يركز هذا البروتوكول على تحديد البروتينات التي تربط فوسفات الإينوزيتول أو فوسفيوينوسيتيدات. ويستخدم الكروماتوغرافيا تقارب مع فوسفات الإينوزيتول biotinylated أو فوسفوينوسيتيدات التي يتم تعطيلها عن طريق streptavidin إلى أغاروز أو الخرز المغناطيسي. يتم تحديد فوسفات الإينوزيتول أو البروتينات الملزمة phosphoinositide عن طريق النشاف الغربية أو قياس الطيف الكتلي.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
تحديد فوسفات الإينوزيتول أو فوسفوينوسيتيد التفاعل البروتينات عن طريق الكروماتوغرافيا التقارب إلى جانب اللطخة الغربية أو قياس الطيف الكتلي
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
ينظم فوسفات الإينوزيتول وفوسفينيوسيتيدس العديد من العمليات الخلوية في eukaryotes، بما في ذلك التعبير الجيني، والاتجار بين الحويصلات، ونقل الإشارة، والتمثيل الغذائي، والتنمية. هذه الأيض أداء هذا النشاط التنظيمي عن طريق ربط للبروتينات، وبالتالي تغيير المطابقة البروتين، والنشاط الحفاز، و / أو التفاعلات. الطريقة الموصوفة هنا تستخدم الكروماتوغرافيا تقارب إلى جانب قياس الطيف الكتلي أو النشاف الغربية لتحديد البروتينات التي تتفاعل مع فوسفات الإينوزيتول أو فوسفيوينوسيتيدات. يتم تمييز فوسفات الإينوزيتول أو فوسفيوينوسيتيدات كيميائيا مع البيوتين، الذي يتم التقاطه بعد ذلك عن طريق streptavidin مترافقمع مع أغاروز أو الخرز المغناطيسي. يتم عزل البروتينات من خلال تقاربها من ملزمة للالمستقلب، ثم تُقطَّع وتُحدَّد عن طريق قياس الطيف الكتلي أو النشاف الغربي. هذه الطريقة لديها سير عمل بسيط حساس، غير مشع، خاليمن الدهون، وقابل للتخصيص، ودعم تحليل تفاعل البروتين والمستقلب بدقة. ويمكن استخدام هذا النهج في أساليب قياس الطيف الكتلي الكمي التي تحمل علامة الأحماض الأمينية لتحديد تفاعلات البروتين المستقلب في العينات البيولوجية المعقدة أو باستخدام البروتينات النقية. تم تحسين هذا البروتوكول لتحليل البروتينات من التريبانوسوما بروسي، ولكن يمكن تكييفه مع الطفيليات البروتوزوان ذات الصلة ، الخميرة أو خلايا الثدييات.
المقدمة
الفوسفات الإينوزيتول (IPs) وفوسفوينوسيتيدات (PIs) تلعب دورا مركزيا في علم الأحياء eukaryote من خلال تنظيم العمليات الخلوية مثل السيطرة على التعبير الجيني1،2،3، الاتجار الحويصلة 4، إشارة transduction5،6، التمثيل الغذائي7،8،9، والتنمية8،10. الوظيفة التنظيمية لهذه الأيض ينتج عن قدرتها على التفاعل مع البروتينات وبالتالي تنظيم وظيفة البروتين. عند ال....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1. تحليل البروتينات IP- أو PI ملزمة عن طريق الكروماتوغرافيا تقارب والنشاف الغربية
- نمو الخلايا والخلايا والكروماتوغرافيا المتقاربة
- تنمو خلايا T. بروسي إلى مرحلة منتصف السجل ورصد صلاحية الخلية وكثافتها. يكفي ما مجموعه 5.0 × 107 خلايا لفاكس واحد ملزم.
- لأشكال مجرى الدم، تنمو الخلايا في وسائل الإعلام HMI-9 تستكمل مع 10٪ مصل البقر الجنيني (FBS) في 37 درجة مئوية و 5٪ CO2. الحفاظ على كثافة الخلية بين 8.0 × 105 إلى 1.6 × 106 خلايا / مل.
ملاحظة: قد تؤثر الكثافة أعلى من 1.8 × 106 خلايا/مل على قدرة الخلية على البقاء. مضاعفة الوقت من T. بروسي 427 سلالة نمت في الم....
- لأشكال مجرى الدم، تنمو الخلايا في وسائل الإعلام HMI-9 تستكمل مع 10٪ مصل البقر الجنيني (FBS) في 37 درجة مئوية و 5٪ CO2. الحفاظ على كثافة الخلية بين 8.0 × 105 إلى 1.6 × 106 خلايا / مل.
- تنمو خلايا T. بروسي إلى مرحلة منتصف السجل ورصد صلاحية الخلية وكثافتها. يكفي ما مجموعه 5.0 × 107 خلايا لفاكس واحد ملزم.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
تحليل RAP1 و PI(3,4,5)P3 التفاعل بواسطة الكروماتوغرافيا التقارب ية والنشاف الغربي
يوضح هذا المثال تطبيق هذا الأسلوب لتحليل ربط PIs بواسطة RAP1 من T. بروسي lysate أو عن طريق البروتين T. brucei RAP1 المؤتلف T. brucei. Lysates من T. بروسي أشكال مجرى الدم التي تعبر عن الهيماغلوتينين (HA) الموسومة RAP1 استخدمت في الاختبارات ملزمة. RAP1 هو بروتين تشارك في السيطرة النسخية من مختلف الجينات البروتين السكري السطحي (VSG)3،48، و.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
تحديد البروتينات التي تربط إلى IPs أو PIs أمر بالغ الأهمية لفهم الوظيفة الخلوية من هذه الأيض. يوفر التصوير اللوني المتقارب المقترن باللطخة الغربية أو قياس الطيف الكتلي فرصة لتحديد البروتينات المتفاعلة بين بروتوكول الإنترنت وPI وبالتالي اكتساب رؤى حول وظيفتها التنظيمية. IPs أو PIs الموسومة كيميائيا [على سبيل المثال، Ins(1,4,5)P3 مرتبطة كيميائيا بالبيوتين] وكروسلينكد إلى حبات الأجاروس عن طريق streptavidin أو القبض عليها بواسطة الخرز المغناطيسي streptavidin يسمح العزلة من البروتينات المتفاعلة التي يمكن بعد ذلك التعرف عليها .......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
وليس لدى صاحب البلاغ ما يكشف عنه.
شكر وتقدير
وقد دعم هذا العمل مجلس بحوث العلوم الطبيعية والهندسة في كندا (NSERC, RGPIN-2019-04658)؛ NSERC اكتشاف إطلاق الملحق للباحثين الوظيفي المبكر (DGECR-2019-00081) وجامعة ماكغيل.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| الأسيتون | سيجما ألدريتش | 650501 | كيتون |
| أسيتونيتريل | سيجما ألدريتش | 271004 | المذيب |
| بيكربونات الأمونيوم | Sigma-Aldrich | A6141 | مركزي للملح غير العضوي |
| Avanti J6-MI | Beckman Coulter | Avanti J6-MI | أجهزة طرد مركزي لكميات كبيرة (على سبيل المثال ، 1 لتر) |
| زجاجات الطرد المركزي | Sigma-Aldrich | B1408 | للطرد المركزي ل 1 لتر من حبات التحكم في الثقافة |
| Echelon | P-B000-1ml | كاشف كروماتوغرافيا التقارب - التحكم | |
| D- (+) -Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | Sugar ، يضاف في PBS للحفاظ على الخلايا قابلة للحياة |
| Dithiothreitol (DTT) & nbsp ؛ | Bio-Rad | 1610610 عامل اختزال | |
| Dynabeads M-270 Streptavidin | ThermoFisher Scientific | 65305 | حبات Streptavidin للارتباط بروابط البيوتين كوكتيل |
| البروتياز | |||
| روش تعمل بالرحلان الكهربائي 1610732 | 25 ملي مولار تريس ، 192 ملي جلايسين ، 0.1٪ SDS ، درجة الحموضة 8.3 | ||
| Falcon 15 مل أنابيب الطرد المركزي المخروطية Corning | Sciences 430052 | لأجهزة الطرد المركزي 10 مل المزارع | |
| حمض الفورميك | سيجما ألدريتش | 106526 | حمض |
| الجلايسين | سيجما ألدريتش | G7126 | الأحماض الأمينية |
| HMI-9 وسط زراعة الخلايا | ThermoFisher Scientific | ME110145P1 | زراعة الخلايا ل T. brucei< / em> أشكال |
| مجرى الدمصبغة البروتين الإمبراطوري | ThermoFisher Scientific | 24615 | تلطيخ Coomassie للكشف عن البروتين في SDS / PAGE |
| Ins (1،4،5) P3 Beads | Echelon | Q-B0145-1ml | كاشف كروماتوغرافيا التقارب ؛ |
| فوري Nonfat جاف كاشف الحجب C837M64 العلمي للحليب | للنشاف الغربي | ||
| Iodoacetamide | Sigma-Aldrich | I6125 | كاشف الألكلة لبروتينات السيستين أو الببتيدات |
| مختبر الدوار | توماس العلمي | 1159Z92 | لفحوصات الربط |
| LoBind أنابيب الطرد المركزي | الدقيقة ThermoFisher Scientific | 13-698-793 | أنابيب ربط منخفضة البروتين لقياس الطيف الكتلي |
| Nonidet & nbsp ؛ P-40 (Igepal CA-630) | Sigma-Aldrich | 21-3277 | منظف |
| PBS ، درجة الحموضة 7.4 | ThermoFisher Scientific | 10010031 | العازلة الفسيولوجية |
| الركيزة بيروكسيداز للتلألؤ الكيميائي | ThermoFisher Scientific | 32106 | الركيزة للكشف عن الانتفاخ الغربي للبروتينات |
| أقراص كوكتيل مثبط الفوسفاتيز | PhosSTOP Roche | 4906845001 | Phosphatase مثبطات |
| PI (3) P PIP Beads | Echelon | P-B003a-1ml | كاشف كروماتوغرافيا التقارب ؛ |
| PI (3،4) P2 PIP الخرز | Echelon | P-B034a-1ml | كاشف كروماتوغرافيا التقارب ؛ |
| PI (3،4،5) P3 diC8 | Echelon | P-3908-1mg | كاشف كروماتوغرافيا التقارب ؛ |
| PI (3،4،5) P3 PIP الخرز | Echelon | P-B345A-1ml | كاشف كروماتوغرافيا التقارب ؛ |
| PI (3،5) P2 PIP الخرز | Echelon | P-B035a-1ml | كاشف كروماتوغرافيا التقارب ؛ |
| PI (4) P PIP الخرز | Echelon | P-B004a-1ml | كاشف كروماتوغرافيا التقارب ؛ |
| PI (4،5) P2 diC8 | Echelon | P-4508-1mg | كاشف كروماتوغرافيا التقارب ؛ |
| PI (4،5) P2 PIP الخرز | Echelon | P-B045A-1ml | كاشف كروماتوغرافيا التقارب ؛ |
| PI (5) P PIP الخرز | Echelon | P-B005a-1ml | كاشف كروماتوغرافيا التقارب ؛ |
| محلول Ponceau S | Sigma-Aldrich | P7170 | تلطيخ البروتين (0.1٪ [وزن / حجم] في 5٪ حمض الخليك) |
| سداسي سيانوفيرات البوتاسيوم (III) | سيجما ألدريتش | 702587 | ملح البوتاسيوم |
| PtdIns PIP الخرز | Echelon | P-B001-1ml | كاشف كروماتوغرافيا التقارب ؛ |
| PVDF غشاء | Bio-Rad | 1620177 | للنشاف الغربي |
| أجهزة الطرد المركزي المبردة | Eppendorf | 5910 R | Microcentrifuge للأحجام الصغيرة (على سبيل المثال ، 1.5 مل) |
| كبريتات دوديسيل الصوديوم | Sigma-Aldrich | 862010 | منظف |
| ثيوسلفات الصوديوم | Sigma-Aldrich | 72049 | Chemical ؛ |
| مكثفات الفراغ | SpeedVac ThermoFisher Scientific | SPD120-115 | تركيز العينة (على سبيل المثال ، لقياس الطيف الكتلي) |
| قوارير T175 لزراعة الخلايا ؛ | ThermoFisher Scientific | 159910 | لزراعة 50 مل T. brucei< / em> ثقافة |
| التربسين ، قياس الطيف الكتلي الصف | Promega | V5280 | التربسين لهضم البروتين |
| اليوريا | سيجما-ألدريتش | U5128 | كاشف تغيير طبيعة |
| دوامة | فيشر العلمي | 02-215-418 | لخلط التفاعلات |
| النشاف الغربي نقل المخزن المؤقت | Bio-Rad | 1610734 | 25 ملي تريس ، 192 ملي جلايسين ، درجة الحموضة 8.3 مع 20٪ ميثانول |
| واتمان & nbsp ؛ ورق 3 مم | Sigma-Aldrich | WHA3030861 | ورق لنقل Wester |
| 2-mercaptoethanol (14.2 M) | اختزال | Bio-Rad | |
| 1610710 2x Laemmli Sample Buffer | Bio-Rad | 161-0737 | عازلة تحميل البروتين |
| 4 & ndash ؛ 20٪ ميني بروتين TGX جل البروتين مسبقة الصب | Bio-Rad | 4561094 | للرحلان الكهربائي للبروتين |
| 4x Laemmli Sample Buffer | Bio-Rad | 161-0747 | عازلة تحميل البروتين |
المراجع
- Cestari, I., Stuart, K. Inositol phosphate pathway controls transcription of telomeric expression sites in trypanosomes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (21), 2803-2812 (2015).
- Odom, A. R., Stahlberg, A., Wente, S. R., York, J. D.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
