستين أمفيفيليك (ELPs) هي فئة جذابة من الببتيدات، والتي يمكن أن تكون بمثابة لبنة البناء لمثل هذه الأغشية12. عزر تسلسل الأحماض الأمينية الأساسية من ELPs هو (GaGVP)ن، حيث "أ" يمكن أن يكون أي حمض أميني باستثناء برولين و "ن" هو عدد من عزر يكرر13،14،15،16،17 . وقد تم إنشاء ELPs مع كتلة الكارهة للماء التي تحتوي أساسا فينيلألانين لكتلة وhydrophilic تتألف أساسا من حمض الجلوتاميك11. اعتمادا على المعلمات والحل، مثل درجة الحموضة وتركيز الملح، ELPs تظهر ما يسمى انتقال درجة الحرارة العكسية في درجة الحرارة TT، حيث تخضع الببتيدات للانتقال مرحلة قابلة للعكس تماما من الماء إلى الكاره للماء الدوله. يمكن تنفيذ تركيب الببتيدات بسهولة داخل الحويصلات باستخدام "TX-TL" استخراج الخلايا البكتيرية11،18،19،20،21،الذي يوفر جميع المكونات اللازمة لردود الفعل النسخ والترجمة المقترنة.

تم تغليف نظام TX-TL معا، مع قالب الحمض النووي ترميز ELPs في الحويصلات ELP باستخدام الجفاف الإماهة من الخرز الزجاجي كدعم قوي. تشكيل الحويصلات يحدث من خلال الإماهة من الببتيدات المجففة من سطح حبة11. ويمكن استخدام أساليب أخرى22 لتكوين الحويصلات، والتي يحتمل أن تظهر أقل تشتت وأحجام الحويصلة أكبر (على سبيل المثال، تشكيل الكهربائية، نقل مرحلة مستحلب، أو الأساليب القائمة على microfluidics). لاختبار صلاحية طريقة التغليف، يمكن استخدام نسخ من dBroccoli aptamer الفلورية23 بدلاً منذلك 11، وهو أقل تعقيداً من التعبير الجيني مع نظام TX-TL.

بسبب التعبير عن كتل بناء الغشاء في vesiculo وتأسيسها في وقت لاحق في الغشاء ، تبدأ الحويصلات في النمو11. ويمكن إثبات دمج غشاء ELPs من خلال فحص افري. ولهذه الغاية، تترافق الـ ELPs المستخدمة في تكوين مجموعة الحويصلات الأولية مع الأصباغ الفلورية بحصص متساوية تشكل زوجاً من الـ FRET. عند التعبير عن ELPs غير المسمى في vesiculo ودمجها في الغشاء ، يتم تخفيف ELPs المسمى في الغشاء وبالتالي فإن إشارة FRET تنخفض11. كطريقة متعددة الاستخدامات وشائعة للاقتران، يتم استخدام النحاس المحفز ة أزيد-ألكين سيكلوكسيدو. مع استخدام الرباط استقرار مثل تريس (البنزلتريازولميثيل) أمين، يمكن أن يتم رد الفعل في محلول مائي في درجة الحموضة الفسيولوجية دون تحلل التحلل من المتفاعلين11، وهو مناسب لتفاعلات الاقتران التي تنطوي على الببتيدات.

ويقدم البروتوكول التالي وصفاً مفصلاً للإعداد لزراعة الببتيدوسومات القائمة على ELP. يتم وصف التعبير عن الببتيدات وتشكيل الحويصلة باستخدام طريقة الخرز الزجاجي. وعلاوة على ذلك، يتم وصف كيفية تنفيذ نسخ من البروكلي الفلورية aptamer ورد الفعل النسخ الترجمة للتعبير عن البروتين داخل الحويصلات ELP. وأخيرا، شريطة هو إجراء لاقتران ELPs مع الفلوروفور، والتي يمكن استخدامها لإثبات نمو الحويصلة من خلال فحص فريت11.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1. التعبير عن الببتيدات مثل الإيلاستين

  1. اليوم الأول: إعداد ثقافة بداية واللوازم للتعبير الببتيد
    1. إعداد وقوارير ثقافة التعبير الأوتوكلاف (4 × 2.5 لتر) و 3 لتر من LB المتوسطة. ل1 لتر من LB المتوسطة، إضافة 25 غرام من مسحوق LB إلى 1 لتر من الماء النقي جدا.
    2. إعداد ثقافة كاتب مع 100 مل من LB المتوسطة، 50 ميكرولتر من معقمة تصفية (0.22 م مرشح) حل الكلورامفينيكول (25 ملغ / مل في EtOH)، و 50 ميكرولتر من معقمة تصفية (0.22 م مرشح) محلول carbenicillin (100 ملغ / مل في 50٪ EtOH و 50٪ المياه النقية).
    3. إضافة خط صغير من مخزون بكتيري مسبق الصنع يحتوي على سلالة القولونية E. BL21(DE3)pLysS مع التعبير pET20b(+) التعبير ناقلات ترميز تسلسل الببتيد MGHGVGVP ((GEGVP)4(GVGVP))4((GFGVP) 4 ((GFGVP) 4 ((GFGVP)4(GVGVP))3 (GFGVP)4GWP (مختصر كإي أف) إلى ثقافة بداية 100 مل مسخنة مسبقاً وحضانة عند 37 درجة مئوية لمدة 16 ساعة مع 250 دورة في الدقيقة في حاضنة تهتز (تتوفر سلالات وناقلاتالقولونية عند الطلب).
    4. قبل تسخين القوارير ثقافة التعبير ووسائل الإعلام LB في 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها بحيث يتم إعدادها لليوم التالي.
  2. اليوم الثاني: تعبير البروتين
    1. إضافة 750 مل من LB المتوسطة إلى كل قارورة ثقافة التعبير، 375 درجة مئوية من المعقمة المصفاة (0.22 م مرشح) الكلورامفينيكول الأسهم (25 ملغ / مل في EtOH)، و 375 ميكرولتر من معقمة تصفية (0.22 م مرشح) مخزون carbenicillin (100 ملغ / مل في 50٪ EtOH و 50٪ المياه النقية).
    2. بعد التحريض لتوزيع المضادات الحيوية، واتخاذ 2 مل من وسائل الإعلام كعينة مرجعية لقياس الكثافة البصرية في 600 نانومتر (OD600).
    3. أضف 7.5 مل من ثقافة البداية إلى قارورة التعبير وحضانة لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية مع 250 دورة في الدقيقة.
    4. بعد هذه الخطوة سيتم فحص OD600 من كل قارورة كل 20 دقيقة.
    5. عندما تصل الكثافة البصرية إلى ما يقرب من 0.8 خفض درجة الحرارة إلى 16 درجة مئوية والحث على التعبير الببتيد عن طريق إضافة 750 درجة مئوية من 1 M معقمة تصفية β-isopropyl ثيوغالاكتوسيد (IPTG) في المياه النقية جدا في كل قارورة التعبير.
    6. احتضان قارورة التعبير مع البكتيريا المستحثة في 16 درجة مئوية لمدة 16 ساعة مع 250 دورة في الدقيقة.
  3. اليوم الثالث: استخراج الببتيد المعبر عنه
    1. قبل وزن قارورة الطرد المركزي لتمكين تحديد كتلة بيليه الخلية بعد الحصاد.
    2. حصاد جميع البكتيريا من قوارير التعبير عن طريق الطرد المركزي لمدة 20 دقيقة باستخدام جهاز طرد مركزي تبريده مسبقا في 4000 × ز و 4 درجة مئوية.
    3. صب supernatant ووصمة عار زجاجات الطرد المركزي على منشفة ورقية معقمة.
    4. وزن قوارير الطرد المركزي وحساب كتلة بيليه الخلية.
    5. إعادة تعليق الخلايا، التي يتم تكويرها من 750 مل من زراعة الخلايا الأصلية، في 15 مل من المالحة المخزنة بالفوسفات (PBS، درجة الحموضة 7.4) عن طريق الأنابيب، والطرد المركزي في 4000 × ز لمدة 20 دقيقة عند 4 درجة مئوية. صب supernatant ووصمة عار زجاجات الطرد المركزي على منشفة ورقية معقمة.
    6. إعادة تعليق بيليه الخلية لخطوة lysis في 2 مل من العازلة لكل 1 غرام من بيليه الخلية باستخدام PBS (درجة الحموضة 7.4) تستكمل مع lysozyme (1 ملغ / مل)، 1 mM فينيل ميثيل سولفونل فلوريد (PMSF)، 1 mM البنزاميدين، و 0.5 U من DNase I.
    7. سونيكات الخلايا لمزيد من lysis على الجليد مع sonicator في 8 W لمدة 9 دقائق مع بالتناوب 10 ق سونيكيشن و 20 ق خطوات التوقف، تليها وقفة 9 دقائق خلالها ينبغي تبريد العينة على الجليد. كرر خطوة سونيكيشن 9 دقائق مرة أخرى.
    8. إضافة 2 مل من 10٪ (ث / الخامس) البولي ايثيلينأمين (PEI) لكل 1 لتر من ثقافة الخلية الأصلية لهطول الأمطار حمض نووي.
    9. توزيع العينة في 2 أنابيب الطرد المركزي مل وحضانة في 60 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة تليها حضانة لمدة 10 دقيقة في 4 درجة مئوية.
    10. طرد مركزي الحل في 16،000 × ز لمدة 10 دقيقة في 4 درجة مئوية وجمع supernatant التي تحتوي على ELP.
  4. تنقية البروتين عن طريق ركوب الدراجات في درجة الحرارة العكسية:
    1. ضبط supernatant إلى درجة الحموضة من 2 للتبديل الجزء المائي من الببتيد إلى الكاره للماء والحث على التجميع. لضبط الحموضة، يتم استخدام حمض الفوسفوريك وهيدروكسيد الصوديوم. خطوط درجة الحموضة كافية لتحديد مستوى الحموضة.
    2. لتحسين العائد من تنقية العينة، وتسخين العينة إلى 60 درجة مئوية وإضافة كلوريد الصوديوم تصل إلى 2 M.
    3. في وقت لاحق، الطرد المركزي العينة في 16،000 × ز لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (RT).
    4. تجاهل supernatant وإعادة حل بيليه في PBS (ولكن يتم استخدام نصف فقط من الحجم الأولي بالمقارنة مع الخطوة السابقة).
    5. ضبط الحموضة إلى 7 مع حمض الفوسفوريك وهيدروكسيد الصوديوم. خطوط الحموضة دقيقة بما فيه الكفاية لتحديد الحموضة.
    6. طرد مركزي العينة في وقت لاحق في 16،000 × ز لمدة 10 دقيقة في 4 درجة مئوية.
    7. جمع supernatant وتكرار الخطوات 1.4.1-1.4.6 تصل إلى 3x المجموع، إلا أنه في التكرار الأخير من الخطوة 1.4.4، يتم إضافة الماء فقط بدلاً من PBS.
    8. قياس تركيز الببتيدات مع مطياف امتصاص. استخدام معامل الانقراض من 5500/M/cm في 280 نانومتر.
    9. ضبط تركيز ELP إلى 700 درجة مئوية.

2. إنتاج الحويصلة باستخدام طريقة الخرز الزجاجي

  1. تركيز حل ELP إلى 1.1 mM باستخدام مركز فراغ الطرد المركزي.
  2. مزيج 200 درجة مئوية من محلول ELP المركز مع 1250 ميكرولتر من خليط كلوروفورم/الميثانول 2:1 متبوعاً الدوامة.
  3. أضف 1.5 جم من الخرز الزجاجي الكروي (212-300 ميكرومتر في الحجم) إلى قارورة سفلية مستديرة بمساحة 10 مل.
  4. يُضاف الحل الذي يحتوي على ELP وخليط الكلوروفورم/الميثانول إلى قارورة القاع المستديرة ويُمزج بالاهتزاز اللطيف.
  5. ربط قارورة إلى المبخر الدوارة. ضبط السرعة إلى 150 دورة في الدقيقة وتنظيم الضغط إلى -0.2 × 105 باسكال (-200 مبار) لمدة 4 دقائق تقريبا حتى يتبخر السائل في درجة حرارة الغرفة.
  6. ضع قارورة القاع المستديرة في المجفف لمدة ساعة واحدة على الأقل لضمان تبخر الكلوروفورم المتبقي والميثانول المتبقيين. لتجنب فقدان الخرز الزجاجي، يجب أن تكون ملفوفة رقائق الألومنيوم تعلق فضفاضة حول فتح قارورة أسفل جولة.
  7. لتجربة واحدة، مزيج 100 ملغ من الخرز الزجاجي الببتيد مغطاة مع 60 درجة مئوية من محلول تورم، مثل PBS. احتضان هذه العينة في 25 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
  8. طرد مركزي العينة بسرعة مع جهاز طرد مركزي الجدول الأعلى لرواسب الخرز الزجاجي.
  9. استخدام ماصة لجمع supernatant الذي يحتوي على الحويصلات.

3. نسخ من الحمض النووي الريبي Aptamer dBroccoli داخل الحويصلات

  1. قم بتنظيف مقعد المختبر بالمناديل التي تحتوي على محلول إزالة التلوث RNase لخلق بيئة عمل خالية من RNase.
  2. اخلط ssDNA (5 μM) التي تتألف من تسلسل T7 promotor وdBroccoli (GAGACGGTGTGTATCTGTGTGGAGAGAGAGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGT، فضلا عن حبلا غير الترميز (5 درجة مئوية) في المياه الخالية من النوكليس مع استكمالها مع نوكلليس خالية من المياه RNAPol رد الفعل العازلة [40 mM تريس-حمض الهيدروكلوريك (الرقم الهيدروجيني= 7.9)، 6 ممغكل 2، 1 مليون متر ديثيوثريتول (DTT)، و 2 mM spermidine، لإعداد قالب الحمض النووي لرد فعل النسخ.
  3. احتضان الحل في 90 درجة مئوية لمدة 5 دقائق تليها انخفاض درجة الحرارة بطيئة إلى 20 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
  4. إعداد 1 mM (5Z)-5-(3,5-difluoro-4-hydroxybenzylidene)-2,3-dimethyl-3,5-dihydro-4H-imidazol-4-one (DFHBI) الحل عن طريق حل 1.26 ملغ من DFHBI في 5 مل من DMSO.
  5. إعداد رد فعل النسخ عن طريق خلط المخزن الاحتياطي رد الفعل RNAPol [40 mM تريس-حمضالهيدروكلوريك (الرقم الهيدروجيني = 7.9)، 6 ممغكل 2، 1 مليون متر ديثيوثريتول (DTT)، و 2 mM spermidine] مع 125 مل كيلو كل، 15 مل ملغ كل2،4 م م رنتب، 10 م. دفه، 200 قالب الحمض النووي المليون، 0.5 U/ مثبط اتلاف المورين ، والماء.
  6. قبل بدء التفاعل مباشرة، أضف 4 U/μL T7 polymerase.
  7. استخدم مزيج التفاعل هذا كحل تورم في الخطوة 2.7 وحضانة عند 37 درجة مئوية لمدة التجربة، والتي عادة ما تكون 1 ساعة.

4. النسخ الترجمة (TX-TL) رد فعل

ملاحظة: لرد فعل الترجمة النسخ، مطلوب استخراج خلية الخام، فضلا عن العازلة رد الفعل والحمض النووي. يتم إعداد استخراج الخلية الخام كما هو موضح في Sun et al.18. للحصول على رد فعل TX-TL، استخدم ما يلي: 33٪ (v/v) من مستخلص القولونية الخام، و42٪ (v/v) العازلة رد الفعل، و 25٪ (V / V) الفينول الكلوروفورم الحمض النووي النقي بالإضافة إلى المضافات. التركيزات النهائية هي ما يقرب من 9 ملغ / مل البروتين، 50 مل HEPES (الحموضة = 8)، 1.5 mM ATP، 1.5 مم GTP، 0.9 م م CTP، 0.9 م م UTP، 0.2 ملغ / مل tRNA، 26 MM الإنزيم المساعد A، 0.33 mM NAD، 0.75 mM cAMP، 68 mM حمض الفوليك، 1 M ، 30 مليون نسمة PEP، 1 mDTT، 2٪ PEG-8000، 13.3 mM مالتوز، 1 U من T7 RNA بوليميراز، و 50 nM بلازميد الحمض النووي في المياه النقية جدا.

  1. تنقية الفينول الكلوروفورم من قالب الحمض النووي
    1. إعداد ست ثقافات بين عشية وضحاها مع 5 مل من LB المتوسطة و 5 ميكرولتر من معقمة تصفية (0.22 ميكرومتر مرشح) حل carbenicillin (100 ملغ / مل في 50٪ EtOH و 50٪ من المياه فائقة النقاء).
    2. إضافة خط صغير من مخزون البكتيرية مسبقة الصنع التي تحتوي على DH5α E. القولونية مع ناقلات التعبير pET20b(+) إلى كل ثقافة ليلة وضحاها 5 مل قبل تسخينها وحضانة في 37 درجة مئوية لمدة 16 ساعة مع 250 دورة في الدقيقة. اعتمادا على الببتيد (EF) أو البروتين (YPet أو mVenus) هو أن يعبر عنه، يتم استخدام بلازميد ترميز معين.
    3. استخراج بلازميد مع مجموعة مصغرة الإعدادية كما هو موضح في دليل المستخدم أو باتباع البروتوكول الذي قدمه تشانغ وآخرون24.
    4. إعداد 100 ميكرولتر من الحمض النووي البلازميد المنقى مسبقاً (يمكن أن يتراوح التركيز بين 200-600 نانوغرام/لتر) ويخلط مع 100 ميكرولتر من كحول روتي-فينول/كلوروفورم/إيزواميل (درجة الحموضة = 7.5-8.0) في أنبوب الطرد المركزي الدقيق لتمكين فصل أفضل للمرحلة.
    5. عكس بلطف الأنبوب تصل إلى 6X والطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 16،000 × ز في RT.
    6. إضافة 200 درجة مئوية من الكلوروفورم إلى المرحلة العليا من الأنبوب وعكس الأنبوب تصل إلى 6X.
    7. الطرد المركزي العينة في 16،000 × ز لمدة 5 دقائق في RT.
    8. Pipet supernatant إلى أنبوب منفصل وإضافة 10 ميكرولتر من 3 M من خلات الصوديوم لهطول الأمطار الإيثانول.
    9. إضافة 1 مل من -80 درجة مئوية الإيثانول البارد وتخزين العينة في -80 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
    10. الطرد المركزي العينة في 16،000 × ز لمدة 15 دقيقة في 4 درجة مئوية.
    11. Decant supernatant وإضافة 1 مل من -20 درجة مئوية الباردة 70٪ (V / V) الإيثانول.
    12. الطرد المركزي في 16،000 × ز لمدة 5 دقائق في 4 درجة مئوية.
    13. إزالة السائل عن طريق الأنابيب. يجب الحرص على عدم إزعاج بيليه الحمض النووي.
    14. تخزين العينة في RT لمدة 15 دقيقة تقريبا لتبخر الإيثانول المتبقية.
    15. إضافة الماء النقي جدا إلى العينة لضبط تركيز العينة إلى ما يقرب من 300 نانومتر، والذي يقاس بالامتصاص في 260 نانومتر.
  2. إعداد رد فعل TX-TL
    1. إذابة استخراج الخلية الخام المعدة والعازلة رد الفعل على الجليد.
    2. بالنسبة لمزيج التفاعل بسعة 60 ميكرولتر، أضف الحمض النووي بلازميد (الفينول كلوروفورم المنقى) إلى 37.5 ميكرولتر من المخزن المؤقت للرد [50 مم HEPES (درجة الحموضة = 8)، 1.5 م م ATP، 1.5 مم GTP، 0.9 مليون متر من CTP، 0.9 مليون متر من الـ UTP، 0.2 ملغم/ملي طن، 26 مم إنزيم A، 0.33 م ، 0.75 m cAMP، 68 mM حمض فولينيك، 1 mM spermidine، 30 MM PEP، 1 MM DTT، 2٪ PEG-8000، و 13.3 mM مالتوز)، تليها إضافة 28.7 ميكرولتر من استخراج الخلايا الخام. املأ إلى حجم نهائي مع المياه فائقة النقاء إلى 58.8 ميكرولتر.
    3. قبل بدء التفاعل مباشرة، أضف 1.2 درجة مئوية من محلول بوليميراز T7 RNA واخلط العينة عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا.
    4. استخدم مزيج التفاعل هذا كحل تورم في الخطوة 2.7 واحتضنه عند 29 درجة مئوية طوال مدة التجربة، والتي عادة ما تكون 4-8 ساعة.

5. اقتران الببتيدات الشبيهة بالإيلاستين مع الفلوروفور عن طريق النحاس المحفز ة أزيد-ألكيين هويسن سيكلوأدكسيد

  1. إعداد 20 مل NHS-azide linker (γ-azidobutyric حمض N-هيدروكسيسوتشينيم استر) حل في DMSO.
  2. مزيج 250 ميكرولتر من محلول ELP (600 درجة مئوية) مع PBS (8 g/L كلوريد كلوريد الضوض، 0.2 غرام / لتر كيلوكل، 1.42 غرام / لتر Na2HPO4،0.27 غرام / لتر K2HPO4،ودرجة الحموضة = 7.2) وNHS-azide (1.2 mM) والحضانة لمدة 12 ساعة في RT.
  3. تحميل العينة في 10 كيلوديدا غسيل الكلى كاسيت وتخزينها في 4 درجة مئوية لمدة 12 ساعة في 1 لتر من الماء النقي جدا لإزالة الأملاح والمتبقية NHS-azide.
  4. امزج ELP المنشط (500 درجة مئوية) مع الصبغة المترافقة بالألكيين (500 درجة مئوية)، أو Cy5-alkyne، أو Cy3-alkyne.
  5. خلط هذه العينة مع 1 M TBTA (تريس (البنزليلتريازولميثيل ميثيل) أمين)، 10 MM TCEP (تريس (2-كاربوكسيإيثيل)- فوسفيني هيدروكلوريد) و 10 MM CuSO4 واحتضان في 4 درجة مئوية لمدة 12 ساعة.
  6. تحميل العينة في 10 كيلودا غسيل الكلى كاسيت وتخزينها في 4 درجة مئوية لمدة 12 ساعة في 1 لتر من الماء النقي جدا، لإزالة الأملاح والأصباغ المتبقية الألكين المترافقة.
  7. وتستخدم هذه ELPs الصبغ المعدلة في خليط 1:1 من ELPs Cy3 المسمى وCY5 المسمى ELPs مماثلة للببتيدات في الجزء الثاني.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

إنتاج الحويصلات
ويبين الشكل 1 صورة مجهرية إلكترونية للإرسال (TEM) لمن الحويصلات المعدة باستخدام حلول مختلفة للتورم وطريقة الخرز الزجاجي (انظر أيضاً Vogele et al.11). بالنسبة للعينة في الشكل 1A، تم استخدام PBS فقط كحل تورم لإثبات تشكيل الحويصلات وتحديد حجمها. عندما تم استخدام TX-TL كحل تورم (الشكل1B)،شكلت الحويصلات أيضا. تم إجراء قياسات تشتت الضوء الديناميكي (DLS) لإظهار أن طريقة الخرز الزج...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

الإماهة الفيلم هو إجراء شائع لخلق الحويصلات يونيلاميلار الصغيرة. المصدر الرئيسي للفشل هو التعامل الخاطئ مع المواد المستخدمة في الإجراء.

في البداية، يتم إنتاج ELPs من قبل خلايا القولونية E. . العائد بعد تنقية ELP يمكن أن تختلف اختلافا كبيرا اعتمادا على مدى دقة البروتوكول يتم خلال خطواته الحاسمة. هذه هي درجة الحرارة العكسية ركوب الدراجات (ITC) خطوة وإعادة تعليق ELPs بعد هطول الأمطار. لتنقية، قمنا بانهيار الببتيد الكاره ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ولا يعلن صاحبا البلاغ عن أي مصالح مالية متنافسة.

شكر وتقدير

نعرب عن امتناننا للدعم المالي من خلال DFG TRR 235 (ظهور الحياة، المشروع P15)، ومجلس البحوث الأوروبي (اتفاق المنحة رقم 694410 AEDNA)، وكلية الدراسات العليا الدولية للعلوم والهندسة في TUM IGSSE (المشروع رقم 9.05) . نشكر إي فالغنهاور على مساعدتها في إعداد العينات. نشكر أ. دوبين وم. شوارتز شيلينغ على مساعدتهما في نظام TX-TL والمناقشات المفيدة. نشكر ن. ب. هولاند على المناقشات المفيدة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
2xYTMP الطب الحيوي3012-032
3-PGASigma-AldrichP8877
5PRIME Phase Lock Gel TM أنبوبVWR733-2478
Cy3Sigma-Aldrich777331
المترافق بالألكين Cy5سيجما ألدريتش777358
ATPسيجما ألدريتشA8937
بنزامدينكارل روثCN38.2
BL21 رشيد 2 E. قولونية< إم > سلالةنوفاجين71402
برادفورد BSA مجموعة فحص البروتينBio-rad500-0201
cAMPسيجما ألدريتشA9501
كاربينسيلينكارل روث6344.2
كلورامفينيكولسيجما ألدريتشC1919
كلورامفينيكولكارل روث3886.3
كلوروفورمكارل روث4432.1
CoAسيجما ألدريتشC4282
CTPUSB14121
CuSO4< / sub>Carl RothP024.1
DFHBILucerna Technologies410
DMSOكارل روثA994.1
DNase INEBM0303S
DTTSigma-AldrichD0632
الإيثانولكارل روث9065.2
حمض الفولينيكسيجما ألدريتشF7878
خرز زجاجي مغسول بالحمضسيجما ألدريتشG1277
GTPUSB16800
هيبسسيجما ألدريتشH6147
IPTG (بيتا إيزوبروبيل ثيوجالاكتوزيد)سيجما ألدريتشI6758
KClكارل روثP017.1
K-glutamateسيجما ألدريتشG1149
LB مرقكارل روثX968.2
ليزوزيمسيجما ألدريتشL6876
الميثانولكارل روث82.2
MgCl2< / sub>Carl RothKK36.3
Mg-glutamateSigma-Aldrich49605
أعمدة كروماتوغرافيا الميكرو الحيويةBio-Rad732-6204
NADSigma-AldrichN6522
رابط NHS-azide (إستر أوكسي سوكسينيميد حمض y-azidobutyric)BaseclickBCL-033-5
PEG-8000Carl Roth263.2
خطوط الأس الهيدروجينيكارل روث549.2
فينيل ميثيل سلفونيل فلوريدكارل روث6367.2
محلول ملحي مخزن بالفوسفاتVWR76180-684
حمضالفوسفوريكSigma-AldrichW290017
البولي إيثيلين إيثيلينسيجما ألدريتش408727
محلول ثنائي القاعدة فوسفات البوتاسيومSigma-AldrichP8584
محلول أحادي القاعدة لفوسفات البوتاسيومSigma-AldrichP8709
Qiagen Miniprep KitQiagen27106
RNAPol المخزن المؤقت للتفاعلNEBB9012
الفئران المثبطة RNaseNEBM0314S
RNaseمناديل ZapThermoFisherAM9788
rNTPNEBN0466S
روتي-فينول / كلوروفورم / إيزواميل كحولكارروثA156.1
RTS عينات الأحماض الأمينية5 كاسيت غسيلالكلى Prime 2401530
Slide-A-Lyzer ، 10 كيلو MWCO (طقم)Thermo-Scientific66382
كلوريد الصوديومكارل روث9265.1
هيدروكسيد الصوديومكارل روث8655.1
سبيرميدينسيجما ألدريتش85558
معقم مفلتر (0.22 وميكرو ؛ مرشح م)كارل روثXH76.1
T7 بوليميرازNEBM0251S
TBTA (تريس (بنزيل تريازوليل ميثيل) أمين)سيجما ألدريتش678937
TCEP (تريس (2-كربوكسي إيثيل) - هيدروكلوريد الفوسفين)سيجما ألدريتشC4706
قاعدة تريسفيشرBP1521
tRNA (من الإشريكية القولونية)روش تطبيقي العلومMRE600
UTPUSB23160

المراجع

  1. Chen, I. A., Szostak, J. W. A kinetic study of the growth of fatty acid vesicles. Biophysical Journal. 87 (2), 988-998 (2004).
  2. Nourian, Z., Roelofsen, W., Danelon, C. Triggered gene expression in fed-vesicle microreactors with a multifunctional membrane. Angewandte Chemie International Edition. 51 (13), 3114-3118 (2012).
  3. Hardy, M. D., et al. Self-reproducing catalyst drives repeated phospholipid synthesis and membrane growth. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (27), 8187-8192 (2015).
  4. Scott, A., et al. Cell-Free Phospholipid Biosynthesis by Gene-Encoded Enzymes Reconstituted in Liposomes. PLoS ONE. 11 (10), e0163058(2016).
  5. Deamer, D. W., Barchfeld, G. L. Encapsulation of macromolecules by lipid vesicles under simulated prebiotic conditions. Journal of Molecular Evolution. 18 (3), 203-206 (1982).
  6. Adamala, K., Szostak, J. W. Nonenzymatic Template-Directed RNA Synthesis Inside Model Protocells. Science. 342 (6162), 1098-1100 (2013).
  7. Zhu, T. F., Szostak, J. W. Coupled growth and division of model protocell membranes. Journal of the American Chemical Society. 131 (15), 5705-5713 (2009).
  8. Kurihara, K., et al. Self-reproduction of supramolecular giant vesicles combined with the amplification of encapsulated DNA. Nature Chemistry. 3 (10), 775-781 (2011).
  9. Chu, H. -S., et al. Expression analysis of an elastin-like polypeptide (ELP) in a cell-free protein synthesis system. Enzyme and Microbial Technology. 46 (2), 87-91 (2010).
  10. Martino, C., et al. Protein Expression, Aggregation, and Triggered Release from Polymersomes as Artificial Cell-like Structures. Angewandte Chemie International Edition. 51 (26), 6416-6420 (2012).
  11. Vogele, K., et al. Towards synthetic cells using peptide-based reaction compartments. Nature Communications. 9 (1), 3862(2018).
  12. Huber, M. C., et al. Designer amphiphilic proteins as building blocks for the intracellular formation of organelle-like compartments. Nature Materials. 14 (1), 125-132 (2014).
  13. McPherson, D. T., Xu, J., Urry, D. W. Product purification by reversible phase transition following Escherichia coli expression of genes encoding up to 251 repeats of the elastomeric pentapeptide GVGVP. Protein Expression and Purification. 7 (1), 51-57 (1996).
  14. Urry, D. W. Physical chemistry of biological free energy transduction as demonstrated by elastic protein-based polymers. The Journal of Physical Chemistry B. 101 (51), 11007-11028 (1997).
  15. Urry, D. W., et al. Elastin: a representative ideal protein elastomer. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 357 (1418), 169-184 (2002).
  16. Meyer, D. E., Chilkoti, A. Purification of recombinant proteins by fusion with thermally-responsive polypeptides. Nature Biotechnology. 17 (11), 1112-1115 (1999).
  17. Meyer, D. E., Chilkoti, A. Genetically encoded synthesis of protein-based polymers with precisely specified molecular weight and sequence by recursive directional ligation: examples from the elastin-like polypeptide system. Biomacromolecules. 3 (2), 357-367 (2002).
  18. Sun, Z. Z., et al. Protocols for implementing an Escherichia coli based TX-TL cell-free expression system for synthetic biology. Journal of Visualized Experiments. (79), e50762(2013).
  19. Caschera, F., Noireaux, V. Synthesis of 2.3 mg/ml of protein with an all Escherichia coli cell-free transcription-translation system. Biochimie. 99, 162-168 (2014).
  20. Schwarz-Schilling, M., Aufinger, L., Mückl, A., Simmel, F. C. Chemical communication between bacteria and cell-free gene expression systems within linear chains of emulsion droplets. Integrative Biology. 8 (4), 564-570 (2016).
  21. Garamella, J., Marshall, R., Rustad, M., Noireaux, V. The All E. coli TX-TL Toolbox 2.0: A Platform for Cell-Free Synthetic Biology. ACS Synthetic Biology. 5 (4), 344-355 (2016).
  22. Rideau, E., Dimova, R., Schwille, P., Wurm, F. R., Landfester, K. Liposomes and polymersomes: a comparative review towards cell mimicking. Chemical Society Reviews. 47 (23), 8572-8610 (2018).
  23. Filonov, G. S., Moon, J. D., Svensen, N., Broccoli Jaffrey, S. R. Broccoli: Rapid Selection of an RNA Mimic of Green Fluorescent Protein by Fluorescence-Based Selection and Directed Evolution. Journal of the American Chemical Society. 136 (46), 16299-16308 (2014).
  24. Zhang, S., Cahalan, M. D. Purifying Plasmid DNA from Bacterial Colonies Using the Qiagen Miniprep Kit. Journal of Visualized Experiments. (6), 247(2007).
  25. Stetefeld, J., McKenna, S. A., Patel, T. R. Dynamic light scattering: a practical guide and applications in biomedical sciences. Biophysical Reviews. 8 (4), 409-427 (2016).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

ELP FRET RNA
في فيسيكولو التوليف من السلائف غشاء الببتيد لنمو الحويصلة المستقلة
اتصل بنا
أوصِ بها للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

2026 © حقوق الطبع والنشر MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.