Doliolids، بما في ذلك الأنواع Dolioletta gegenbauri، هي العوالق الحيوانية البحرية الجيلاتينية الصغيرة ذات الأهمية الإيكولوجية الموجودة على نظم الجرف شبه القارية المنتجة في جميع أنحاء العالم. صعوبة زراعة هذه الكائنات الحساسة تحد من تحقيقها. في هذه الدراسة، ونحن نصف نهج زراعة لجمع وتربية، والحفاظ على doliolid Dolioletta gegenbauri.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
زراعة البحرية التونيكات دوليوليتا gegenbauri (Uljanin 1884) للدراسات التجريبية
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
تلعب العوالق الحيوانية الجيلاتينية دوراً حاسماً في النظم الإيكولوجية للمحيطات. ومع ذلك، فمن الصعب عموما للتحقيق في علم وظائف الأعضاء، والنمو، والخصوبة، والتفاعلات الغذائية ويرجع ذلك في المقام الأول إلى التحديات المنهجية، بما في ذلك القدرة على ثقافتهم. وهذا ينطبق بشكل خاص على دوليوليد، دوليوليتا غيغنبوري. D. gegenbauri يحدث عادة في نظم الجرف القاري شبه الاستوائية المنتجة في جميع أنحاء العالم، وغالبا ما يكون في تركيزات ازهر قادرة على استهلاك جزء كبير من الإنتاج الأولي اليومي. في هذه الدراسة، نقوم بوصف نُهج الزراعة لجمع وتربية وصيانة D. gegenbauri لغرض إجراء دراسات مختبرية. D. gegenbauri وغيرها من الأنواع doliolid يمكن التقاطها على الهواء مباشرة باستخدام شبكات العوالق المخروطية قطرها بشكل غير مباشر 202 م من سفينة عائمة. يتم تأسيس الثقافات بشكل موثوق به عندما تكون درجات حرارة المياه أقل من 21 درجة مئوية وتبدأ من الغونوزويد غير ناضجة، وphorozooids النضج، والممرضات الكبيرة. ويمكن الحفاظ على الثقافات في أوعية الثقافة المستديرة على عجلة العوالق الدوارة ببطء والحفاظ عليها على نظام غذائي من الطحالب المستزرعة في مياه البحر الطبيعية لأجيال عديدة. بالإضافة إلى القدرة على إنشاء الثقافات المختبرية من D. gegenbauri،ونحن نثبت أن حالة جمع، تركيز الطحالب، ودرجة الحرارة، والتعرض لمياه البحر مكيفة بشكل طبيعي كلها حاسمة للثقافة إنشاء, النمو, البقاء على قيد الحياة, واستنساخ D. gegenbauri.
المقدمة
تمثل العوالق الحيوانية أكبر كتلة حيوية حيوانية في المحيط، وهي مكونات رئيسية في شبكات الأغذية البحرية، وتلعب أدوارا هامة في الدورات البيوجيوكيميائية للمحيطات1و2. العوالق الحيوانية، على الرغم من أنها تتألف من تنوع كبير من الكائنات الحية، يمكن تمييزها بشكل صارخ في فئتين: الجيلاتين وغير الجيلاتينمع عدد قليل من الضريبة المتوسطة3،4. بالمقارنة مع العوالق الحيوانية غير الجيلاتينية، العوالق الحيوانية الجيلاتينية من الصعب بشكل خاص لدراسة بسبب تاريخها الحياة المعقدة5، وتلف الأنسجة الحساسة بسهولة أثناء التقاط والتعامل معها. أنواع العوالق الحيوانية الجيلاتينية، وبالتالي، من الصعب على نحو سيء السمعة للثقافة في المختبر وعموما أقل دراسة بالمقارنة مع الأنواع غير الجيلاتينية6.
ومن بين مجموعات العوالق الحيوانية الجيلاتينية، هناك مجموعة وفيرة وذات أهمية إيكولوجية في محيط العالم هي التالياسيين. Thaliaceans هي فئة من التونيكات البحرية التي تشمل أوامر سالبيدا، بيروسوميدا، وDoliolida7. وDoliolida، التي يشار إليها مجتمعة باسم الدوليوليدات، هي كائنات بحرية صغيرة على شكل برميل سباحة حرة يمكن أن تصل إلى وفرة عالية في المناطق النِرية المنتجة للمحيطات شبه المدارية. Doliolids هي من بين الأكثر وفرة من جميع مجموعات العوالق الحيوانية4،8. كما مغذيات التعليق، doliolids جمع جزيئات الطعام من عمود الماء عن طريق خلق تيارات فلتر والتقاطها على شبكات المخاط9. تصنيف هادليوليدات في فيلوم أوروخورداتا10. الأجداد إلى الجوقة، وبالإضافة إلى أهميتها الإيكولوجية كمكونات رئيسية للنظم البحرية البحرية، Thaliaceans هي ذات أهمية لفهم أصول تاريخ الحياة الاستعمارية10،11 والتطور من الجوقة5،7،10،12،13،14.
تاريخ حياة doliolids معقد ويسهم في صعوبة في زراعة والحفاظ عليها من خلال دورة حياتهم. ويمكن الاطلاع على استعراض لدورة حياة دولوليد والتشريح في Godeaux وآخرون15. دورة حياة دولوليد، التي تنطوي على التناوب الإلزامي بين مراحل الحياة الجنسية وغير الجنسية تاريخ الحياة، وترد في الشكل 1. يتم إنتاج البيض والحيوانات المنوية من قبل gonozooids hermaphroditic، المرحلة الانفرادية الوحيدة من دورة الحياة. تطلق الحيوانات المنوية من الغونوزويد إلى عمود الماء ويتم تخصيب البويضات داخلياً وإطلاقها لتصبح يرقات. تفقس اليرقات وتتحول إلى oozooids التي يمكن أن تصل إلى 1-2 ملم. الأوزويد تنتج براعم غير جنسية على stolon البطني. هذه البراعم ترك stolon والهجرة إلى cadophore الظهرية حيث يصطفون في ثلاثة صفوف مقترنة. يصبح الصفوف مركزية مزدوجة [فوروزويدس] والخارجيّة اثنان صفوف مزدوجة يصبح [تروبهوزويدس]. هذا الأخير توفير الغذاء لكل من الممرضة وphorozooids16،17. التروبهوزويد تزود الممرضة بالتغذية لأنها تفقد جميع الأعضاء الداخلية. مع زيادة وفرة التروبهوزويد ، يمكن أن يصل حجم الممرضة إلى 15 مم في المختبر. كما تنمو phorozooids، فإنها بتزايد تناول فريسة العوالق وتصل إلى ~ 1.5 ملم في الحجم قبل أن يطلق سراحه كأفراد17. ممرضة واحدة قد تطلق سراح > 100 phorozooids خلال عمرها18. بعد أن يتم تحرير phorozooids من cadophore، فإنها لا تزال تنمو وهي المرحلة الاستعمارية الثانية من دورة الحياة. بمجرد أن تصل إلى حوالي 5 ملم في الحجم، كل phorozooid يطور مجموعة من الغونوزويد على peduncle البطني. هذه gonozooids يمكن تناول الجسيمات عندما تصل إلى ~ 1 ملم في الطول. بعد أن وصلت gonozooids ~ 2 إلى 3 ملم في الحجم يتم الإفراج عنهم من phorozooid وتصبح المرحلة الانفرادية الوحيدة من دورة الحياة. بمجرد أن تصل إلى ~ 6 ملم في الحجم، gonozooids تصبح ناضجة جنسيا17. يمكن أن تصل الغونوزويد إلى 9 مم أو أكثر في الطول. Gonozooids هي hermaphroditic ، يتم تحرير الحيوانات المنوية بشكل متقطع في حين أن تخصيب البيض يحدث داخليا16،17. عندما يكون الغونوزويد ≥ 6 مم في الحجم، فإنه يطلق ما يصل إلى 6 البيض المخصبة. يتطلب النجاح في الزراعة دعم الاحتياجات المحددة لكل مرحلة من مراحل تاريخ الحياة الفريدة هذه.
نظراً للأهمية الإيكولوجية والتطورية للثالياسيين، بما في ذلك الدوليوليدات، هناك حاجة لمنهجيات الزراعة لتعزيز فهم البيولوجيا الفريدة لهذا الكائن الحي، وعلم وظائف الأعضاء، والإيكولوجيا، والتاريخ التطوري19 . Doliolids لديها وعد كبير ككائنات نموذجية تجريبية في البيولوجيا التنموية وعلم الجينوم الوظيفي لأنها شفافة ومن المرجح أن تكون الجينومات مبسطة20،21. غير أن الافتقار إلى أساليب زراعة موثوقة يعوق فائدتها كنماذج مختبرية. على الرغم من أن حفنة من المختبرات قد نشرت نتائج على أساس doliolids المستزرعة، لم يتم نشر نهج زراعة المعرفة لدينا والبروتوكولات التفصيلية من قبل. استنادا إلى سنوات من الخبرة، ومحاولات زرع التجربة والخطأ، وكان الغرض من هذه الدراسة لاستعراض الخبرات وتبادل بروتوكولات لجمع وزراعة doliolids، وعلى وجه التحديد الأنواع Dolioletta gegenbauri.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1- إعداد مرافق الزراعة لتربية د.
ملاحظة: جميع المواد والمعدات المطلوبة مدرجة في جدول المواد.
- إعداد 1 M هيدروكسيد الصوديوم (هيدروكسيد الصوديوم NaOH)، 0.06 M برمنغنات البوتاسيوم (KMnO4)الحل. لإعداد هذا الحل، حل 400 غرام من هيدروكسيد الصوديوم في 10 L الماء منزوع الأيونات. أضف 100 غرام من KMnO4 إلى حل هيدروكسيد الصوديوم واخلطجيداً.
- إعداد 0.1 M الصوديوم bisulfite(NaHSO 3) الحل عن طريق حل 100 غرام من NaHSO3 في 10 L الماء منزوع الأيونات ومزيج جيدا.
تحذير: هذه الكواشف هي المهيجات التي قد تسبب مشاكل في الجهاز التنفسي إذا استنشق. مكان في منطقة جيدة التهوية مثل غطاء محرك الدخان. تجنب أي اتصال الجلد. ارتداء قفازات واقية، والملابس الواقية، وحماية العين، وحماية الوجه عند المناولة. - قبل إنشاء وتربية الثقافات doliolid في المختبر، وتنظيف وتعقيم الجرار الثقافة.
- شطف 1.9 L و 3.8 L الجرار ثقافة 3 مرات على الأقل مع الماء منزوع الأيونات. السماح للقبعات المسمار لتجف، كما لا يتم تضمين قبعات في خطوات التنظيف التالية.
- تنظيف وتعقيم 1.9- و 3.8 L الجرار ثقافة الزجاج عن طريق غمر لهم في حل هيدروكسيد الصوديوم / KMnO 4. السماح للجرار لنقع بين عشية وضحاها.
- إزالة الجرار من محلول هيدروكسيد الصوديوم / KMnO4 وتزج الجرار في ثنائيصود الصوديوم (NaHSO3)الحل. السماح للجرار لنقع بين عشية وضحاها.
- إزالة الجرار من محلول NaHSO3 وشطف جيدا بالماء منزوع الأيونات. السماح للجرار لتجف.
- وضع عجلة العوالق (الشكل2)في مساحة التحكم في درجة الحرارة (غرفة البيئية). معادلة درجة الحرارة إلى 20 درجة مئوية. للحصول على وصف أكثر تفصيلا لعجلة العوالق المخصصة يرجى الرجوع إلى الشكل التكميلي 1.
2- ثقافة العوالق النباتية
- الحصول على ثقافات الطحالب من المركز الوطني للطحالب البحرية والميكروبيوتا (NCMA) أو مصادر أخرى لاستخدامها كغذاء لD. gegenbauri. تم الحصول على خليط من نوعين من الفلاجيلات بما في ذلك Isochrysis galbana (CCMP 1323)، Rhodomonas sp (CCMP 740)، ودياتوم صغير، Thalassiosira weissflogii (CCMP 1051) وتم استخدامها في المختبر السابق دراسات إلى [دولوليدس] خلفيّة بنجاح17.
- إعداد L1 و L1-Si نمو وسائل الإعلام22 على النحو الموصى به من قبل NCMA.
- اتبع التعليمات التي يقدمها المورد لبدء الثقافات الطحالب الجديدة.
- للحفاظ على ثقافات الأسهم، وذلك باستخدام تقنيات صارمة للثقافة الفأس، نقل 0.5 مل من الثقافة senescing القديمة إلى 25 مل من وسائل الإعلام النمو الطازجة في أنابيب ثقافة الزجاج معقمة 55 مل كل أسبوعين.
ملاحظة: ليس من الممكن تخزين الثقافات الطحالب الحية دون نقلها بانتظام. وإذا لم تستخدم الثقافات لفترات طويلة، ولم يكن من الممكن الحفاظ على الثقافات طوال فترة عدم الاستخدام، يوصى بإعادة اكتساب هذه الثقافات الطحالب الشائعة من مصادرها الأصلية (على سبيل المثال، NCMA). - إعداد كميات أكبر من العوالق النباتية لتغذية doliolids في نظيفة 500 مل براميل زراعة الأنسجة البلاستيكية التي تحتوي على 200 مل من وسائل الإعلام النمو.
- تلقيح العوالق النباتية من مخزونات axenic (4 مل) إلى 200 مل من وسائل الإعلام النمو (1:50 تخفيف).
- حضانة في 20 درجة مئوية مع 12:12 ساعة ضوء: دورة مظلمة تحت إضاءةالضوء الأبيض بارد من 65-85 درجة مئوية / م 2. وضع قارورة الثقافة شقة لتحقيق أقصى قدر من الإضاءة. تدور الثقافة بلطف يوميا.
- تحديد تركيز الخلايا باستخدام عداد الجسيمات أو المجهر لرصد نمو الثقافات.
ملاحظة: بعد 7-10 أيام من التلقيح، سوف تحتوي الثقافاتflagellate ~ 10 5-106 خلايا/مل وثقافة دياتوم سوف تحتوي على ~ 10 4-105 خلايا /مل. هذه التركيزات كافية للحفاظ على الثقافات doliolid. - بدء مخزونات تغذية جديدة على الأقل كل أسبوعين لتوفير ما يكفي من الكتلة الحيوية الطحالب لدعم جميع الأنشطة الثقافية.
3- جمع الدوليوليدات البرية ومياه البحر من أجل الثقافة
ملاحظة: يرد في الشكل 3بيان عام عن نُهُج الجمع والزراعة. ويرد في الشكل 4وصف لصافي العوالق المتخصصة ونهاية سمك القد.
- حدد موقع doliolids عن طريق الكشف عنها باستخدام إما شبكات العوالق أو أنظمة التصوير في الموقع23.
ملاحظة: لأن doliolids نادرا ما تكون موجودة في المياه السطحية وغير قابلة للكشف عن طريق تكنولوجيا الاستشعار عن بعد، تسترشد المعرفة المسبقة للظروف المواتية للdoliolids (انظر المناقشة)،يجب تحديد وجود doliolids قبل أخذ العينات. - جمع مياه البحر الغنية بالجسيمات قبل جمع doliolids الحية استعدادا لبدء ثقافة D. gegenbauri.
- نشر زجاجات نيسكين المثبتة على وردة CTD أو ما يعادلها من المعدات لجمع المياه من الموقع حيث توجد doliolids ومن العمق الذي يحتوي على أعلى تقديرات الكلوروفيل تركيز يقدر من قبل قياس الفلوروم في الموقع.
ملاحظة: يستخدم الكلوروفيل تركيز كمؤشر لتركيزات الجسيمات. وفي الجرف القاري في جنوب المحيط الأطلسي، يكون الكلوروفيل تحت سطح الأرض، وهو الحد الأقصى، عادة ما يكون قريبا ً من القاع، ولكن في مواقع أخرى، قد لا يكون كذلك.
- نشر زجاجات نيسكين المثبتة على وردة CTD أو ما يعادلها من المعدات لجمع المياه من الموقع حيث توجد doliolids ومن العمق الذي يحتوي على أعلى تقديرات الكلوروفيل تركيز يقدر من قبل قياس الفلوروم في الموقع.
- بمجرد أن يتم تحديد موقع doliolids، واستعادة zooids doliolid غير التالفة باستخدام شبكة العوالق المتخصصة ونهاية سمك القد. قبل نشر الشبكة، ملء نهاية سمك القد مع مياه البحر.
- من سفينة الانجراف، وانخفاض ورفع الشبكة من خلال عمود المياه الحفاظ على زاوية سحب مائلة من ~ 15 - 25 درجة وسرعة النشر واسترجاع عمودي لا يزيد عن 15 م / دقيقة.
- بمجرد أن تكون الشبكة على متن الطائرة، نقل بلطف وتقسيم محتويات نهاية سمك القد إلى 3، 5 غالون (~ 20 L) الدلاء البلاستيكية كل تحتوي على ~ 10 لتر من مياه البحر السطحية التي تم جمعها من الموقع.
ملاحظة: يجب أن تكون مشروطة الدلاء البلاستيكية الجديدة بإضافة أيام مياه البحر قبل جمع doliolid المعيشة. والهدف من ذلك هو الحد من غسل المواد الكيميائية من البلاستيك. إذا لم تكن مياه البحر متوفرة، استخدم مياه المناقية (على سبيل المثال، ميلي كيو) أو مياه الصنبور الخالية من الملوثات السامة لتكييف الدلاء. - عزل zooids doliolid من العوالق الأخرى.
- في دفعات صغيرة (~ 2 L) نقل العوالق مختلطة من محتويات السحب صافي (الآن في 20 L الدلاء البلاستيكية) إلى كوب زجاجي 2 L.
- باستخدام ماصة زجاجية واسعة الملل (8 مم ID × 38 سم طول)، سيفون بعناية ونقل بنشاط السباحة zooids doliolid من الكأس إلى الجرار ثقافة الزجاج النظيف التي تحتوي على مياه البحر الغنية بالجسيمات التي تم جمعها باستخدام زجاجات Niskin من حيث doliolids كانت الموقع.
- قم بالإفراج برفق عن الحيوانات الحيوانية الدوليوليدة تحت سطح مياه البحر.
ملاحظة: جمع gonozooids، phorozooids التي تحتوي على الغونوزويد النامية المرفقة، ومراحل التمريض التي تحتوي على trophozooids المرفقة (الشكل1).
- بعد إضافة doliolids، إضافة ثقافة Rhodomonas sp. إلى تركيز نهائي من ~ 5 × 103 - 104 خلايا / مل (~ 50 مل من ثقافة تحتوي على ~ 5 × 104 - 1 × 105 خلايا / مل في جرة 3.8 لتر). هذا هو لتحديد ما إذا كانت doliolids تتغذى بنشاط. عندما doliolids تناول Rhodomonas sp.، سوف تظهر الجهاز الهضمي الأحمر في اللون. إزالة zooids التي لا يبدو أن التغذية.
- لمنع doliolids من الوقوع في المحاصرين في واجهة الهواء والماء، وتجنب مساحة الرأس في الجرار الثقافة عن طريق ملء تماما الجرار مع مياه البحر الغنية بالجسيمات غير المصفاة ووضع قطعة من البلاستيك التفاف على فتح جرة (89 ملم واسعة).
- تجنب إنشاء فقاعات الهواء التي يمكن أن تضر أيضا الحيوانات. المسمار بعناية الغطاء على جرة وعكس بلطف جرة لتحديد ما إذا كانت فقاعات موجودة. إذا كانت الفقاعات موجودة، قم بإزالتها.
- بعد ملء الجرار، امسح المياه الزائدة من خارج الجرة.
- جبل كل جرة على عجلةالعوالق (الشكل 2) عن طريق وضع جرة على قضبان معدنية عمودية مغطاة أنابيب المطاط، وبين المشبك خرطوم الفولاذ المقاوم للصدأ.
- تأكد من أن الجزء الخلفي من جرة خففت ضد أنابيب المطاط. تشديد المشبك خرطوم حول جرة عن طريق ضبط المسمار.
- تأكد من أن الجرة لا تتحرك بمجرد تثبيتها بشكل آمن في مكانها. السماح للجرار لتدوير في 0.3 دورة في الدقيقة للحفاظ على doliolids في تعليق.
تحذير: من المهم عدم الإفراط في تشديد جرة لمنع جرة من تكسير.
- على متن السفينة، والحفاظ على السفن الثقافة على عجلة العوالق في 20 درجة مئوية في ضوء خافت حتى يمكن نقلها إلى منشأة الثقافة المختبرية.
- عند العودة إلى المختبر، نقل الجرار التي تحتوي على doliolids في مرفق الثقافة المعدة. جبل الجرار على عجلة العوالق (انظر الخطوة 3.8) والسماح للجرار لمواصلة تدوير في 0.3 دورة في الدقيقة.
ملاحظة: تم إجراء جميع تربية doliolids في هذه الدراسة في 20 درجة مئوية.
4- الحفاظ على ثقافات د. غيغينبوري
- من السفينة إلى المختبر، والسماح للالحيوانات لالتكيف في الجرار الأصلية لظروف المختبر لمدة 3 أيام.
- خلال فترة التأقلم، استخدم ماصة زجاجية واسعة لمبادلة 10٪ من المياه مع مياه البحر الغنية بالجسيمات غير المصفاة من موقع الجمع كل يوم لمدة 3 أيام.
- الحفاظ على العديد من الكوببودات في جرة ولكن إزالة جميع العوالق الحيوانية الأخرى، والكريات البراز كبيرة، والجسيمات المجمعة الكبيرة التي قد تسد جهاز تصفية doliolid (شبكة المخاط). إذا كانت الثقافة تتكون من الممرضات في وقت مبكر، والحفاظ على واحد gonozooid كبيرة (≥ 6 ملم) في جرة.
ملاحظة: ليس من المهم أي الأنواع كوببود المدرجة في الثقافة، ولكن في هذه التجربة، تم استخدام الأنواع الأكثر وفرة موجودة من حيث تم التقاط doliolids.
- بعد فترة التأقلم، نقل zooids doliolid وcopepods من جرة الأصلي إلى جرة زراعة نظيفة تحتوي على 80٪ فلتر الألياف الزجاجية (GF / F) تصفية مياه البحر و 20٪ من مياه البحر من جرة الأصلي. إعداد مياه البحر المصفاة عن طريق تصفية مياه البحر من خلال GF / F مع حجم المسام الاسمية من ورقة فلتر 0.7 m.
- الحفاظ على الثقافة الجديدة من خلال تبادل 10٪ من المياه مع GF / F مياه البحر المصفاة كل 3 أيام وعن طريق إزالة المجاميع والكريات البراز. أسبوعيا، نقل الحيوانات إلى جرة جديدة كما هو موضح في الخطوة 4.2.
- تغذية doliolids عن طريق الحفاظ على تركيزات العوالق النباتية في الجرار الثقافة بين 40-95 درجة مئوية / لتر.
ملاحظة: هذه التركيزات تحاكي الظروف البيئية التي من المعروف أن تدعم ظروف ازهر لD. gegenbauri17. يختلف خليط أنواع الطحالب حسب مرحلة الحياة وعدد الحيوانات الحيوانية في كل جرة. خلال مراحل الحياة المبكرة، إضافة 1:1 خليط (حسب محتوى الكربون) من الطحالب cryptomonad(Isochrysis galbana وRhodomonas sp.) فقط. ويمكن لأنواع الفرائس الأكبر أن تسد بسهولة جهاز تغذية الممرضات الصغيرات ويطورن التروبهوزويد. إضافة دياتوم Thalassiosira weissflogii إلى خليط الطحالب، وأيضا في محتوى الكربون على قدم المساواة، عند تغذية الممرضات أكبر، phorozooids، وgonozooids.- رصد تركيزات الطحالب قبل وبعد التغذية لتوجيه قرار كم مرة وكم الطحالب لإضافة إلى الثقافات. استخدام عداد الجسيمات لتحديد تركيزات الطحالب، لأن تركيزات الطحالب في الجرار الثقافة تضعف نسبيا.
- إزالة ما يكفي من zooids للحفاظ على تركيزات الطحالب من 40 - 95 ميكروغرام / لتر بحيث يكون doliolids المتبقية لديها ما يكفي من الغذاء لزراعة.
ملاحظة: أصعب مرحلة حياة للحفاظ على بنجاح في ظل الظروف المختبرية هي اليرقات النامية وoozooid (ممرضة في وقت مبكر). خلال هذه المرحلة من الثقافة، والحفاظ على واحد gonozooid كبيرة (≥ 6 ملم) بالإضافة إلى العديد من الكوببودات في جرة مع اليرقات النامية وoozooids (~ 20 لكل جرة 3.8 لتر). - نقل ما لا يقل عن 4 ممرضات إلى جرة زراعة جديدة مرة واحدة على الأقل من 8 trophozooids مرئية على cadophore الممرضة (الشكل1B).
ملاحظة: سوف تتضاعف التروبوزويد في عدد كل 1 - 2 أيام في 20 درجة مئوية. التروبهوزويد كبيرة بما يكفي لتكون مرئية للعين المجردة.- إزالة اثنين من الممرضات مرة واحدة الممرضات تطوير 20 trophozooids.
- إزالة ممرضة واحدة عندما تتطور الممرضات > 30 trophozooids على cadophores بهم. السماح للممرضة المتبقية لتطوير phorozooids على cadophore لها.
- إزالة الممرضة بمجرد أن تطلق الممرضة ما يصل إلى 30 phorozooids.
- تقليل عدد الحيوانات في جرة مرة واحدة في phorozooids تصل إلى 3 ملم في الحجم.
- إزالة جميع phorozooids ما عدا أربعة عندما تصبح phorozooids أكبر (> 5 ملم) وقد وضعت مجموعات gonozooid.
- تقليل الثقافة إلى اثنين phorozooids عندما يزيد عدد مجموعات gonozooids في الحجم والبدء في تغذية.
- إزالة phorozooids مرة واحدة phorozooids الإفراج عن ما يصل إلى 30 gonozooids.
- تقليل عدد الغونوزويد من 30 zooids إلى 2 لكل جرة. السماح بالإفراج عن البيض المخصبة في الجرة.
- إزالة gonozooid واحد ترك gonozooid واحد في جرة بمجرد تطوير oozooids.
ملاحظة: يمكن استخدام الممرضات المهملات وphorozooids وgonozooids لزرع ثقافات إضافية وإجراء المزيد من التجارب.
- إزالة gonozooid واحد ترك gonozooid واحد في جرة بمجرد تطوير oozooids.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
بعد الإجراءات الموصوفة لجمع وزراعة doliolid، D. gegenbauri المبينة في الشكل3، فمن الممكن للحفاظ على ثقافة D. gegenbauri عبر تاريخ حياتها المعقدة (الشكل 1) و الحفاظ عليه لعدة أجيال. على الرغم من أن زراعة D. gegenbauri موصوفة هنا، فإن هذه الإجراءات ينبغي أن تكون ذات صلة أيضا لزراعة الأنواع الأخرى من الدولوليد.
يتطلب التقاط الحيوانات الحيوانية الدولويدات الصحية وغير التالفة تطبيقال...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
وقد أنشئت القدرة على تربية الدوليوليدات على مدى العقود العديدة الماضية واستخدمت لدعم البحوث في عدة مجالات. وقد دعمت الدراسات التجريبية في مختبراتنا نشر ما لا يقل عن 15 دراسة علمية تركز على التغذية والنمو18،26، الاستنساخ18،28، النظام الغذائي6، 29، علم وظائف الأعضاء30، علم البيئة31، والنمذجة الإيكولوج...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
وليس لدى أصحاب البلاغ ما يعلنونه.
شكر وتقدير
ونحن ممتنون للعديد من الأشخاص الذين ساهموا بالمعرفة المتراكمة في هذا المشروع على مر السنين بما في ذلك G.-A. Paffenhöfer وD. Deibel الذين وضعوا أصلا هذه البروتوكولات. كما ساهم السيد كوستر وإل لامبولي مساهمة كبيرة في تطوير هذه الإجراءات. ونتج عن كل من ن. ب. لوبيز - فيغيروا وأي إ. رودريغيز - سانتياغو تقديرات وفرة الدوليوليد الواردة في الجدول 1. وقد حظيت هذه الدراسة بدعم جزئي من جوائز المؤسسة الوطنية للعلوم في الولايات المتحدة OCE 082599 و1031263 إلى MEF، والمشاريع التعاونية OCE 1459293 وOCE 14595010 إلى الوزارة وشركة DMG، وجائزة الإدارة الوطنية لدراسة المحيطات والغلاف الجوي NA16SEC4810007 إلى DMG. ونحن ممتنون للطاقم الكادح والمهنية من السافانا R / V. لي آن ديليو أعدت الأرقام، تشارلز ي. روبرتسون التدقيق المخطوطة، وجيمس (جيمي) وليامز تصنيع عجلة العوالق
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| أنابيب زراعة الطحالب (55 مل أنابيب زراعة زجاجية معقمة يمكن التخلص منها) | أي | NA | لمزارع الطحالب |
| الأوتوكلاف | أي | NA | لتعقيم المعدات ومياه البحر لمزارع الطحالب |
| أكواب (زجاج 2 لتر) | أي | NA | لفرز محتويات السحب الصافية للعوالق المخففة |
| دلاء (5 جالون ، ~ 20 لتر) | أي | NA | لتخفيف محتويات السحب الصافي لسان الحمل - يجب أن تكون مكيفة بمياه البحر قبل الاستخدام الأول |
| Carboys (20 L) ؛ | أي | NA | لتخزين مياه البحر |
| زراعة زجاجية Doliolid (جرة زجاجية ضيقة الفم سعة 1.9 لتر مع غطاء) | حاوية Qorpak | GLC-01882 | للثقافة |
| جرة زراعة زجاج Doliolid (جرة زجاجية ضيقة الفم سعة 3.8 لتر مع غطاء) | حاوية Qorpak | GLC-01858 | للثقافة |
| الغرفة البيئية (غرفة بيئية يتم التحكم في درجة حرارتها) | أي | NA | لاستيعاب عجلة العوالق وصيانة الثقافة |
| جهاز ترشيح لمرشحات 47 مم | أي | NA | لتصفية مياه البحر للثقافات |
| مرشحات زجاجية من الألياف الدقيقة ، 47 مم | Whatman | 1825-047 | لتصفية مياه البحر للثقافات |
| ماصة زجاجية (ماصة زجاجية بوروسيليكات (أنابيب زجاجية) ، OD 10 مم ، معرف 8 مم ، سمك الجدار 1 مم) شركة | العلوم | NC-10894 | وحواف مخصصة |
| مشابك خرطوم مصقولة ، من الفولاذ المقاوم للصدأ ، # 104 (178 مم) | أي | NA | لحمل الجرار الاستزراعية على عجلة العوالق |
| Isochrysis galbana < / em > سلالة CCMP1323 | سلالة المركز الوطني للطحالب البحرية والميكروبات (NCMA) | CCMP1323 | لتغذية مزارع doliolid |
| L1 Media Kit ، 50 L | المركز الوطني للطحالب البحرية والميكروبات (NCMA) | MKL150L | لزراعة الطحالب |
| مصباح (مصباح طاولة فلوري بذراع قابل للتعديل) | أي | NA | لإضاءة doliolids في الجرار والأكواب |
| حاضنة مضاءة يتم التحكم في درجة حرارتها | أي | NA | لمزارع الطحالب |
| الماصات الدقيقة والنصائح المعقمة (0-20 & micro; لتر ، 20-200 ومايكرو ؛ ل, 200-1000 ومايكرو. ل) | أي | NA | لمزارع الطحالب |
| العوالق الصافية (202 وميكرو ؛ م 0.5 م ، طول 5: 1) مع حلقة نهاية سمك القد و ؛ 4 لتر حوض السمك سمك القد | نهاية Sea-Gear Corporation | 90-50x5-200-4A / BB | لجمع doliolids الحية (انظر الشكل 4) |
| العوالق | NA | NA | مصممة خصيصا (انظر الشكل 2) |
| غلاف بلاستيكي | أي | NA | لتغطية داخل غطاء برطمانات ثقافة doliolid |
| كاشف برمنجنات البوتاسيوم | فيشر Scientific | P279-500 | لتنظيف الجرار والأواني |
| الزجاجيةسلالة Rhodomonas sp. سلالة CCMP740 | سلالة المركز الوطني للطحالب البحرية والميكروبيوتا (NCMA) | CCMP740 | لتغذية مزارع doliolid |
| الأنابيب المطاطية | NA | NA | لحمل الجرار الاستزراعية على عجلة العوالق (يمكن تصنيعها من أنابيب Tygon) |
| ثنائي كبريتيت الصوديوم | فيشر Scientific | S654-500 | لتنظيف الجرار والأواني الزجاجية |
| هيدروكسيد الصوديوم | فيشر كاشف علمي | BP359-212 | لتنظيف الجرار والأواني الزجاجية |
| الماصات المصلية المعقمة (1 مل ، 5 مل ، 10 مل ، 25 مل) | أي | NA | لمزارع الطحالب |
| Thalassiosira weissflogii < / em> سلالة CCMP1051 | سلالة المركز الوطني للطحالب البحرية والميكروبات (NCMA) | CCMP1051 | لتغذية مزارع doliolid |
| قوارير زراعة الأنسجة (250 مل) أي | NA | لمزارع الطحالب |
المراجع
- Banse, K. Zooplankton – Pivotal role in the control of ocean production. Ices Journal of Marine Science. 52 (3-4), 265-277 (1995).
- Wilson, S. E., Ruhl, H. A., Smith, K. L. Zooplankton fecal pellet flux in the abyssal northeast Pacific: A 15 year time-series study. Limnology and Oceanography. 58 (3), 881-892 (2013).
- Bode, A., Álvarez-Ossorio, M. T., Miranda, A., Ruiz-Villarreal, M. Shifts between gelatinous and crustacean plankton in a coastal upwelling region. Ices Journal of Marine Science. 70 (5), 934-942 (2013).
- Kiorboe, T. Zooplankton body composition. Limnology and Oceanography. 58 (5), 1843-1850 (2013).
- Holland, L. Z. Tunicates. Current Biology. 26 (4), R146-R152 (2016).
- Walters, T. L., et al. Diet and trophic interactions of a circumglobally significant gelatinous marine zooplankter, Dolioletta gegenbauri (Uljanin, 1884). Molecular Ecology. , Special Issue: Species Interactions, Ecological Networks and Community Dynamics (2018).
- Piette, J., Lemaire, P. Thaliaceans, the neglected pelagic relatives of ascidians: a developmental and evolutionay enigma. Quarterly Review of Biology. 90 (2), 117-145 (2015).
- Acuña, J. L. Pelagic tunicates: Why gelatinous? American Naturalist. 158 (1), 100-107 (2001).
- Alldredge, A. L., Madin, L. P. Pelagic tunicates – unique herivores in the marine plankton. Bioscience. 32 (8), 655-663 (1982).
- Wada, H. Evolutionary history of free-swimming and sessile lifestyles in urochordates as deduced from 18S rDNA molecular phylogeny. Molecular Biology and Evolution. 15 (9), 1189-1194 (1998).
- Zeng, L. Y., Jacobs, M. W., Swalla, B. J. Coloniality has evolved once in stolidobranch ascidians. Integrative and Comparative Biology. 46 (3), 255-268 (2006).
- Delsuc, F., Brinkmann, H., Chourrout, D., Philippe, H. Tunicates and not cephalochordates are the closest living relatives of vertebrates. Nature. 439 (7079), 965-968 (2006).
- Garstang, W. The morphology of the Tunicata, and its bearing on the phylogeny of the chordata. Quarterly Journal of Microscopical Science. 72 (285), 51-187 (1929).
- Govindarajan, A. F., Bucklin, A., Madin, L. P. A molecular phylogeny of the Thaliacea. Journal of Plankton Research. 33 (6), 843-853 (2011).
- Godeaux, D., Bone, Q., Braconnot, J. C. The Biology of Pelagic Tunicates. Bone, Q. , Oxford University Press. 1-24 (1998).
- Deibel, D., Lowen, B. A review of the life cycles and life-history adaptations of pelagic tunicates to environmental conditions). Ices Journal of Marine Science. 69 (3), 358369(2012).
- Paffenhöfer, G., Köster, M. From one to many: on the life cycle of Dolioletta gegenbauri Uljanin (Tunicata, Thaliacea). Journal of Plankton Research. 33 (7), 1139-1145 (2011).
- Paffenhöfer, G. A., Gibson, D. M. Determination of generation time and asexual fecundity of doliolids (Tunicata, Thaliacea). Journal of Plankton Research. 21 (6), 1183-1189 (1999).
- Conley, K. R., Lombard, F., Sutherland, K. R. Mammoth grazers on the ocean's minuteness: a review of selective feeding using mucous meshes. Proceedings of the Royal Society B-Biological Sciences. 285 (1878), (2018).
- Bouquet, J. M., et al. Culture optimization for the emergent zooplanktonic model organism Oikopleura dioica. Journal of Plankton Research. 31 (4), 359370(2009).
- Denoeud, F., et al. Plasticity of Animal Genome Architecture Unmasked by Rapid Evolution of a Pelagic Tunicate. Science. 330 (6009), 1381-1385 (2010).
- Harrison, P. J., Waters, R. E., Taylor, F. J. R. A broad-spectrum artificial seawater medium for coastal and open ocean phytoplankton. Journal of Phycology. 16 (1), 2835(1980).
- Ohman, M. D., et al. Zooglider: An autonomous vehicle for optical and acoustic sensing of zooplankton. Limnology and Oceanography-Methods. 17 (1), 69-86 (2019).
- Takahashi, K., et al. In situ observations of a doliolid bloom in a warm water filament using a video plankton recorder: Bloom development, fate, and effect on biogeochemical cycles and planktonic food webs. Limnology and Oceanography. 60 (5), 1763-1780 (2015).
- Deibel, D. The biology of pelagic tunicates. Bone, Q. , Oxford University Press. 171-186 (1998).
- Gibson, D. M., Paffenhöfer, G. A. Feeding and growth rates of the doliolid, Dolioletta gegenbauri Uljanin (Tunicata, Thaliacea). Journal of Plankton Research. 22 (8), 1485-1500 (2000).
- Haskell, A., Hofmann, E., Paffenhöfer, G., Verity, P. Modeling the effects of doliolids on the plankton community structure of the southeastern US continental shelf. Journal of Plankton Research. 21 (9), 1725-1752 (1999).
- Gibson, D. M., Paffenhöffer, G. A. Asexual reproduction of the doliolid, Dolioletta gegenbauri Uljanin (Tunicata, Thaliacea). Journal of Plankton Research. 24 (7), 703-712 (2002).
- Frischer, M. E., et al. Reliability of qPCR for quantitative gut content estimation in the circumglobally abundant pelagic tunicate Dolioletta gegenbauri (Tunicata, Thaliacea). Food Webs. 1, 7(2014).
- Köster, M., Paffenhöfer, G., Baker, C., Williams, J. Oxygen consumption of doliolids (Tunicata, Thaliacea). Journal of Plankton Research. 32 (2), 171-180 (2010).
- Paffenhöfer, G. A hypothesis on the fate of blooms of doliolids (Tunicata, Thaliacea). Journal of Plankton Research. 35 (4), 919-924 (2013).
- Takahashi, K., et al. Sapphirinid copepods as predators of doliolids: Their role in doliolid mortality and sinking flux. Limnology and Oceanography. 58 (6), 1972-1984 (2013).
- Martí-Solans, J., et al. Oikopleura dioica Culturing Made Easy: A Low-Cost Facility for an Emerging Animal Model in EvoDevo. Genesis. 53 (1), 183-193 (2015).
- Nishida, H. Development of the appendicularian Oikopleura dioica: Culture, genome, and cell lineages. Development Growth & Differentiation. 50, S239-S256 (2008).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
