مقالة منهجية

تقييم الضرر التأكسدي في الخلايا السطحية الرئيسية للفأرة /الخلايا الجذعية استجابة للأضرار فوق البنفسجية-C (UV-C)

DOI:

10.3791/59924

⸱

فبراير 15, 2020

 ,  ,  ,  ,  , 
1Stem Cells and Regenerative Medicine Centre, Yenepoya Research Centre, Yenepoya (Deemed to be University), Mangaluru-575018, Karnataka, India

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يوضح هذا البروتوكول الكشف المتزامن لأنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) والخلايا الحية والخلايا الميتة في الثقافات الأولية الحية من خلايا سطح العين الماوس. 2', 7'-Dichloroforesindiacetate, يتم استخدام يوديد البروبيديوم, وتلطيخ Hoechst لتقييم ROS, الخلايا الميتة, والخلايا الحية, على التوالي, تليها التصوير والتحليل.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتعرض سطح العين للبلى العادية بسبب عوامل بيئية مختلفة. ويشكل التعرض للأشعة فوق البنفسجية - C خطرا على الصحة المهنية. هنا، نُظهر تعرض الخلايا الجذعية الأولية من سطح العين للفأر ة إلى الأشعة فوق البنفسجية-C. أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) تشكيل هو قراءة مدى الإجهاد التأكسدي / الضرر. في الإعداد التجريبي في المختبر ، من الضروري أيضًا تقييم النسبة المئوية للخلايا الميتة الناتجة عن الإجهاد التأكسدي. في هذه المقالة، سوف نبرهن على 2',7'-Dichloroforesindiacetate (DCFDA) تلطيخ الأشعة فوق البنفسجية-C يتعرض الخلايا الجذعية الرئيسية سطح العين الماوس وقياسها على أساس الصور الفلورية من تلطيخ DCFDA. DCFDA تلطيخ يتوافق مباشرة مع جيل ROS. كما نبرهن على القياس الكمي للخلايا الميتة والحية عن طريق تلطيخ متزامن مع يوديد البروبيديوم (PI) وهويشت 3332 على التوالي والنسبة المئوية لخلايا DCFDA (ROS إيجابية) وPI الإيجابية.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

سطح العين (OS) هو وحدة وظيفية تتكون أساسا من الطبقة الخارجية والظهارة الغدية للقرنية، الغدة lachrymal، الغدة meibomian، الملتحمة، جزء من هوامش غطاء العين والداخلية التي تشير عبر الترانسدوس1. تركز طبقة القرنية الشفافة على شكل قبة الضوء على شبكية العين. يتكون هذا النسيج اللاوعي من مكونات خلوية مثل الخلايا الظهارية والخلايا القرنية والخلايا الانائية والمكونات الخلوية مثل الكولاجين وجليكوزامينوجليكان2. يتم استنزاف المنطقة من الدموع التي توفر أيضا معظم المواد الغذائية. الموقع التشريحي لنظام التشغيل يجبرها على أن تكون على اتصال مباشر مع البيئة الخارجية، وغالبا ما يعرضها لمختلف المكونات القاسية مثل الضوء الساطع والميكروبات وجزيئات الغبار والمواد الكيميائية. هذا العامل يهيئ نظام التشغيل للإصابات الجسدية ويجعلها عرضة لمختلف الأمراض.

يحدث الإجهاد التأكسدي بسبب اختلال التوازن بين إنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) وآليات الدفاعات المضادة للأكسدة الذاتية3. يتم تصنيف ROS إلى جزيئات تفاعلية وجذور حرة ، وكلاهما مشتق من الأكسجين الجزيئي (O2)من خلال فوسفوريل الأكسدة الميتوكوندريا4. تتكون المجموعة السابقة من أنواع غير جذرية مثل بيروكسيد الهيدروجين (H2O2)، الأكسجين المنفرد(1O2)، ويشمل هذا الأخير أنواعًا مثل أنيونات أكسيد فائق (O2-) ، وجذور الهيدروكسيل(•OH) ، من بين أمور أخرى. هذه الجزيئات هي المنتجات الثانوية للعمليات الخلوية العادية وأدوارها قد تورطت في وظائف فسيولوجية هامة مثل نقل الإشارة ، والتعبير الجيني ، والدفاع المضيف5. ومن المعروف أن إنتاج معزز من ROS يتم إنشاؤه استجابة لعوامل مثل غزو مسببات الأمراض ، xenobiotics ، والتعرض للأشعة فوق البنفسجية (UV)4. هذا الإفراط في إنتاج ROS يؤدي إلى الإجهاد التأكسدي الذي يؤدي إلى تلف الجزيئات مثل الأحماض النووية والبروتينات والدهون6.

تتكون أشعة الشمس الطبيعية، المصدر الأكثر انتشارًا للأشعة فوق البنفسجية، من الأشعة فوق البنفسجية (400-320 نانومتر)، والأشعة فوق البنفسجية-B (320-290 نانومتر)، والأشعة فوق البنفسجية-C (290-200 نانومتر)7. وقد أبلغ عن وجود ارتباط عكسي بين الطول الموجي والطاقات الطيفية. وعلى الرغم من أن الغلاف الجوي يمتص الأشعة فوق البنفسجية - C الطبيعية، فإن المصادر الاصطناعية مثل مصابيح الزئبق وأدوات اللحام تنبعث منها، وبالتالي تشكل خطراً مهنياً. أعراض التعرض للعيون تشمل التهاب الكرات الضوئية والتهاب الكظر الملتحمة8. إنتاج ROS هي واحدة من الآليات الرئيسية لإلحاق الأشعة فوق البنفسجية الناجمة عن الضرر الخلوي9. في الدراسة الحالية، ونحن نبرهن على الكشف عن روس باستخدام 2',7'-ديكلوروديهيدروفلورسين diacetate (DCFDA) طريقة تلطيخ في خلايا سطح العين الأولية الماوس / الخلايا الجذعية المعرضة للأشعة فوق البنفسجية-C. تم التقاط الفلورية الخضراء باستخدام المجهر الفلوري. وكانت الخلايا ملطخة بصبغتين، هما Hoechst 33342 ويوديد البروبيديوم الأحمر، لتلطيخ الخلايا الحية والميتة، على التوالي.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أجريت التجربة على خلايا العين الأولية / الخلايا الجذعية المستمدة من عين الفأر ة المهق السويسرية. تمت الموافقة على استخدام الحيوانات لحصاد العيون لهذه التجربة من قبل اللجنة الأخلاقية الحيوانية المؤسسية، ينبويا (تعتبر جامعة) (رقم موافقة IEAC، 6a/19.10.2016).

1. الاستعدادات من الكواشف

ملاحظة: اشتقاق الخلايا الأولية/الخلايا الجذعية من سطح العين الماوس خارج نطاق هذا البروتوكول. وبالتالي، فإننا نظهر جرعات التعرض للأشعة فوق البنفسجية-C، وإعداد الكاشف لتقييم ROS والخلايا الحية والميتة وقياسها الكمي. يرجى الرجوع إلى الجدول 1 للاطلاع على المجلدات ذات الصلة من الكواشف (10٪ مصل الأبقار الجنينية، DCFDA، Hoechst وحلول مخزون يوديد البروبيديوم لإضافتها للحصول على محلول تلطيخ النهائي).

  1. إعداد حل الأسهم من 10 m DCFDA عن طريق إذابة 25 ملغ من مسحوق DCFDA في 5.13 مل من DMSO. Aliquot 250 μL كل في العنبر الملونة 1.5 أنابيب مل وتخزينها في -20 درجة مئوية.
  2. إعداد محلول مخزون من 10 ملغ / مل (16.23 م م الحل) Hoechst 33342 عن طريق حل محتويات كامل قارورة 25 ملغ في 2.5 مل من الماء المغوني. جعل aliquots من 100 ميكرولتر في أنابيب الطرد المركزي الملونة العنبر وتخزينها في 2-6 درجة مئوية لمدة تصل إلى 6 أشهر. للتخزين على المدى الطويل، قم بتخزينه عند -20 درجة مئوية.
  3. إعداد محلول مخزون من 1 ملغ / مل يوديد البروبيديوم في الماء المؤين، aliquot 1 مل لكل من الأنابيب الملونة 1.5 مل العنبر، وتخزينها في 4 درجة مئوية.

2. طلاء الخلايا والعلاج بالأشعة فوق البنفسجية-C

  1. قبل الطلاء ، فصل خلايا سطح العين الأولية الماوس معزولة في مختبرنا (النتائج غير المنشورة ؛ هذه الخلايا هي مزيج من الظهارة القرنية والخلايا المترفية والخلايا القرنية) باستخدام عامل انفصال الخلية لطيف(جدول المواد).
  2. لوحة 0.2 × 106 خلايا سطح العين الماوس الابتدائية في 35 ملم 0.2٪ غشاء الطابق السفلي مصفوفة المغلفة أطباق ثقافة الخلايا في 2.5 مل من وسائل الإعلام كاملة. احتضان بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية في 5٪CO2 وحاضنة رطبة.
    ملاحظة: تتكون الوسائط الكاملة لاستزراع الخلايا الأولية من سطح العين الماوس من الجلوكوز العالي DMEM الذي يحتوي على 20٪ FBS، 1٪ Pen-العقدية، 1٪ Glutamax، 1٪ من الأحماض الأمينية غير الأساسية (NEAA)، 1٪ بيروفات الصوديوم، و 0.1٪ α-mercaptoethanol.
  3. قبل تعريض الخلايا لجرعات مختلفة من الأشعة فوق البنفسجية C، تجاهل الحجم الأقصى من وسائل الإعلام والسماح فقط طبقة رقيقة من وسائل الإعلام (~ 500 ميكرولتر) للبقاء على اتصال مع الخلايا، فقط ما يكفي لتغطيتها.
  4. خذ الأطباق ، واحدًا تلو الآخر إلى مصدر / غرفة UV-C (الغرفة السفلية لفرن التهجين / رابط عبر الأشعة فوق البنفسجية ؛ جدول المواد). وضع الطبق في الغرفة وإزالة غطاء الطبق. يضمن وضع الغطاء المفتوح للطبق أن تتلقى الخلايا الحد الأقصى لجرعة الأشعة فوق البنفسجية-C أثناء التعرض للأشعة فوق البنفسجية-C.
  5. تعريض الخلايا لدرجات/جرعات مختلفة من الأشعة فوق البنفسجية-C: 1 J/m2،100J/m2،1000 J/m2 و 10،000 J/m2.
  6. بعد التعرض للأشعة فوق البنفسجية- C، استبدل غطاء كل من الأطباق على الفور وأزلها من غرفة مصدر الأشعة فوق البنفسجية-C.
  7. جلب كل من الأطباق إلى غطاء محرك الهواء تدفق الهواء laminar وأعلى حتى كل من الأطباق مع 2 مل من وسائل الإعلام الكاملة الطازجة.
  8. احتضان الخلايا لمدة 3 ساعة في حاضنة CO2 37 درجة مئوية. ثلاث ساعات من احتضان بعد التعرض للأشعة فوق البنفسجية-C هو الأمثل لتصور وتحديد الآثار في وقت مبكر.

3. إعداد وسائط تلطيخ الخلايا الحية

  1. إعداد وسائل الإعلام تلطيخ جديدة خلال آخر 15 دقيقة من 3 ح حضانة الخلية بعد التعرض للأشعة فوق البنفسجية- C.
  2. قبل الحارة 10 مل من وسائط تلطيخ تحتوي على 10٪ FBS-DMEM تكملها مع 1٪ القلم العقدية إلى 37 درجة مئوية.
  3. إضافة 5 ميكرولتر من 10 مم DCFDA؛ 5 ميكرولتر من محلول Hoechst 10 ملغ/مل و200 ميكرولتر من 1 ملغم/مل يوديد يوم بروبيديوم. التركيزات النهائية للDCFDA، Hoechst و PI هي 5 ميكرومتر، 5 ميكروغرام/مل و 20 ميكروغرام/مل، على التوالي، في 10 مل من وسائط تلطيخ.

4. DCFDA تلطيخ الأشعة فوق البنفسجية - C يتعرض خلايا العين الماوس الأولية

  1. بعد 3 ساعة من حضانة الأشعة فوق البنفسجية -C تعرض خلايا العين الأولية الماوس بجرعات مختلفة، يستنشق وسائل الإعلام من الأطباق 35 ملم.
  2. تجديد مع 2 مل من إعداد هابا جديدة DCFDA تلطيخ وسائل الإعلام إلى كل من الأطباق بلطف من الجانبين.
  3. احتضان الخلايا مع وسائط تلطيخ لمدة 15 دقيقة في الظلام في حاضنة 37 درجة مئوية CO2 لتلطيخ الخلية الحية.

5. عرض DCFDA (ROS) ، Hoechst وPI الخلايا الملطخة

  1. بعد الانتهاء من الحضانة، تجاهل وسائل الإعلام تلطيخ.
  2. إضافة وسائط كاملة جديدة إلى الخلايا ومراقبة الخلايا تحت المجهر الفلورسنت مقلوب / صور الخلية(جدول المواد). تصوير الحقول المطلوبة: مشرق الميدان، الفلورية الزرقاء، الفلورية الحمراء، الفلورسينس الأخضر.
    ملاحظة: الخلايا الزرقاء الملطخة الفلورية هي النوى، والفلورسينس الأخضر هو لخلايا توليد ROS والفلورية الحمراء يشير إلى الخلايا الميتة إيجابية PI.

6. القياس الكمي للخلايا الملطخة (Hoechst-Blue و PI-Dead و Green-ROS) باستخدام تقنيات التصوير

  1. تصدير الصور التي تم التقاطها تحت المجهر الفلوري المقلوب / صور الخلية إلى ImageJ للقياس الكمي.
  2. افتح كل صورة من الصور مرة واحدة، باستخدام كل قناة (أي زرقاء (نواة/هويشت)، خضراء (ROS)، حمراء (ميتة/إيجابية PI)) بالتتابع، للعد. ابدأ من عنصر التحكم غير المكشوف والانتقال بالتتابع إلى 1 و100 و1000 و1000 000J/m-2.
  3. عد الخلايا باستخدام أداة عد الخلايا التي تم وضع علامة عليها كصليب في قائمة البرامج لكل حقل من الحقول [موجب أزرق (إيجابي Hoechst ؛ النوى) ، إيجابي أحمر (PI إيجابي ؛ خلايا ميتة) ، موجب أخضر (ROS)] في كل من الصور المقابلة لكل من العلاجات.
  4. عد من خلال النقر على كل من إشارات محددة في كل من الحقول. على سبيل المثال، النقر على النوى الملونة الزرقاء / Hoechst سيعطي العدد الإجمالي للنواة في حقل معين.
  5. حساب النتائج كنسبة مئوية من وفيات الخلايا عن طريق تلف الأشعة فوق البنفسجية (عدد الخلايا الإيجابية PI × 100 مقسومة على عدد الخلايا الإيجابية Hoechst) والنسبة المئوية لإنتاج ROS عن طريق تلف الأشعة فوق البنفسجية (عدد الخلايا الإيجابية DCFDA × 100 مقسومًا على عدد الخلايا الإيجابية Hoechst).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

DCFDA هو صبغة عديم اللون التي هي شكل من أشكال الفلورسين المختزلكيميائي استعمل كمؤشر للكشف عن روس في الخلايا. هذه الصبغة يحصل المحاصرين داخل الخلايا وتتأكسد بسهولة إلى الفلورسنت ديكلورودي هيدروفلورسين (DCF), التي تنبعث منها الفلورسيس الأخضر. يمكن الكشف عن هذا الفلورية باستخدام المجهر الفلوري. يمكن تصور الخلايا وربطها مع تراكم ROS على النحو التالي: (1) الخلايا الحية دون ROS تنبعث منها فلورانة زرقاء عالية؛ (2) الخلايا الحية دون ROS تنبعث منها الفلورسينالأزرق العالي. '2' تنبعث من الخلايا الحية ذات التراكم ROS تفلور أزرق مرتف...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

طريقة تلطيخ DCFDA الموصوفة هنا تمكن من تصور ROS في خلايا حية العين الأولية الماوس تعامل مع الأشعة فوق البنفسجية-C. ميزة طريقة تلطيخ هذه هو أنه يسمح أيضا للباحثين لدراسة الآثار الفورية للأشعة فوق البنفسجية -C (3 ساعات بعد التعرض UVC) على الخلايا الحية وتعدادها في وقت واحد لنسبة إيجابية ROS، وكذلك، الخلايا الميتة. وعلاوة على ذلك، كما يتم استخدام طريقة تلطيخ على الخلايا الحية، يمكن احتضان الخلايا أكثر في نفس وسائل الإعلام لفترة أطول (عدة أيام) لدراسة الآثار المتأخرة للأشعة فوق البنفسجية-C. وبالتالي ، فإن طريقة تلطيخ هذه تجع...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تلقى المؤلفون دعمًا تمويليًا من مختبرات Bio-Rad الهند الخاصة المحدودة لرعاية المقال.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويعترف أصحاب البلاغ بالدعم المقدم من مركز ينبويا للبحوث، ينبويا (الذي يعتبر جامعياً) لمرافق الهياكل الأساسية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
2',7'-ثنائي كلورو فلوريسين ثنائي الأسيتات (DCFDA)SigmaD68832',7'-ثنائي كلورو فلورسين ثنائي أسيتات هو مسبار فلوري وقابل للاختراق للخلايا. يتم استخدامه لقياس أنواع الأكسجين التفاعلية.
طبق زراعة الخلايا (35 مم)EppendorfSA 003700112أطباق معقمة لزراعة الخلايا.
DMEM عالية الجلوكوزHiMediaAT007تحتوي على 4500 مجم / لتر من الجلوكوز.
مصل الأبقار الجنينية ، أصل الاتحاد الأوروبيHiMediaRM99955أحد أهم مكونات وسائط زراعة الخلايا. يوفر عوامل النمو والأحماض الأمينية والبروتينات والفيتامينات القابلة للذوبان في الدهون مثل A و D و E و K والكربوهيدرات والدهون والهرمونات والمعادن والعناصر النزرة.
GlutMaxGibco ، Thermo Fisher Scientific35050061يستخدم كمكمل وبديل ل L-glutamine. يساعد في تحسين صلاحية الخلايا ونموها.
HL-2000 HybrilinkerUVPفرن تهجين / رابط متقاطع للأشعة فوق البنفسجية
Hoechst 33342SigmaB2261وصمة عار Hoechst قابلة للاختراق لكل من الخلايا الحية والميتة. يرتبط بالحمض النووي المزدوج بغض النظر عما إذا كانت الخلية ميتة أو حية.
ماتريجلكورنينجمصفوفة غشاء قاعدي
MEM الأحماض الأمينية غير الأساسية (100X)جيبكو ، ثيرمو فيشر11140050العلمية تستخدم كمكمل لزيادة نمو الخلايا وقابليتها للحياة.
يستخدم البنسلين والستربتومايسين (Pen-Strep)Gibco و Thermo Fisher Scientific15140122البنسلين والستربتومايسين لمنع التلوث البكتيري في الثقافة.
بروبيديوم يوديدسيجماP4170صبغة الفلورسنت التي لا تنفذ إلا للخلايا الميتة. يرتبط بالحمض النووي ويساعد في التمييز بين الخلايا الحية والميتة.
TryplE ExpressThermo Fisher عامل تفكك الخلايا اللطيف العلمي
ZOE Fluorescent Cell ImagerBio-rad

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gipson, I. K. The ocular surface: the challenge to enable and protect vision: the Friedenwald lecture. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 48 (10), 4391-4398 (2007).
  2. Sridhar, M. S. Anatomy of cornea and ocular surface. Indian Journal of Ophthalmoogy. 66 (2), 190-194 (2018).
  3. Betteridge, D. J. What is oxidative stress. Metabolism. 49 (2), Suppl 1 3-8 (2000).
  4. Ray, P. D., Huang, B. W., Tsuji, Y. Reactive oxygen species (ROS) homeostasis and redox regulation in cellular signaling. Cell Signaling. 24 (5), 981-990 (2012).
  5. Nita, M., Grzybowski, A. The Role of the Reactive Oxygen Species and Oxidative Stress in the Pathomechanism of the Age-Related Ocular Diseases and Other Pathologies of the Anterior and Posterior Eye Segments in Adults. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2016, 3164734(2016).
  6. Covarrubias, L., Hernandez-Garcia, D., Schnabel, D., Salas-Vidal, E., Castro-Obregon, S. Function of reactive oxygen species during animal development: passive or active. Developmental Biology. 320 (1), 1-11 (2008).
  7. Behar-Cohen, F., et al. Ultraviolet damage to the eye revisited: eye-sun protection factor (E-SPF(R)), a new ultraviolet protection label for eyewear. Clinical Ophthalmology. 8, 87-104 (2014).
  8. Izadi, M., Jonaidi-Jafari, N., Pourazizi, M., Alemzadeh-Ansari, M. H., Hoseinpourfard, M. J. Photokeratitis induced by ultraviolet radiation in travelers: A major health problem. Journal of Postgraduate Medicine. 64 (1), 40-46 (2018).
  9. de Jager, T. L., Cockrell, A. E., Du Plessis, S. S. Ultraviolet Light Induced Generation of Reactive Oxygen Species. Advances in Experimental Medicine and Biology. 996, 15-23 (2017).
  10. Degl'Innocenti, D., et al. Oxadiazon affects the expression and activity of aldehyde dehydrogenase and acylphosphatase in human striatal precursor cells: A possible role in neurotoxicity. Toxicology. 411, 110-121 (2019).
  11. Li, Z., et al. APC-Cdh1 Regulates Neuronal Apoptosis Through Modulating Glycolysis and Pentose-Phosphate Pathway After Oxygen-Glucose Deprivation and Reperfusion. Cellular and Molecular Neurobiology. 39, 123-135 (2019).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Oxidative Damage AssessmentUV C Radiation ExposureDCFDA StainingROS DetectionPropidium Iodide StainingHoechst Nuclear StainingLive Dead Cell QuantificationFluorescent Imaging AnalysisReactive Oxygen Species Measurement

مقالات ذات صلة