ويشكل الانتشار جزءا هاما من الوظيفة الخلوية ، وقراءه مشتركه تستخدم لتقييم السمية المحتملة للعقاقير الجديدة. ولذلك ، فان قياس الانتشار هو فحص يستخدم بكثرة في بيولوجيا الخلايا. نقدم هنا طريقه بسيطه ومتنوعة لقياس الانتشار يمكن استخدامها في الخلايا الملتصقة وغير الملتصقة.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
قياس انتشار خلايا العضلات الملساء الوعائية باستخدام الكيمياء فوق
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
قدره الخلية علي التكاثر جزء لا يتجزا من الوظيفة العادية لمعظم الخلايا ، وخلل الانتشار هو في قلب العديد من عمليات المرض. ولهذه الأسباب ، فان قياس الانتشار أداه مشتركه تستخدم لتقييم وظيفة الخلية. ويمكن قياس تكاثر الخلايا ببساطه عن طريق العد ؛ ومع ذلك ، فان هذه وسيله غير مباشره لقياس الانتشار. أحدي الوسائل الشائعة للكشف المباشر عن الخلايا التي تستعد للتقسيم هي عن طريق دمج النظير النيونوسايد المسمي. وتشمل هذه التناظرية النيونوسايد المشعة 3ح-thymidine بالاضافه إلى النظير النيونوسايد غير المشعة مثل 5-برومو-2 ' ديوكسيريدين (brdu) و 5-ethynyl-2′-ديوكسيرادين (ايدو). يتم الكشف عن تاسيس EdU بالنقر علي الكيمياء ، والتي لديها العديد من المزايا بالمقارنة مع BrdU. وفي هذا التقرير ، نقدم بروتوكولا لقياس الانتشار بدمج النظام التعليمي. ويتضمن هذا البروتوكول خيارات لمختلف القراءات ، إلى جانب مزايا ومساوئ كل منها. ونناقش أيضا الأماكن التي يمكن فيها تحسين البروتوكول أو تغييره لتلبيه الاحتياجات المحددة للتجربة المخطط لها. وأخيرا ، فاننا نلمس الطرق التي يمكن بها تعديل هذا البروتوكول الأساسي لقياس نواتج أيض الخلايا الأخرى.
المقدمة
الانتشار هو جزء هام من الوظيفة الخلوية1،2. السيطرة علي الانتشار يؤثر علي العمليات العادية مثل التنمية ، والعمليات المرضية مثل السرطان وامراض القلب والاوعيه الدموية. فرط النمو من خلايا العضلات الملساء الاوعيه الدموية, علي سبيل المثال, ويعتقد ان تكون مقدمه لتصلب الشرايين3. وتستخدم أيضا التغيرات في انتشار الخلايا لتقييم السمية المحتملة للعقاقير الجديدة. ونظرا لتاثيرها الواسع النطاق ، فان قياس الانتشار هو عماد العديد من المختبرات القائمة علي بيولوجيا الخلايا.
ويمكن قياس تكاثر الخلايا بمجرد عد الزنزانات إذا كان عدد سكان الخلية من الفائدة يقسم بسرعة إلى حد ما. بالن....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1. الكشف عن ايدو باستخدام تسميه الفلورسنت
- حلول الأسهم
- اعداد الحل 5 مم ايدو الأسهم عن طريق أضافه 12.5 ملغ من ايدو إلى 10 مل من المقطر مزدوج ه2س.
- اعداد مكونات حل الملصقات: 200 مم تريس (3-هيدروكسي بروبيل تريازيلميثيل) أمين (THPTA) (100 ملغ في 1.15 mL ح2) ، 100 مم cuso4 (15.95 mg في 1 مل h2؛ جعل الطازجة) ، 10 ملم Cy3 picolyl-أزيد (1 ملغ في 95.3 ml h2o ، المخزنة في 5 μl قسامات في-20 درجه مئوية) ، و 1 م اسكوربات الصوديوم (200 ملغ في 1 مل H2؛ جعل الطازجة).
- اعداد محلول الأسهم resلازوردي في تركيز 0.15 ملغ/مل. تصفيه تعقيم وتخزين 1 مل قسامات في 4 ° c.
ملاحظه: يتم الحصول ع....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
في الشكل 2، ونحن نظهر نتائج ثلاث تجارب مختلفه قياس انتشار vsmc استجابه ل PDGF. بعد زراعه الخلايا في وسائل الاعلام وضعت ل SMCs ، نفذنا التجربة في المصل DMEM مجانا ، للقضاء علي اي اثار محتمله من المصل أو عوامل النمو علي الانتشار. في الشكل 2A نقارن النتائج ، من نفس التجربة ، وذلك باستخدام قراءات الفلورسنت مقابل الاناره. لقراءه هذه اللوحات ، استخدمنا قارئ اللوحة المجهرية متعدد الاستخدامات التي يمكن ان تقرا الامتصاص ، فلوري ، والتلالؤ (انظر جدول المواد
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
دمج التعليمية هو وسيله بسيطه ومباشره لقياس انتشار الخلايا. ومن المفيد بشكل خاص للخلايا الملتصقة13. بروتوكولنا يستخدم خلايا العضلات الملساء ، ولكنه ينطبق علي اي خليه ملتصقة (الظهاريه ، بطانية ، الخ). علي الرغم من ان البروتوكول ليس معقدا ، فان الخطوة الحاسمة الواحدة هي صنع حل وضع العلامات-يجب أضافه المكونات بالترتيب المذكور. الاضافه إلى ذلك ، مثل البقع الغربية الكيميائية ، إذا كان استخدام قراءات التلالؤ اللوحة يجب ان تقرا علي الفور.
يمكن تعديل عده أجزاء من البروتوكول أو ت.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
وليس لدي المؤلفين ما يفصحون عنه.
شكر وتقدير
نشكر كاتي كارول علي المساعدة الفنية. كما نشكر الدكتور ديفيد كول ومختبر تحليل البروبروتيميكس لتعليم وتوفير قارئ لوحه التصوير الخلوي. وكان هذا العمل مدعوما بمنحه من مؤسسه رايت ستيت (إلى L.E.W.).
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| 5-Ethynyl-2'-deoxyuridine | Carbosynth | NE08701 | |
| البيوتين بيكوليل أزيد | انقر فوق أدوات الكيمياء | 1167-5 | |
| CuSO4 | Fisher Scientific | C1297-100G | |
| Cy3 picolyl azide | Click Chemistry Tools | 1178-1 | |
| قارئ لوحة Cytation | Biotek | ||
| EVOS المجهر | العلوي | ||
| Sigma-Aldrich | 216763 | ||
| Na ascorbate | Sigma-Aldrich | 11140-250G | |
| NucBlue مجسات جاهزة للخلية | Invitrogen | R37606 | DAPI وصمة عار نووية |
| Odyssey Blocking Buffer | Li-Cor | 927-40000 | Blocking |
| Buffer | خدمات المجهر | 15710 | |
| PBS | فيشر | SH3002802 | |
| كلوريد الصوديوم | سيجما لايف ساينس | S3014-5kg | |
| ستربتافيدين الفجل بيروكسيداز تقنيات الحياة المترافقة | S911 | ||
| إشارة فائقة ELISA فيمتو | حراري | PI137075 | الركيزة ELISA |
| قارئ لوحة التآزر | Biotek | ||
| THPTA | Click أدوات الكيمياء | 1010-100 | |
| تريس هيدروكسي ميثيل أمينوميثان هيدروكلوريد (Tris-HCl) فيشر | ساينتفيك | BP153-500 | |
| تريتون × 100 | بيو راد | 1610407 | |
| توين 20 | فيشر سينتيفيك | BP337-100 |
المراجع
- Fuster, J. J., et al. Control of cell proliferation in atherosclerosis: Insights from animal models and human studies. Cardiovascular Research. 86 (2), 254-264 (2010).
- Zhu, J., Thompson, C. B. Metabolic regulation of cell ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
