يوضح هذا البروتوكول الكشف المتزامن لأنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) والخلايا الحية والخلايا الميتة في الثقافات الأولية الحية من خلايا سطح العين الماوس. 2', 7'-Dichloroforesindiacetate, يتم استخدام يوديد البروبيديوم, وتلطيخ Hoechst لتقييم ROS, الخلايا الميتة, والخلايا الحية, على التوالي, تليها التصوير والتحليل.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
تقييم الضرر التأكسدي في الخلايا السطحية الرئيسية للفأرة /الخلايا الجذعية استجابة للأضرار فوق البنفسجية-C (UV-C)
* These authors contributed equally
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
يتعرض سطح العين للبلى العادية بسبب عوامل بيئية مختلفة. ويشكل التعرض للأشعة فوق البنفسجية - C خطرا على الصحة المهنية. هنا، نُظهر تعرض الخلايا الجذعية الأولية من سطح العين للفأر ة إلى الأشعة فوق البنفسجية-C. أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) تشكيل هو قراءة مدى الإجهاد التأكسدي / الضرر. في الإعداد التجريبي في المختبر ، من الضروري أيضًا تقييم النسبة المئوية للخلايا الميتة الناتجة عن الإجهاد التأكسدي. في هذه المقالة، سوف نبرهن على 2',7'-Dichloroforesindiacetate (DCFDA) تلطيخ الأشعة فوق البنفسجية-C يتعرض الخلايا الجذعية الرئيسية سطح العين الماوس وقياسها على أساس الصور الفلورية من تلطيخ DCFDA. DCFDA تلطيخ يتوافق مباشرة مع جيل ROS. كما نبرهن على القياس الكمي للخلايا الميتة والحية عن طريق تلطيخ متزامن مع يوديد البروبيديوم (PI) وهويشت 3332 على التوالي والنسبة المئوية لخلايا DCFDA (ROS إيجابية) وPI الإيجابية.
المقدمة
سطح العين (OS) هو وحدة وظيفية تتكون أساسا من الطبقة الخارجية والظهارة الغدية للقرنية، الغدة lachrymal، الغدة meibomian، الملتحمة، جزء من هوامش غطاء العين والداخلية التي تشير عبر الترانسدوس1. تركز طبقة القرنية الشفافة على شكل قبة الضوء على شبكية العين. يتكون هذا النسيج اللاوعي من مكونات خلوية مثل الخلايا الظهارية والخلايا القرنية والخلايا الانائية والمكونات الخلوية مثل الكولاجين وجليكوزامينوجليكان2. يتم استنزاف المنطقة من الدموع التي توفر أيضا معظم المواد الغذائية. الموقع التشريحي لنظام التشغيل يجبرها على أن تكون على اتصال مباشر مع البيئة الخارجية، وغالبا ما يعرضها لمختلف المكونات القاسية مثل الضوء الساطع والميكروبات وجزي....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
أجريت التجربة على خلايا العين الأولية / الخلايا الجذعية المستمدة من عين الفأر ة المهق السويسرية. تمت الموافقة على استخدام الحيوانات لحصاد العيون لهذه التجربة من قبل اللجنة الأخلاقية الحيوانية المؤسسية، ينبويا (تعتبر جامعة) (رقم موافقة IEAC، 6a/19.10.2016).
1. الاستعدادات من الكواشف
ملاحظة: اشتقاق الخلايا الأولية/الخلايا الجذعية من سطح العين الماوس خارج نطاق هذا البروتوكول. وبالتالي، فإننا نظهر جرعات التعرض للأشعة فوق البنفسجية-C، وإعداد الكاشف لتقييم ROS والخلايا الحية والميتة وقياسها الكمي. يرجى الرجوع إلى الجدول 1 للاطلاع على المجلدات ذات الصلة من الكواشف (10٪ مصل الأبقار الجنينية، DCFDA، Hoechst....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
DCFDA هو صبغة عديم اللون التي هي شكل من أشكال الفلورسين المختزلكيميائي استعمل كمؤشر للكشف عن روس في الخلايا. هذه الصبغة يحصل المحاصرين داخل الخلايا وتتأكسد بسهولة إلى الفلورسنت ديكلورودي هيدروفلورسين (DCF), التي تنبعث منها الفلورسيس الأخضر. يمكن الكشف عن هذا الفلورية باستخدام المجهر الفلوري. يمكن تصور الخلايا وربطها مع تراكم ROS على النحو التالي: (1) الخلايا الحية دون ROS تنبعث منها فلورانة زرقاء عالية؛ (2) الخلايا الحية دون ROS تنبعث منها الفلورسينالأزرق العالي. '2' تنبعث من الخلايا الحية ذات التراكم ROS تفلور أزرق مرتف.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
طريقة تلطيخ DCFDA الموصوفة هنا تمكن من تصور ROS في خلايا حية العين الأولية الماوس تعامل مع الأشعة فوق البنفسجية-C. ميزة طريقة تلطيخ هذه هو أنه يسمح أيضا للباحثين لدراسة الآثار الفورية للأشعة فوق البنفسجية -C (3 ساعات بعد التعرض UVC) على الخلايا الحية وتعدادها في وقت واحد لنسبة إيجابية ROS، وكذلك، الخلايا الميتة. وعلاوة على ذلك، كما يتم استخدام طريقة تلطيخ على الخلايا الحية، يمكن احتضان الخلايا أكثر في نفس وسائل الإعلام لفترة أطول (عدة أيام) لدراسة الآثار المتأخرة للأشعة فوق البنفسجية-C. وبالتالي ، فإن طريقة تلطيخ هذه تجع.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
تلقى المؤلفون دعمًا تمويليًا من مختبرات Bio-Rad الهند الخاصة المحدودة لرعاية المقال.
شكر وتقدير
ويعترف أصحاب البلاغ بالدعم المقدم من مركز ينبويا للبحوث، ينبويا (الذي يعتبر جامعياً) لمرافق الهياكل الأساسية.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| 2',7'-ثنائي كلورو فلوريسين ثنائي الأسيتات (DCFDA) | Sigma | D6883 | 2',7'-ثنائي كلورو فلورسين ثنائي أسيتات هو مسبار فلوري وقابل للاختراق للخلايا. يتم استخدامه لقياس أنواع الأكسجين التفاعلية. |
| طبق زراعة الخلايا (35 مم) | Eppendorf | SA 003700112 | أطباق معقمة لزراعة الخلايا. |
| DMEM عالية الجلوكوز | HiMedia | AT007 | تحتوي على 4500 مجم / لتر من الجلوكوز. |
| مصل الأبقار الجنينية ، أصل الاتحاد الأوروبي | HiMedia | RM99955 | أحد أهم مكونات وسائط زراعة الخلايا. يوفر عوامل النمو والأحماض الأمينية والبروتينات والفيتامينات القابلة للذوبان في الدهون مثل A و D و E و K والكربوهيدرات والدهون والهرمونات والمعادن والعناصر النزرة. |
| GlutMax | Gibco ، Thermo Fisher Scientific | 35050061 | يستخدم كمكمل وبديل ل L-glutamine. يساعد في تحسين صلاحية الخلايا ونموها. |
| HL-2000 Hybrilinker | UVP | فرن تهجين / رابط متقاطع للأشعة فوق البنفسجية | |
| Hoechst 33342 | Sigma | B2261 | وصمة عار Hoechst قابلة للاختراق لكل من الخلايا الحية والميتة. يرتبط بالحمض النووي المزدوج بغض النظر عما إذا كانت الخلية ميتة أو حية. |
| ماتريجل | كورنينج | مصفوفة غشاء قاعدي | |
| MEM الأحماض الأمينية غير الأساسية (100X) | جيبكو ، ثيرمو فيشر | 11140050 | العلمية تستخدم كمكمل لزيادة نمو الخلايا وقابليتها للحياة. |
| يستخدم البنسلين والستربتومايسين (Pen-Strep) | Gibco و Thermo Fisher Scientific | 15140122 | البنسلين والستربتومايسين لمنع التلوث البكتيري في الثقافة. |
| بروبيديوم يوديد | سيجما | P4170 | صبغة الفلورسنت التي لا تنفذ إلا للخلايا الميتة. يرتبط بالحمض النووي ويساعد في التمييز بين الخلايا الحية والميتة. |
| TryplE Express | Thermo Fisher عامل تفكك الخلايا اللطيف العلمي | ||
| ZOE Fluorescent Cell Imager | Bio-rad |
المراجع
- Gipson, I. K. The ocular surface: the challenge to enable and protect vision: the Friedenwald lecture. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 48 (10), 4391-4398 (2007).
- Sridhar, M. S. Anatomy of cornea and ocular surface.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
