مقالة منهجية

NMR القائمة على تحليل النشاط لتحديد تثبيط مركب, قيم IC50, نشاط Artifactual, ونشاط الخلية الكاملة من النوكليوسيد الريبوهيدرولاسيس

DOI:

10.3791/59928

⸱

يونيو 30, 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Chemistry, Adelphi University, 2Department of Chemistry, Washington University in St. Louis, 3Department of Chemistry, Boston University

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد وضعت اختبارات النشاط القائمة على NMR لتحديد وتوصيف مثبطات اثنين من الإنزيمات الريبوهيدرولاز النوكليوسيد. يتم توفير بروتوكولات للاختبارات المركبة الأولية في 500 ميكروم و 250 ميكرومتر، واختبارات استجابة الجرعة لتحديد قيم IC50، وفحوصات المنظفات المضادة للشاشة، واختبارات الشاشة المضادة لتخفيف القفزة، والفحوصات في الخلايا القولونية بأكملها.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وكثيراً ما يستخدم التحليل الطيفي لـ NMR لتحديد وتوصيف مثبطات الإنزيم في اكتشاف الأدوية، ولا سيما في سياق فحص الشظايا. وتختبر الاختبارات القائمة على النشاط القائم على معدل وفيات الوفيات الضعيفة بشكل مثالي للعمل في التركيزات الأعلى لمركبات الاختبار اللازمة للكشف عن هذه المثبطات الأضعف. يمكن للنطاق الديناميكي وتشتت التحول الكيميائي في تجربة NMR بسهولة حل الرنين من الركيزة والمنتج ومركبات الاختبار. وهذا يتناقض مع الاختبارات الطيفية، التي غالباً ما تنشأ فيها مشاكل تداخل القراءة من المركبات ذات الخصائص المتداخلة لامتصاص الأشعة فوق البنفسجية. وبالإضافة إلى ذلك، نظراً لأنها تفتقر إلى الإنزيمات مراسل، واختبارات NMR الإنزيم واحد ليست عرضة للإيجابيات كاذبة مقرونة بالقياس. هذه السمة يجعلها مفيدة كاختبارات متعامدة، تكمل الاختبارات التقليدية عالية الإنتاجية الفحص واختبارات الفرز على مقاعد البدلاء. يتم توفير بروتوكولات مفصلة للاختبارات المركبة الأولية في 500 ميكروم و 250 ميكرومتر، واختبارات استجابة الجرعة لتحديد قيم IC50، وفحوصات المنظفات المضادة للشاشة، وفحوصات الشاشة المضادة لتخفيف القفزة، والفحوصات في الخلايا القولونية بأكملها. يتم عرض الأساليب باستخدام اثنين من الإنزيمات الريبوهيدرولاز النوكليوسيد. يظهر استخدام 1H NMR للإنزيم الخاص بالبيورين، في حين يظهر 19F NMR للإنزيم الخاص بالبيريميدين. تنطبق البروتوكولات بشكل عام على أي إنزيم حيث يمكن ملاحظة الركيزة والرنين المنتج وتمييزه بالتحليل الطيفي NMR. لتكون الأكثر فائدة في سياق اكتشاف المخدرات، يجب أن يكون التركيز النهائي للركيزة لا يزيد عن 2-3x قيمة Km. يعتمد اختيار تجربة NMR على تفاعل الانزيم وركائز المتاحة، فضلا عن الأجهزة NMR المتاحة.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

التحليل الطيفي بالرنين المغناطيسي النووي (NMR) راسخ لتوصيف ورصد تفاعلات الإنزيم1،2. وتستخدم الاختلافات في التحولات الكيميائية وأنماط اقتران للتمييز بين الركيزة والرنين المنتج، وتستخدم كثافة الرنين النسبي لتحديد مقدار نسبة رد الفعل. ويلاحظ استهلاك الركيزة وابتكار المنتج مباشرة في طيف الـ NMR. وهذا يتناقض مع القياس الطيفي أو التحليل الطيفي للفلور، حيث يشار إلى مسار زمن التفاعل بتغيير في الامتصاص يعزى إلى بعض الأنواع الكيميائية التي يتم استهلاكها أو إنشاؤها. تماما كما هو الحال مع الطرق الأخرى، يمكن استخدام NMR لدراسة ردود فعل الإنزيم كدالة لدرجة الحرارة، ودرجة الألف، أو غيرها من شروط الحل، ويمكن تحديد آثار مثبطات.

في الآونة الأخيرة، تم إثبات فحوصات نشاط الإنزيم القائم على NMR لفحص الشظايا3و4. الاختبارات المستندة إلى NMR هي مناسبة بشكل مثالي للعمل في تركيزات أعلى من مركبات الاختبار (غالباما ما يصل إلى 1 mM) اللازمة للكشف عن هذه المثبطات أضعف. يمكن للنطاق الديناميكي وتشتت التحول الكيميائي في تجربة NMR بسهولة حل الرنين من الركيزة والمنتج ومركبات الاختبار. ويقارن ذلك بشكل إيجابي باختبارات الطيف الطيفي حيث تنشأ مشاكل تداخل القراءة من المركبات ذات التشكيلات الجانبية المتداخلة للامتصاص فوق البنفسجي. وبالإضافة إلى ذلك، نظراً لأنها تفتقر إلى الإنزيمات مراسل، واختبارات NMR الإنزيم واحد ليست عرضة للإيجابيات كاذبة مقرونة بالقياس. هذه الميزة يجعلها مفيدة كما الاختبارات متعامدة، واستكمال التقليدية عالية الإنتاجية فحص الاختبارات والفرز على مقاعد البدلاء5.

في مختبر البحوث لدينا، وتستخدم اختبارات النشاط القائم على NMR لتحديد وتقييم مثبطات تريتشوناز المهبلية النوكليوسيد الريبيوهيدرولاز. الطفيلي المهبلي T. يسبب المرض غير الفيروسي ة المنقولة جنسيا ً6. زيادة المقاومة للعلاجات القائمة7 هو الدافع للحاجة إلى علاجات جديدة، آلية القائم، مع الإنزيمات الأساسية مسار الإنقاذ النوكليوسيد تمثل الأهداف الرئيسية8. وقد تم تطوير اختبارات النشاط المستندة إلى NMR لكل من الإنزيمات الخاصة بالبيريميدين والبيورين، والريدين نوكليوسيد ريبوهيدرولاز (UNH)9، والأدينوسين / غوانوزين مفضلا النوكليوسيد ريبوهيدرولاز (AGNH)10. وترد ردود الفعل التي حفزت من قبل هذه الإنزيمات اثنين في الشكل 1. وتستخدم الاختبارات NMR لفحص مكتبات أجزاء لنقاط البداية الكيميائية، وتحديد قيم IC50، والازهاتمن مثبطات ربط التجميع أو التكافؤ 11 . ويجري أيضا ترجمة نفس الاختبارات لتقييم نشاط الإنزيم في الخلايا كلها12.

يتم توفير بروتوكولات مفصلة للاختبارات المركبة الأولية في 500 ميكروم و 250 ميكرومتر، واختبارات استجابة الجرعة لتحديد قيم IC50، وفحوصات المنظفات المضادة للشاشة، وفحوصات الشاشة المضادة لتخفيف القفزة، والفحوصات في الخلايا القولونية بأكملها. تنطبق البروتوكولات بشكل عام على أي إنزيم يمكن أن يلاحظ فيه الركيزة والرنين المنتج ويميزه التحليل الطيفي NMR. وقد وضعت ثلاثة افتراضات للبساطة. أولاً، لم يتم تحديد الركيزة. وبالنسبة لفحوصات الأنشطة القائمة على معدل الوفيات الثلاثة لكي تكون مفيدة، ينبغي ألا يزيد التركيز النهائي للركيزة عن 2-3 x قيمة Km 4. في الأمثلة المعروضة، التركيزات النهائية من الأدينوسين و 5-فلورورين هو 100 ميكرومتر (ك = 54 ميكرومتر) و 50 ميكرومتر (ك = 15 ميكروم)، على التوالي. في البروتوكولات، وتحقيق هذه التركيزات يتوافق مع 12 μL من 5 m الأدينوسين أو 12 ميكرولتر من 2.5 mM 5-fluorouridine.

ثانياً، تم اختيار كمية الإنزيم المنصوص عليها في البروتوكولات، 5 μL، لتتوافق مع المبلغ المطلوب لينتج عن تحويل الركيزة إلى منتج بنسبة 75% تقريبًا في 30 دقيقة. هذه الكمية تمثل عادة تخفيفكبير من مخزون الإنزيم النقي، ويجب تحديد التخفيف مقدما لكل إنزيم. يتم تخزين حلول الإنزيم المنقي AGNH وUNH عند -80 درجة مئوية في الأليقوات التي توفر ما يكفي من الإنزيم لعدة آلاف من ردود الفعل. وبالتالي، فإن عامل التخفيف من الناحية المثالية يحتاج فقط إلى تحديد أو التحقق من صحته كل بضعة أشهر. ثالثاً، لم يتم تحديد تجربة NMR 1D المحددة. في النتائج التمثيلية، يظهر معدل1 H NMR لAGNH10 ويظهر 19F NMR لUNH9، مع تجربة NMR المذكورة في المراجع المقابلة. يعتمد اختيار تجربة NMR على تفاعل الانزيم وركائز المتاحة، فضلا عن الأجهزة NMR المتاحة. وأخيراً، تجدر الإشارة إلى أن النهج التجريبي الموصوف لا يلتزم بالمتطلبات الصارمة للمعدل الكمّي (QNMR)13,14. في البروتوكول، يتم تحديد رد فعل النسبة المئوية باستخدام التغيرات النسبية في كثافة نفس الرنين في كل طيف، بدلا من تحديد التركيزات المطلقة. هذا النهج يلغي الحاجة إلى الحصول على البيانات وتعديلات المعالجة، فضلا عن المعايير الداخلية أو الخارجية، التي هي مطلوبة لqNMR.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. اختبار اختبار أولي اختبار اختبار اختبار في 500 μM و 250 μM

  1. إعداد الركيزة ومركب الاختبار لردود الفعل.
    1. إعداد حلول المخزون من الركيزة (الأدينوسين أو 5-فلوروورديدين) في الماء و50 m مركب اختبار في ثنائي ميثيل سولفسيد deuterated (DMSO). راجع قسم المقدمة لتركيزات محلول الركيزة لاستخدامها.
    2. إضافة 12 ميكرولتر من الركيزة (الأدينوسين أو 5-فلوروريدين) إلى كل من أربعة 1.5 أنابيب ميكروفوغ مل، 1-4.
    3. إضافة 6 μL من DMSO deuterated إلى أنابيب 1 (0 دقيقة التحكم) و 4 (30 دقيقة التحكم). إضافة 6 μL من مركب الاختبار إلى أنبوب 2. إضافة 3 μL من مركب الاختبار و 3 μL من DMSO deuterated إلى أنبوب 3.
  2. إعداد ما يكفي من حل المخزون رد فعل.
    ملاحظة: حل المخزون هو لخمسة ردود الفعل التي تحتوي كل 517 ميكرولتر من العازلة، 60 ميكرولتر من أكسيد الديوتريوم، و 5 ميكرولتر من محلول الإنزيم (AGNH أو UNH). راجع قسم المقدمة لتركيز محلول الانزيم لاستخدامها.
    1. إضافة 2.59 مل من العازلة رد فعل (50 mM فوسفات البوتاسيوم، 0.3 M KCl، ودرجة الحموضة 6.5) إلى أنبوب مخروطي 15 مل. إضافة 300 μL من أكسيد ديوتيريوم إلى الأنبوب المخروطي. أضف 25 ميكرولتر من محلول الانزيم (AGNH أو UNH) إلى المخروطية.
    2. قلب بلطف أنبوب مخروطي مرتين لخلط.
  3. في وقت واحد بدء وإرواء رد فعل التحكم دقيقة 0. نقل 582 μL من محلول المخزون رد الفعل إلى أنبوب ميكروفوغ نظيفة. إضافة 10 μL من 1.5 M HCl إلى هذا الأنبوب microfuge. نقل مجتمعة 592 ميكروفأنبوب 1 ميكروفوغ. يستنشق ويوزع العينة مرتين بطريقة بطيئة ولكنها متعمدة.
  4. بدء وتشغيل ردود الفعل الثلاثة المتبقية بطريقة متداخلة. في الوقت 0 دقيقة، نقل 582 μL من محلول المخزون رد الفعل إلى أنبوب ميكروفوغ 2. يستنشق ويوزع العينة مرتين بطريقة بطيئة ولكنها متعمدة. كرر على فترات 30 s لأنابيب ميكروفوغ 3 و 4. انتظر 30 دقيقة
  5. تهدئة ردود الفعل. في الوقت 30 دقيقة، إضافة 10 ميكرولتر من 1.5 M HCl إلى ميكروفوغ 2. كرر على فترات 30 s لأنابيب ميكروفوغ 3 و 4. نقل 600 ميكرولتر من الحل من كل ميكروفوغ إلى أنابيب NMR.
  6. الحصول على طيف معدل وفيات العشرة من خلال كل عينة. معالجة البيانات لضمان الطور الطوري الصحيح وخطوط الأساس الثابتة.
  7. حساب النسبة المئوية لتحويل الركيزة لأطياف التحكم.
    1. تراكب الأطياف لمدة 0 دقيقة و 30 دقيقة الضوابط. قياس إشارة الركيزة في التحكم دقيقة 0 لمطابقة التحكم 30 دقيقة. لاحظ هذه النسبة المئوية.
    2. حساب النسبة المئوية للتحويل كـ (100 - النسبة المئوية المحددة في الخطوة 1.7.1).
  8. حساب النسبة المئوية لتحويل الركيزة لتفاعلات تحتوي على مركب الاختبار.
    1. الأطياف التراكبية للتحكم لمدة 0 دقيقة وتفاعل أول يحتوي على مركب اختبار 500 ميكرومتر. قم بتحجيم إشارة الركيزة في عنصر التحكم بـ 0 دقيقة لمطابقة الطيف مع مركب الاختبار. لاحظ هذه النسبة المئوية. حساب التحويل بنسبة مئوية كـ (100 - تحديد النسبة المئوية).
    2. كرر التفاعل الثاني الذي يحتوي على مركب اختبار 250 ميكرومتر.
  9. حساب رد الفعل في المئة وتثبيط في المئة لكل تركيز مركب اختبار.
    1. حساب رد الفعل في المئة كما (1.8.1/1.7.2) × 100.
    2. حساب التثبيط في المئة كما (100 - النسبة المئوية المحددة في الخطوة 1.9.1).

2. تحديد القيمIC 50

  1. إعداد الركيزة ومركب الاختبار لردود الفعل.
    1. إعداد حلول المخزون من الركيزة (الأدينوسين أو 5-فلورورين) في الماء و10 m مجمع اختبار في DMSS deuterated. راجع قسم المقدمة لتركيزات محلول الركيزة لاستخدامها.
  2. إعداد التمييع التسلسلي من 10 mM اختبار مركب (في DMSO deuterated).
    1. أضف 36 ميكرولتر DMSO deuterated إلى خمسة 1.5 أنابيب ميكروفوغ 1.5 مل، 1-5.
    2. إضافة 12 μL 10 mm اختبار مجمع إلى أنبوب 1 والاستفادة برفق لخلط. مجمع الاختبار هو الآن 2.5 m.
    3. نقل 12 ميكرولتر من أنبوب 1 إلى أنبوب 2 والاستفادة طفيفة لخلط. مجمع الاختبار هو الآن 0.63 m. نقل 12 μL من أنبوب 2 إلى أنبوب 3 والاستفادة طفيفة لخلط. مركب الاختبار هو الآن 0.16 m. نقل 12 μL من أنبوب 3 إلى أنبوب 4 والاستفادة طفيفة لخلط. مركب الاختبار الآن 0.04 m. نقل 12 μL من أنبوب 4 إلى أنبوب 5 والاستفادة طفيفة لخلط. مركب الاختبار الآن 0.01 m.
  3. إعداد 14 1.5 مل ميكروفوغ أنابيب لردود الفعل.
    1. إضافة 12 ميكرولتر من الركيزة (الأدينوسين أو 5-فلوروريدين) إلى كل من 14 1.5 أنابيب ميكروفوغ مل، 1-14.
    2. إضافة 12 μL من DMSO deuterated إلى أنابيب 1 (0 دقيقة التحكم) و 14 (30 دقيقة التحكم).
    3. إضافة 12 μL من 10 mm اختبار المجمع إلى أنبوب 2 و 3. إضافة 12 μL من 2.5 mm اختبار المجمع إلى أنابيب 4 و 5. إضافة 12 μL من 0.63 m m اختبار المجمع إلى أنابيب 6 و 7. إضافة 12 μL من 0.16 m m اختبار المجمع إلى أنابيب 8 و 9. إضافة 12 μL من 0.04 mm اختبار المجمع إلى أنابيب 10 و 11. إضافة 12 μL من 0.01 mM اختبار المجمع إلى أنبوب 12 و 13.
  4. إعداد حل مخزون رد فعل كاف لتشغيل 15 ردود الفعل التي تحتوي على 511 ميكرولتر من العازلة، 60 ميكرولتر من أكسيد الديوتريوم، و 5 ميكرولتر من محلول الإنزيم (AGNH أو UNH) لكل منهما. راجع قسم المقدمة لتركيز محلول الانزيم لاستخدامها.
    1. إضافة 7.67 مل من العازلة رد فعل (50 mM فوسفات البوتاسيوم، 0.3 M KCl، ودرجة الحموضة = 6.5) إلى أنبوب مخروطي 15 مل. إضافة 900 ميكرولتر من أكسيد الديوتريوم إلى الأنبوب المخروطي. أضف 75 ميكرولتر من محلول الانزيم (AGNH أو UNH) إلى المخروطية.
    2. عكس بلطف أنبوب مخروطي 2X لخلط.
  5. اتبع الخطوات المبينة في الخطوات 1.3-1.9 إلى (باستخدام 576 ميكرولتر من محلول مخزون التفاعل) لتحديد نسبة التفاعل لكل تركيز مركب اختباري.
  6. احسب قيمة IC50 باستخدام GraphPad Prism.
    1. إنشاء جدول بيانات يربط بين سجل التركيزات المركبة لاختبار التفاعل (200 ميكرومتر، 50 ميكرومتر، 12.5 ميكرومتر، 3.13 ميكرومتر، 0.78 ميكرومتر، 0.20 ميكرومتر) مع تفاعل النسبة المئوية (قيمتان لكل منهما).
    2. استخدم منحنى غير خطي مناسب لتحديد قيمة IC50 والخطأ القياسي.

3. المنظفات فحوصات الشاشة المضادة في 100 ميكرومتر و 50 ميكرومتر

  1. إعداد الركيزة ومركب الاختبار لردود الفعل.
    1. إعداد حلول المخزون من الركيزة (الأدينوسين أو 5-فلورورين) في الماء و10 m مجمع اختبار في DMSS deuterated. راجع قسم المقدمة لتركيزات محلول الركيزة لاستخدامها.
    2. إضافة 12 ميكرولتر من الركيزة (الأدينوسين أو 5-فلوروريدين) إلى كل من ثمانية 1.5 أنابيب ميكروفوغ مل، 1-8.
    3. إضافة 6 μL من DMSO deuterated إلى أنابيب 1 و 5 (0 دقيقة الضوابط) و 4 و 8 (30 دقيقة الضوابط). إضافة 6 μL من مركب الاختبار إلى أنابيب 2 و 6. إضافة 3 μL من مركب الاختبار و 3 μL من DMSO deuterated إلى أنابيب 3 و 7.
  2. إعداد ما يكفي من محلول المخزون رد فعل دون المنظفات لتشغيل خمسة ردود الفعل التي تحتوي على 517 μL من العازلة، 60 ميكرولتر من أكسيد ديوتريوم، و 5 ميكرولتر من محلول الإنزيم (AGNH أو UNH) لكل منهما. راجع قسم المقدمة لتركيز محلول الانزيم لاستخدامها.
    1. إضافة 2.59 مل من العازلة رد فعل (50 mM فوسفات البوتاسيوم، 0.3 M KCl، ودرجة الحموضة = 6.5) إلى أنبوب مخروطي 15 مل. إضافة 300 μL من أكسيد ديوتيريوم إلى الأنبوب المخروطي. أضف 25 ميكرولتر من محلول الانزيم (AGNH أو UNH) إلى المخروطية.
    2. عكس بلطف أنبوب مخروطي 2X لخلط.
  3. إعداد ما يكفي من حل المخزون رد فعل مع 0.01٪ v / V تريتون X-100 المنظفات لتشغيل خمسة ردود الفعل التي تحتوي على 517 ميكرولتر من العازلة، 60 لتر من أكسيد ديوتريوم، و 5 μL من محلول الإنزيم (AGNH أو UNH) لكل منهما.
    1. إضافة 2 μL من المنظفات تريتون X-100 إلى 20 مل من العازلة رد فعل (50 mM فوسفات البوتاسيوم، 0.3 M KCl، ودرجة الحموضة = 6.5). يجب استخدام حلول المنظفات في غضون يوم واحد.
    2. إضافة 2.59 مل من العازلة رد فعل تحتوي على 0.01٪ تريتون X-100 المنظفات إلى أنبوب مخروطي 15 مل. إضافة 300 μL من أكسيد ديوتيريوم إلى الأنبوب المخروطي. أضف 25 ميكرولتر من محلول الانزيم (AGNH أو UNH) إلى المخروطية.
    3. عكس بلطف أنبوب مخروطي 2X لخلط.
  4. بالنسبة للأنابيب 1-4، باستخدام محلول مخزون التفاعل بدون المنظفات، اتبع الخطوات المبينة في الخطوات 1.3-1.9 لتحديد التثبيط في المئة لكل تركيز مركب اختبار.
  5. بالنسبة للأنابيب 5-8، باستخدام حل مخزون التفاعل مع 0.01% v/v Triton X-100 detergent، اتبع الخطوات المبينة في الخطوات 1.3-1.9 لتحديد التثبيط في المئة لكل تركيز مركب اختبار.

4. القفز المخفف فحوصات الشاشة المضادة

  1. إعداد الركيزة ومركبات الاختبار لردود الفعل
    1. إعداد حلول المخزون من الركيزة (الأدينوسين أو 5-فلورورين) في الماء و10 m مجمع اختبار في DMSS deuterated. راجع قسم المقدمة لتركيزات محلول الركيزة لاستخدامها.
    2. إضافة 53.8 μL من العازلة رد فعل (50 mM فوسفات البوتاسيوم، 0.3 M KCl، ودرجة الحموضة = 6.5) إلى اثنين 1.5 مل ميكروفوغ أنابيب (لكل منهما)، 1 و 2. إضافة 5 μL من الإنزيم (AGNH أو UNH) إلى أنبوب 1 و 2.
    3. إضافة 511 μL من العازلة رد فعل إلى اثنين 1.5 مل ميكروفوغ أنابيب، 3 و 4 (لكل منهما). إضافة 60 μL من أكسيد الديوتريوم إلى أنابيب 3 و 4. إضافة 5 μL من الإنزيم (AGNH أو UNH) إلى أنابيب 3 و 4.
    4. إضافة 1.2 μL من DMSO deuterated إلى أنبوب 1 (30 دقيقة التحكم). إضافة 1.2 μL من مركب الاختبار إلى أنبوب 2. إضافة 12 μL من DMSO deuterated إلى أنبوب 3 (30 دقيقة التحكم). إضافة 12 μL من مركب الاختبار إلى أنبوب 4. احتضان لمدة 30 دقيقة.
  2. إعداد اثنين 1.5 مل ميكروفوغ أنابيب مع حل التخفيف.
    1. إضافة 468 μL من العازلة رد فعل إلى كل من أنبوبين ميكروفوغ 1.5 مل، 5 و 6. إضافة 60 μL من أكسيد الديوتريوم إلى كل أنبوب (5 و 6).
  3. إعداد أربعة 1.5 مل ميكروفوغ أنابيب لردود الفعل.
    1. إضافة 12 ميكرولتر من الركيزة (الأدينوسين أو 5-فلوروريدين) إلى كل من أربعة 1.5 مل ميكروفوغ أنابيب, 7-10.
  4. أداء تخفيف اتطم وبدء ردود الفعل.
    1. نقل 528 μL من الحل من أنبوب 5 إلى أنبوب 1. يستنشق ويوزع العينة مرتين بطريقة بطيئة ولكنها متعمدة. نقل 528 μL من الحل من أنبوب 6 إلى أنبوب 2. يستنشق ويوزع العينة مرتين بطريقة بطيئة ولكنها متعمدة.
    2. في الوقت 0 دقيقة، نقل 588 μL من الحل من أنبوب 1 إلى أنبوب 7. يستنشق ويوزع العينة 2x بطريقة بطيئة ولكن متعمدة. على فترات 30 s، نقل 588 μL من الحل من أنبوب 2 إلى أنبوب 8، أنبوب 3 إلى أنبوب 9، وأنبوب 4 إلى أنبوب 10. يستنشق ويوزع العينة مرتين بطريقة بطيئة ولكنها متعمدة. انتظر 30 دقيقة
  5. بالنسبة للأنابيب 7-10، اتبع الخطوات المبينة في الخطوات 1.5-1.9 لتحديد التثبيط في المائة لكل تركيز مركب اختبار.

5. الاختبارات المركبة في E. القولونية الخلايا كلها

  1. إعداد 10 مل الثقافة بين عشية وضحاها من القولونية E. في اليوم السابق التجارب.
  2. إعداد E. الخلايا القولونية لتجارب NMR.
    1. جهاز طرد مركزي للخلايا في 1 مل aliquots لمدة 10 دقيقة في 15،000 x ز.
    2. تجاهل supernatant وإعادة تعليق كل aliquot من الخلايا في 1 مل من العازلة رد فعل (50 mM فوسفات البوتاسيوم، 0.3 M KCl، ودرجة الحموضة = 6.5) عن طريق الدوامة.
  3. اتبع القسمين 1 أو 2 للمقارنة المطلوبة مع التغييرات التالية:
    1. استبدل 280 ميكرولتر من المخزن المؤقت في محلول مخزون التفاعل مع 280 ميكرولتر من الخلايا التي تم إعادة تعليقها.
    2. بديل 5 ميكرولتر من الإنزيم (AGNH أو UNH) في حل رد الفعل مع 5 ميكرولتر من العازلة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويبين الشكل 2 نتائج اختبار مركبين ضد الأنيه باستخدام معدل1 H NMR بعد القسم 1. وتفاعل الانزيم هو الأكثر سهولة وكمي ً ً باختفاء الأدينوسين وحيد والرنين المزدوج في 8.48 جزء في المليون و 6.09 جزء في المليون، على التوالي، وظهور الرنين الأدينين singlet في 8.33 جزء في المليون كما لوحظ في التحكم 30 دقيقة الطيف. في وجود 500 ميكرومتر مركب 1، لا يتم تشكيل أي منتج كما يتضح من عدم وجود الرنين القبلين في 8.33 جزء في المليون. في وجود 250 μM مركب 1، تم تحويل حوالي 10٪ من الركيزة إلى المنتج. وعلى ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

البروتوكولات الموصوفة تنطبق عموما على العديد من الإنزيمات، شريطة أن تكون للركائز و/أو المنتجات إشارات قابلة للحل في طيف NMR. ومع ذلك، من الأهمية بمكان أن يكون تركيز الركيزة قريباً من قيمة Km وعالية بما يكفي للكشف في تجربة NMR ضمن إطار زمني معقول. تركيز الركيزة لا يزيد عن 2-3x قيمةM Kهو الأمثل للكشف عن مثبطات تنافسية، غير تنافسية، وغير تنافسية4. كما هو مبين هنا لUNH، الركيزة، Km القيم منخفضة مثل 15 μM مناسبة. ويمكن أن يؤدي استخدام الركيزة ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نشكر الدكتور دين براون على توفير مركبات من مكتبة أجزاء استرازينيكا والدكتور ديفيد باركين على توفير انزيمات AGNH و UNH. وقد تم دعم البحوث الواردة في هذا المنشور من قبل المعهد الوطني للحساسية والأمراض المعدية للمعاهد الوطنية للصحة بموجب جائزة رقم R15AI128585 إلى B. J. S. المحتوى هو فقط مسؤولية المؤلفين ولا يمثل بالضرورة وجهات النظر الرسمية للمعاهد الوطنية للصحة.كما تم دعم البحوث من قبل هوراس G. ماكدونيل زمالة البحوث الصيفية منحت لS. N. M., عائلة لاندسبرغ زمالة منحت لجي أ. ج.، ومنحة تطوير أعضاء هيئة التدريس وجائزة فريدريك بيتلهايم للأبحاث من جامعة أدلفي إلى ب. ج.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
AGNHمنقى داخلياN / ATVAG_213720
UNHمنقى داخلياN / ATVAG_092730
AdenosineSigmaA9251
5-FluorouridineSigmaF5130
ثنائي ميثيل سلفوكسيد D6Cambridge Isotope LabsDLM-10-100D ، 99.9٪
فوسفات البوتاسيوم أحادي القاعدةسيجماP0662
فوسفات البوتاسيوم ثنائي القاعدةسيجماP3786
كلوريد البوتاسيومسيجماP9541
أكسيد الديوتيريوممختبرات كامبريدج للنظائرDLM-4-100D ، 99.9٪
حمض الهيدروكلوريكفيشر كيميكالA144212
تريتون X-100سيجماX100
3- (ثلاثي ميثيل سيليل) بروبيونيك -2،2،3،3 ، -د4 ملح الصوديوم الحمضي (TSP)سيجما269913د ، 98٪
2،2،2-ثلاثي فلورو إيثانول -1،1-d2سيجما612197د ، 99.5٪
ماصةجيلسونF123602بيبيتمان كلاسيك P1000
ماصةجيلسونF123601بيبيتمان كلاسيك P200
ماصةجيلسونF123600بيبيتمان كلاسيك P20
أنابيب الطرد الدقيقفيشر ساينتفيك05-408-129
أنابيب مخروطيةكورنينج352099
أجهزة الطرد المركزيالدقيقة Eppendorf5418
خلاط دوامةفيشر ساينتيك02215365
أنابيب الرنين المغناطيسيNorell502-7أو حسب الاقتضاء لمطياف الرنين المغناطيسي
BrukerN / برنامجAvanceIII500
PrismGraphPadN / Aالإصدار 5.04
النووي النووي

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Jardetzky, O., Roberts, G. C. K. NMR in Molecular Biology. , Academic Press. New York. (1981).
  2. Evans, J. N. S. Biomolecular NMR spectroscopy. , Oxford University Press. Oxford, UK. (1995).
  3. Dalvit, C., et al. A general NMR method for rapid, efficient, and reliable biochemical screening. Journal of the American Chemical Society. 125, 14620-14625 (2003).
  4. Dalvit, C. Ligand- and substrate-based 19F NMR screening: Principles and applications to drug discovery. Progress in NMR Spectroscopy. 51, 243-271 (2007).
  5. Stockman, B. J., et al. Identification of allosteric PIF-pocket ligands for PDK1 using NMR-based fragment screening and 1H-15N TROSY experiments. Chemical Biology & Drug Design. 73, 179-188 (2009).
  6. Hirt, R. P., Sherrard, J. Trichomonas vaginalis origins, molecular pathobiology and clinical considerations. Current Opinion in Infectious Diseases. 28, 72-79 (2015).
  7. Conrad, M. D., Bradic, M., Warring, S. D., Gorman, A. W., Carlton, J. M. Getting trichy: Tools and approaches to interrogating Trichomonas vaginalis in a post-genome world. Trends in Parasitology. 29 (2013), 17-25 (2013).
  8. Versées, W., Steyaert, J. Catalysis by nucleoside hydrolases. Current Opinion in Structural Biology. 13, 731-738 (2003).
  9. Shea, T. A., et al. Identification of proton-pump inhibitor drugs that inhibit Trichomonas vaginalis uridine nucleoside ribohydrolase. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 24, 1080-1084 (2014).
  10. Beck, S., Muellers, S. N., Benzie, A. L., Parkin, D. W., Stockman, B. J. Adenosine/guanosine preferring nucleoside ribohydrolase is a distinct, druggable antitrichomonal target. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 25, 5036-5039 (2015).
  11. Muellers, S. N., et al. Ligand-efficient inhibitors of Trichomonas vaginalis adenosine/guanosine preferring nucleoside ribohydrolase. ACS Infectious Diseases. 5, 345-352 (2019).
  12. Veronesi, M., et al. Fluorine nuclear magnetic resonance-based assay in living mammalian cells. Analytical Biochemistry. 495, 52-59 (2016).
  13. Holzgrabe, U. Quantitative NMR spectroscopy in pharmaceutical applications. Progress in NMR Spectroscopy. 57, 229-240 (2010).
  14. Bharti, S. K., Roy, R. Quantitative 1H NMR spectroscopy. Trends in Analytical Chemistry. 35, 5-26 (2012).
  15. Dalvit, C., et al. Sensitivity improvement in 19F NMR-based screening experiments: Theoretical considerations and experimental applications. Journal of the American Chemical Society. 127, 13380-13385 (2005).
  16. Lambruschini, C., et al. Development of fragment-based n-FABS NMR screening applied to the membrane enzyme FAAH. ChemBioChem. 14, 1611-1619 (2013).
  17. Stockman, B. J. 2-Fluoro-ATP as a versatile tool for 19F NMR-based activity screening. Journal of the American Chemical Society. 130, 5870-5871 (2008).
  18. Aldrich, C., et al. The ecstasy and agony of assay interference compounds. ACS Central Science. 3, 143-147 (2017).
  19. Feng, B. Y., Shoichet, B. K. A detergent-based assay for the detection of promiscuous inhibitors. Nature Protocols. 1, 550-553 (2006).
  20. Copeland, R. A., Basavapathruni, A., Moyer, M., Scott, M. P. Impact of enzyme concentration and residence time on apparent activity recovery in jump dilution analysis. Analytical Biochemistry. , 206-210 (2011).
  21. Griveta, J. -P., Delort, A. -M. NMR for microbiology: In vivo and in situ applications. Progress in NMR Spectroscopy. 54, 1-53 (2009).
  22. Nijman, S. M. B. Functional genomics to uncover drug mechanism of action. Nature Chemical Biology. 11, 942-948 (2015).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

IC50

مقالات ذات صلة