مقالة منهجية

تحليل مشية منخفضة التكلفة للنمط الفينومابي لنماذج الماوس من الأمراض العصبية العضلية

DOI:

10.3791/59878

⸱

يوليو 18, 2019

 ,  ,  , 
1Department of Neurology, Duke University School of Medicine, 2Duke Center for Neurodegeneration & Neurotherapeutics, Duke University School of Medicine, 3Biomedical Sciences Graduate Program, University of California San Diego, 4Department of Neurobiology, Duke University School of Medicine, 5Department of Cell Biology, Duke University School of Medicine

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تحليل البصمة هو بديل منخفض التكلفة لبرامج تحليل المشية الرقمية للباحثين تحديد حجم تشوهات الحركة في الفئران. بسبب سرعتها، والبساطة، والإمكانات الطولية، وهو مثالي للنماذج الفينومية السلوكية لنماذج الماوس.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

قياس الحركة الحيوانية هو أداة سلوكية شائعة تستخدم لوصف النمط الظاهري لمرض معين، أو إصابة، أو نموذج المخدرات. طريقة منخفضة التكلفة لتحليل مشية أظهرت هنا هو مقياس بسيط ولكن فعال من تشوهات مشية في نماذج murine. يتم تحليل آثار الأقدام عن طريق طلاء أقدام الماوس بطلاء غير سام قابل للغسل والسماح للموضوع بالسير عبر نفق على ورقة. تصميم نفق الاختبار يستفيد من سلوك الماوس الطبيعي وتقاربها للأماكن المظلمة الصغيرة. يتم قياس طول الخطوة، وعرض خطوة، وانتشار اصبع القدم من كل ماوس بسهولة باستخدام مسطرة وقلم رصاص. هذا هو أسلوب راسخة وموثوق بها، وأنها تولد العديد من المقاييس التي هي مماثلة للنظم الرقمية. هذا النهج حساس بما فيه الكفاية للكشف عن التغيرات في خطوة في وقت مبكر من العرض العرضي النمط الظاهري، ونظرا لنهجها غير الغازية، فإنه يسمح لاختبار المجموعات عبر مدى الحياة أو العرض العرضي الفينوتي.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تتطلب الحركة التنسيق العصبي والعضلي الهيكلي المعقد، ويمكن أن يؤدي العجز في جانب واحد من مسارات المحرك إلى تشوهات مشية يمكن ملاحظتها1،2. تحليل مشية هو أداة حاسمة للباحثين اختبار نماذج الماوس لأنه يوفر بيانات سلوكية قابلة للقياس الكمي حول كيفية تأثير مرض معين، أو إصابة، أو المخدرات على حركة الحيوان3. ومع ذلك، يتطلب تحليل المشية الرقمية شراء جهاز المشي، والكاميرا، والبرامج المرتبطة بها، والتي يمكن أن تكون باهظة التكلفة للباحثين. وغالبا ما يستخدم تحليل مشية بشكل متقطع لتتبع التغيرات الطولية في وظيفة المحرك، وبالتالي قد يكون من الصعب تبرير النفقات إذا استخدمت بشكل متقطع4. على الرغم من أن التحليلات الرقمية قد توفر مقاييس مشية أكثر تفصيلاً من تحليل البصمة البسيط، فإن هذه التدابير الأكثر تعقيداً ليست دائماً ضرورية أو ذات صلة بتوصيف النمط الظاهري السلوكي5.

هنا نقدم طريقة تحليل بصمة يدوية منخفضة التكلفة كبديل سريع وحساس لبرامج تحليل مشية رقمية6و7. وقد ثبت تحليل البصمة اليدوية للكشف عن اختلافات كبيرة مشية في العديد من نماذج مرض المورين4،7،8،9،10،11 ،12،13،14،15،16،17، وفي حالة واحدة على الأقل ، حددت هذه الطريقة منخفضة التكلفة التغييرات في مشية أن لم يتم الكشف عنها من قبل برنامج تحليل مشية رقمية مشتركة12. التكلفة الإجمالية للمواد اسمية، ويمكن تكييفها بسهولة مع نماذج أبحاث القوارض الأخرى.

في حين أن هناك العديد من مقاييس المشي المختلفة التي يمكن استخلاص البيانات منها، فإن الطريقة التي نصفها تركز على ثلاثة مقاييس محددة: طول الخطوة، وعرض الخطوة (المعروف أيضًا باسم "عرض المسار")، وانتشار اصبع القدم. ومن المهم ملاحظة أن البارامترات التي يتعين تقييمها ينبغي أن تحدد على أساس كل نموذج على حدة. لم يتم تصميم هذه الطريقة لتحليل مشية لقياس الوظيفة المعرفية ، ولا ينصح للدراسات التي تتطلب قياسات حيوية ميكانيكية معقدة من مشية16.

نقدم بيانات سلوكية من مجموعة من الفئران قبل وبعد الأعراض النمذجة X-المرتبطة ضمور العضلات العمود الفقري وبولبار (SBMA)، وهو مرض عصبي عضلي يتميز بانحطاط الخلايا العصبية الحركية وضمور العضلات. هذه الفئران تطوير العجز التدريجي في مشية التي تتزامن مع ظهور الأنماط الظاهرية الأخرى الخاصة بالأمراض. وهذا يدل على صحة وخصوصية هذه الطريقة، ويؤكد أنه يمكن أن يميز بشكل موثوق بين الحيوانات المتأثرة وغير المتأثرة.

كانت الفئران التجريبية في هذه الدراسة 2.5 (قبل الأعراض) و 9 أشهر من العمر (بعد أعراض) BAC fxAR121 الفئران المعدلة وراثيا على خلفية C57BL/6 (نexpt= 12). تم إنشاء هذا النموذج في مختبرنا، وقد وصفت تماما كنموذج الماوس قوية من SBMA9. واستُخدمت القمامة غير المحورة وراثياً كضوابط (nctrl=8). SBMA هو مرض محدود الجنس الذي يتجلى تماما في الذكور فقط، لذلك تم استخدام الفئران الذكور حصرا لهذه الدراسة. خلال مراحل التخطيط، يجب على الباحثين أن يأخذوا في الاعتبار اعتبارات المعاهد الوطنية للصحة حول الجنس كمتغير بيولوجي لتحديد أحجام المجموعات وتكوينها18.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم استعراض جميع الاختبارات التي أجريت مع الفئران والموافقة عليها من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها (IACUC) من جامعة ديوك. ويجب أن يكون الموظفون المسؤولون عن الاختبار والتهديف أعمى عن النمط الجيني الحيواني أو الحالة التجريبية إلى أن يتم الانتهاء من تحليل المشية وتسجيل الأوراق للمجموعة بأكملها.

1. اختبار إعداد المواد

  1. إجراء اختبار مع نفق بنيت من 3 قبل قطع لوحات الاكريليك واضحة التي هي 0.375 بوصة سميكة. تجميع النفق عن طريق لصق لوحات جنبا إلى جنب مع مانع التسرب التي تربط على وجه التحديد الاكريليك ولن تنبعث الروائح عند تجفيفها.
    1. بالنسبة للفئران القياسية C57BL/6، استخدم قياسات النفق التالية: 2.5 في. يجب أن تكون الفئران قادرة على المشي بشكل مريح من خلال النفق واتخاذ ما يكفي من الخطوات (>4) بحيث يمكن قياس مشية.
  2. بناء غرفة الهدف مع لوحات الاكريليك الرمادي قبل قطع 0.375 بوصة سميكة، لصقها جنبا إلى جنب مع نفس مانع التسرب كما تستخدم في النفق. القياسات الداخلية للغرفة هي 4 بوصة واسعة، 4 بوصة طويلة، و3 بوصة. تطابق افتتاح هذه الغرفة لفتح النفق (2.5 في. واسعة × 3.0 في. طويل القامة). لأن الفئران تفضل بطبيعة الحال المساحات المظلمة إلى المساحات مضاءة جيدا، واستخدام المواد التي هي مبهمة ومظلمة في اللون.
  3. استخدم الورق لتتبع الخطوات السميكة والسلسة (يعمل ورق الألوان المائية بشكل جيد). قطع شرائط أوراق الفردية لتكون أوسع قليلا وأطول من عرض وطول النفق. إذا كان استخدام أبعاد النفق الموضحة هنا، وقطع الأوراق إلى 15 في.
  4. استخدم لونين متناقضين (على سبيل المثال، الأخضر والأرجواني) من الطلاء غير السام القائم على المياه القابل للغسل. تعيين لون واحد للأطراف الخلفية، والثاني للأطراف الأمامية. الفئران سوف لعق الطلاء المتبقية من أقدامهم بعد الاختبار، لذلك يجب أن يكون الطلاء المحدد غير سامة تماما.
  5. استخدام اثنين من فرش الطلاء برميل جولة، واحد لكل لون الطلاء (~ 0.5 سم في القطر، مدبب / وأشار تلميح فرشاة).
  6. حدد مسطرة مع علامات وصولا إلى ملليمتر، والفرجار مع قياسات وصولا الى 0.1 ملم.
  7. اختياري: للالحيوانات مع القلق العالي أو الدافع المنخفض، وتوفير حافز سلوكي في غرفة الهدف. وهذا يمكن أن تشمل كميات صغيرة من بذور عباد الشمس المعقمة (وضعت في القفص المنزلي 2 أيام قبل الاختبار للسماح بالسكن). في يوم الاختبار، ضع بذور عباد الشمس داخل غرفة الهدف لتشجيع الفئران على المشي من خلال دون توقف.

2 - جمع البيانات

  1. إذا تم إجراء الاختبار في غرفة منفصلة، تكييف الفئران إلى الغرفة الجديدة لمدة 30 دقيقة ثم بدء الاختبارات السلوكية. بالإضافة إلى ذلك، لأن الفئران هي ليلية بشكل طبيعي، تأكد من أن جميع الفئران مستيقظة تماما ويقظة لمدة 5 دقائق على الأقل قبل الاختبار.
  2. قم بإعداد إعداد الاختبار عن طريق وضع النفق فوق الورق ووضع علامة على الورق باستخدام معرف الماوس وتاريخ الاختبار. ضع غرفة الهدف في نهاية النفق، وربط كلا الطرفين المفتوحين. إضافة بذور عباد الشمس في نهاية النفق (داخل غرفة الهدف) للتحفيز إذا لزم الأمر.
  3. إزالة الماوس ليتم اختبارها من قفصها وقبضة عليه بحزم من قبل scruff لها، والتأكد من السيطرة على الذيل لتحقيق الاستقرار في حركة أطرافه الخلفية.
  4. الطلاء forepaws حتى الجانب السفلي بأكمله من جميع أصابع القدم ومركز القدم مغطاة بالكامل في الطلاء. كرر هذا مع لون المتناقضة من الطلاء على الكفوف الخلفية. مسح أي طلاء أن الماوس يحصل على أجزاء أخرى من الجسم مع قطعة قماش رطبة نظيفة لمنع اللطخات التي قد تتداخل مع جمع البيانات.
    ملاحظة: يجب إجراء معالجة الماوس من قبل الباحثين ذوي الخبرة لتقليل الإجهاد الحيواني.
  5. وضع الماوس في بداية النفق والسماح لها بالمشي على طول الطريق إلى غرفة الهدف، ومن ثم استرداد الماوس، ومسح بلطف قبالة قدميه بقطعة قماش مبللة بالماء، وإعادته إلى قفص منزله.
  6. السماح للورق مع آثار أقدام لتجف تماما قبل تسجيل. مسح أسفل منطقة الاختبار والنفق مع الإيثانول أو ما يعادلها حل التنظيف بين كل الحيوان.

3- معايير التهديف

  1. استخدم الخطوات التي يتم متباعدة باستمرار مع آثار أقدام واضحة وغير ملطخة لتسجيل النقاط. الشكل 1B هو مثال جيد على تسلسل البصمة التي يمكن تسجيلها. من أجل توليد بيانات تسجيل كافية، يجب أن يكون هناك ما لا يقل عن خطوتين متتاليتين من كل قدم، ولكن ينصح 4-6 خطوات لكل قدم. لا تقم بتضمين البصمة الأولى والأخيرة على الورق، حيث أنه من غير المرجح أن تمثل مشية عادية لأن الماوس يغير سرعة المشي.
  2. استخدام طول خطوة، عرض خطوة، وانتشار اصبع القدم كثلاثة مقاييس مختلفة من مشية التي يمكن تحليلها باستخدام هذا الأسلوب.
    ملاحظة: طول الخطوة والعرض تتطلب مطبوعات تسلسلية واضحة حيث يتم تعريف منطقة القدم الأمامية بشكل جيد في الطلاء. لا يتطلب انتشار أصابع القدم مطبوعات متسلسلة لتسجيل النقاط، فقط مطبوعات واضحة من أصابع القدم الأولى والأخيرة على قدم واحدة. ومع ذلك، إذا لم يتم تضمين بصمة معينة في قياسات طول أو عرض خطوة، فإنه لا يمكن تسجيل لانتشار اصبع القدم. يتم تقييم جميع التدابير الثلاثة بالسنتيمترات.
    1. تعريف طول الخطوة على أنه المسافة بين اثنين من آثار أقدام متتابعة التي تم إنشاؤها من قبل نفس القدم (أي خطوة واحدة) (الشكل1A، 1B).
      1. باستخدام قلم رصاص، ارسم دائرة من 2-4 مم حول منطقة القدم الأمامية لكل من آثار أقدام الأطراف الأمامية (المحددة بالألوان المخصصة أعلاه) في خطوة واحدة ورسم خط بينهما باستخدام مسطرة.
      2. سجل المسافة بين طبعتين من منتصف كل دائرة (أي مركز كل وسادة قدم) كـ Right-Fore 1 (RF1) أو Left-Fore 1 (LF1).
      3. كرر لكافة الخطوات التي يمكن تسجيلها (RF2، LF2، RF3، LF3 وهلم جرا).
      4. كرر لأقدام الأطراف الخلفية اليمنى واليسرى.
      5. متوسط جميع المسافات الفردية سجلت خطوة لكل طرف. للتحليل الإحصائي، يمكن أن يكون متوسط أعضاء المجموعة الفردية معا.
    2. تعريف عرض الخطوة على أنه مقياس المسافة بين الأطراف الأمامية اليسرى واليسرى أو الأطراف الخلفية (الشكل1A، 1B).
      1. لتقييم هذه المسافة، رسم وقياس خط من منطقة القدم الأمامية الدائرة من طرف خلفي واحد يتقاطع عموديا مع خط لطول خطوة على الطرف الخلفي المقابل.
      2. كرر هذا لجميع مطبوعات الأطراف الخلفية التي يمكن تسجيلها، ومن ثم متوسط القياسات. طريقة حساب لعرض خطوة هو نفسه للصدارة والأطراف الخلفية.
    3. تعريف انتشار أصابع القدم على أنه المسافة بين أصابع القدم الأولى والأخيرة على بصمة واحدة من طرف الصدارة أو الطرف الخلفي (الشكل1A، 1B).
      1. استخدم الفرجار لقياس المسافة بين طرف طباعة اصبع القدم الأول وطرف طباعة اصبع القدم الأخيرة.
      2. كرر لجميع مطبوعات الأطراف الخلفية التي يمكن تسجيلها ومتوسط القياسات. طريقة حساب انتشار اصبع القدم هي نفسها بالنسبة للأطراف الأمامية والخلفية.
  3. إذا كان لا يمكن تسجيل ورقة، والسماح للالحيوان للراحة لمدة 10 دقائق قبل محاولة مرة أخرى.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

مع أعداد كافية من الحيوانات، وهذا الإجراء قادر على الكشف عن الاختلافات مشية بين الأنماط الجينية الماوس، في نفس الضغط مع مرور الوقت. يظهر الشكل 1B آثار ًا تمثيلية لصور البصمة التي تم جمعها في مختبرنا، وذلك باستخدام نموذج ماوس من ضمور العضلات المرتبط بـ X العمود الفقري وBulbar (SBMA)، وهو اضطراب عصبي يؤثر على الخلايا العصبية الحركية المنخفضة والعضلات الهيكلية. لقد أبلغنا سابقا أن الذكور BAC fxAR121 الفئران المعدلة وراثيا تطوير فقدان الوزن كبيرة، والإعاقة في قوة قبضة،وتق...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

باستخدام طريقة تحليل مشية منخفضة التكلفة الموضحة أعلاه، نعرض التعرف الناجح على العديد من المعلمات من خلل المشية في العصور ما بعد الأعراض في نموذج الماوس BAC fxAR121 من SBMA. انخفاض في طول خطوة تتفق مع الدراسات السابقة SBMA من نماذج الماوس والمرضى الإنسان9. كما نبين لأول مرة أن هناك اختلافات كبيرة في انتشار اصبع القدم الخلفي في الفئران SBMA أعراض بالمقارنة مع الضوابط القمامة غير المعدلة وراثيا. ومن المثير للاهتمام، يمكن أن يكون سبب انخفاض في انتشار اصبع القدم الخلفي من ضعف في العضلات مخلب الموسعة، ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويود أصحاب البلاغ أن يشكروا أ. م. على المساعدة في تحديد هوية الحيوانات. وقد تم دعم هذا العمل بمنح من المعاهد الوطنية للصحة في الولايات المتحدة (R01 7 RF1 AG057264 إلى A.R.L.S. و C.J.C. و R01 NS100023 إلى A.R.L.S) وجمعية ضمور العضلات (منحة البحوث الأساسية لA.R.L.S.، منحة التنمية إلى C.J.C.).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
أن يكون للفرجارn / an / aعلامات تصل إلى 0.1 مم
Craft GlueE6000n / a
طلاء البصمة (Tempera Paint)يجب أن يكونArtmindn / a
فرش الرسم المستديرة BarrelSymply Simmonsn / a0.5 سم
المسطرةn / an / a يجبيكون لها علامات تصل إلى ملليمترات
ورق تسجيل (وسادات ألوان مائية)كانسونبدونقطع حسب الحجم
النفق وغرفة المرمىبلاستيك بين الولاياتبدونقطع حسب الحجم
يجب غير سامقطر أن

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Clarke, K. A., Still, J. Development and consistency of gait in the mouse. Physiology & Behavior. 73 (1-2), 159-164 (2001).
  2. Mendes, C. S., et al. Quantification of gait parameters in freely walking rodents. BMC Biology. 13, 50(2015).
  3. Carter, R. J., Morton, J., Dunnett, S. B. Motor coordination and balance in rodents. Current Protocols in Neuroscience. , Chapter 8 Unit 8 (2001).
  4. Tillerson, J. L., Caudle, W. M., Reveron, M. E., Miller, G. W. Exercise induces behavioral recovery and attenuates neurochemical deficits in rodent models of Parkinson's disease. Neuroscience. 119 (3), 899-911 (2003).
  5. Pallier, P. N., Drew, C. J., Morton, A. J. The detection and measurement of locomotor deficits in a transgenic mouse model of Huntington's disease are task- and protocol-dependent: influence of non-motor factors on locomotor function. Brain Research Bulletin. 78 (6), 347-355 (2009).
  6. Sugimoto, H., Kawakami, K. Low-cost Protocol of Footprint Analysis and Hanging Box Test for Mice Applied the Chronic Restraint Stress. Journal of Visualized Experiments. (143), (2019).
  7. Carter, R. J., et al. Characterization of progressive motor deficits in mice transgenic for the human Huntington's disease mutation. Journal of Neuroscience. 19 (8), 3248-3257 (1999).
  8. Barlow, C., et al. Atm-deficient mice: a paradigm of ataxia telangiectasia. Cell. 86 (1), 159-171 (1996).
  9. Cortes, C. J., et al. Muscle expression of mutant androgen receptor accounts for systemic and motor neuron disease phenotypes in spinal and bulbar muscular atrophy. Neuron. 82 (2), 295-307 (2014).
  10. D'Hooge, R., et al. Neuromotor alterations and cerebellar deficits in aged arylsulfatase A-deficient transgenic mice. Neuroscience Letters. 273 (2), 93-96 (1999).
  11. Fernagut, P. O., Diguet, E., Labattu, B., Tison, F. A simple method to measure stride length as an index of nigrostriatal dysfunction in mice. Journal of Neuroscience Methods. 113 (2), 123-130 (2002).
  12. Guillot, T. S., Asress, S. A., Richardson, J. R., Glass, J. D., Miller, G. W. Treadmill gait analysis does not detect motor deficits in animal models of Parkinson's disease or amyotrophic lateral sclerosis. Journal of Motor Behavior. 40 (6), 568-577 (2008).
  13. Harper, S. Q., et al. RNA interference improves motor and neuropathological abnormalities in a Huntington's disease mouse model. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (16), 5820-5825 (2005).
  14. Lin, C. H., et al. Neurological abnormalities in a knock-in mouse model of Huntington's disease. Human Molecular Genetics. 10 (2), 137-144 (2001).
  15. Sopher, B. L., et al. Androgen receptor YAC transgenic mice recapitulate SBMA motor neuronopathy and implicate VEGF164 in the motor neuron degeneration. Neuron. 41 (5), 687-699 (2004).
  16. Tillerson, J. L., Caudle, W. M., Reveron, M. E., Miller, G. W. Detection of behavioral impairments correlated to neurochemical deficits in mice treated with moderate doses of 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine. Experimental Neurology. 178 (1), 80-90 (2002).
  17. Wheeler, V. C., et al. Early phenotypes that presage late-onset neurodegenerative disease allow testing of modifiers in Hdh CAG knock-in mice. Human Molecular Genetics. 11 (6), 633-640 (2002).
  18. Clayton, J. A., Collins, F. S. Policy: NIH to balance sex in cell and animal studies. Nature. 509 (7500), 282-283 (2014).
  19. Maricelli, J. W., Lu, Q. L., Lin, D. C., Rodgers, B. D. Trendelenburg-Like Gait, Instability and Altered Step Patterns in a Mouse Model for Limb Girdle Muscular Dystrophy 2i. PLoS One. 11 (9), e0161984(2016).
  20. Castelhano-Carlos, M. J., Sousa, N., Ohl, F., Baumans, V. Identification methods in newborn C57BL/6 mice: a developmental and behavioural evaluation. Lab Animals. 44 (2), 88-103 (2010).
  21. Lakes, E. H., Allen, K. D. Gait analysis methods for rodent models of arthritic disorders: reviews and recommendations. Osteoarthritis Cartilage. 24 (11), 1837-1849 (2016).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة