تنشيط عبر مرتبطة Agarose للتنمية السريعة من الراتنجات الكروماتوغرافيا تقارب - التقاط الأجسام المضادة كدراسة حالة

Summary

في هذا الإجراء، يتم تعطيل الرباط الظهاري القائم على DsRed لإنتاج راتنج تقارب انتقائي للغاية لالتقاط الأجسام المضادة أحادية النسيلة من مستخلصات النباتات الخام أو اللاتابات ثقافة الخلية، كبديل للبروتين A.

Abstract

عادة ما يتم تحقيق تنقية الأجسام المضادة أحادية النسيلة (mAbs) من خلال البروتين A الكروماتوغرافيا تقارب، والتي يمكن أن تمثل ما يصل إلى 25٪ من تكاليف العملية الإجمالية. وبالتالي، فإن خطوات الالتقاط البديلة والفعالة من حيث التكلفة ذات قيمة بالنسبة للصناعة التحويلية على نطاق صناعي، حيث يتم إنتاج كميات كبيرة من الكمية الواحدة من الكمية. هنا نقدم طريقة لشل حركة النعت الظهاري ة المستندة إلى DsRed إلى راتنج أجاروز مرتبط ة عبر يسمح بالتقاط انتقائي للجسم المضاد 2F5 الذي يبطل مفعول فيروس نقص المناعة البشرية من مستخلصات النباتات الخام دون استخدام البروتين A. تم دمج ELDKWA الظهارة الخطية لأول مرة وراثيا إلى البروتين الفلورسنت DsRed وتم التعبير عن البروتين الانصهار في التبغ المعدلوراثيا(Nicotiana tabacum) النباتات قبل تنقية عن طريق الكروماتوغرافيا المعدنية أيونتقارب المعطلة. وعلاوة على ذلك، تم تحسين طريقة تقوم على الأجاروز المتصلة بتنشيط لكثافة الأربطة العالية، واقتران فعال وتكلفة منخفضة. وكانت درجة الحموضة وتكوين المخزن المؤقت وتركيز الرباط القابل للذوبان أهم المعلمات خلال إجراء الاقتران، الذي تم تحسينه باستخدام نهج تصميم التجارب. وقد تم اختبار الراتنج تقارب الناتجة عن قدرتها على ربط انتقائي mAb الهدف في استخراج مصنع الخام وتم تحسين العازلة elution لاسترداد mAb عالية، نشاط المنتج والاستقرار الراتنج تقارب. ويمكن بسهولة تكييف هذه الطريقة مع الأجسام المضادة الأخرى مع epitopes الخطية. الراتنجات الجديدة تسمح ظروف الإلتواء ألطف من البروتين A ويمكن أيضا أن تقلل من تكاليف خطوة التقاط الأولي لإنتاج mAb.

Introduction

المنتجات الصيدلانية الحيوية مهمة لعلاج مجموعة واسعة من الأمراض في كل فرع تقريبا من فروع الطب¹. الأجسام المضادة أحادية النسيلة (mAbs) تهيمن على سوق الأدوية الحيوية، مع المبيعات في جميع أنحاء العالم من المتوقع أن تصل إلى ما يقرب من 110 مليار يورو في عام 2020². منصة التعبير المفضلة لmAbs هي خطوط الخلايا المبيض الهامستر الصينية، والتي تنتج عادة titers mAb عالية تصل إلى 10 g∙L^-1 في ثقافة supernatant^3،4. ومع ذلك، فإن إنتاج mAbs في الثقافات الخلايا الثدييات مكلفة بسبب ارتفاع تكلفةالمتوسطة والحاجة إلى التخمير المعقمة 5. منصات التعبير البديلة مثل النباتات يحتمل أن تقدم نهجا أسرع وأبسط وأقل تكلفة وأكثر قابلية للتطوير للتصنيع الصناعي^6،7.

بالإضافة إلى التكاليف المرتبطة بثقافات الخلايا الثدييات، والاستخدام الواسع النطاق للبروتين A الكروماتوغرافيا تقارب لالتقاط المنتج هو محرك تكلفة رئيسية للإنتاج الصناعي من mAbs. البروتين A موجود بشكل طبيعي على سطح الخلايا المكورات العنقودية وربطت بجزء من التبلور (Fc) المنطقة من بعض المورين والأجسام المضادة البشرية، وبالتالي بمثابة آلية دفاعية للتهرب من الجهاز المناعي الفكاهي⁸. البروتين A أصبح معيار الذهب الصناعة لالتقاط mAbs من supernatants ثقافة الخلية ويستخدم أيضا على نطاق واسع من قبل مجتمع البحوث لأنه انتقائي للغاية، وعادة ما تحقق نقاء mAb من ~ 95٪ في خطوة واحدة⁸. ومن غير المستغرب أن مبيعات البروتين A على مدى العقدين الماضيين قد عكست بشكل وثيق مبيعات mAbs⁸. اعتمادا على مقياس الإنتاج، وتكاليف البروتين A يمكن أن تتوافق مع أكثر من 25٪ من إجمالي تكاليف العملية وبالتالي تؤثر على سعر السوق من mAbs العلاجية، والتي يمكن أن تصل إلى 2000 غرام^-15،⁹. ولذلك، فإن راتنجات الكروماتوغرافيا البديلة مع أداء تنقية مماثل لديها القدرة على خفض تكاليف الإنتاج إلى حد كبير، مما يجعل العلاجات المستندة إلى الأجسام المضادة في متناول عدد أكبر من المرضى^{10،11 ،12}. هذه البدائل قد تتحايل أيضا على مساوئ البروتين A اللونية، بما في ذلك ظروف الإلتواء القاسية عند درجة الحموضة المنخفضة (عادة <3.5) التي يمكن أن تسبب mAbs للخضوع لتغيرات مطابقة تعزز التجميع¹³ . الأهم من ذلك، البروتين A هو انتقائي فقط لمنطقة Fc من بعض الفئات الفرعية IgG، لذلك الجزيئات غير وظيفية مع نطاقات ملزمة مقتطعة قد تشارك في تنقية مع المنتج سليمة^5،في حين أن مشتقات mAb مثل شظايا متغير سلسلة واحدة لا تربط البروتين A على الإطلاق.

هنا، ونحن نصف الراتنج الكروماتوغرافيا تقارب بديل لالتقاط mAb 2F5 تحييد فيروس نقص المناعة البشرية باستخدام الكتابة الخطية ELDKWA (حرف واحد رمز الأحماض الأمينية)^5،14. نحن وراثيا تنصهر الظهارة 2F5 إلى C-محطة من البروتين الفلورسنت DsRed، الذي كان يعمل كناقل وجزيء مراسل، وأنتجت البروتين الناتج DsRed-2F5-Epitope (DFE) في التبغ المعدل وراثيا ( نيكوتيانا تاباكوم) النباتات. تم تنقية DFE من قبل خطوة واحدة شلت المعادن أيون تقارب اللونية (IMAC). تم تحقيق تجميد الرباط التقارب DFE النقي على راتنج أجاروز عبر مرتبطة عن طريق اقتران الكيميائية باستخدام N-هيدروكسيسوتشينيميد (NHS) تنشيط عبر الأعمدة agarose. ثم استخدمت التصاميم التجريبية الإحصائية لتحسين إجراء التعطيل واقتران الكفاءة¹⁵. تم تقييم استراتيجية تنقية mAb 2F5 من حيث نقاء الأجسام المضادة، والغلة والاستقرار في الأربطة. على النقيض من البروتين A، الذي يربط منطقة Fc، DFE ملزمة منطقة تحديد التكامل من 2F5، وضمان تنقية الجزيئات مع paratope سليمة. مفهومنا يمكن بسهولة تكييفها مع أي mAb مع epitope خطي أو غيرها من الأربطة التقارب القائم على الببتيد التي يمكن تحديدها بسهولة من قبل الدراسات microarray¹⁶.

الشكل 1: مخطط تدفق العمليات لإعداد راتنجات تقارب الظهارة التي يمكن استخدامها لالتقاط mAbs من مستخلصات النباتات الخام أو المنائج ثقافة الخلية. (أ) تم التعبير عن تقارب الرباط DFE في مصانع التبغ المعدلة وراثيا. تم تضمين خطوة هطول الأمطار الحرارية (B) قبل أن يتم تجانس الأوراق المقطوعة (C). (D) تم توضيح استخراج النبات الخام عن طريق الترشيح كيس، والترشيح عمق و0.2 م الترشيح المعقمة. (E) ثم تم تنقية DFE من قبل IMAC. (واو،ز) تم تعطيل ربط تقارب DFE المنقى على أعمدة أغاروز المرتبطة بـ EDC/NHS. (H) استخدمت الثقافات البكتيرية التي تحمل T-DNA ترميز الأجسام المضادة 2F5 للتعبير العابر في النباتات N. بنتهامايانا (I) نمت في phytotron. (ي) تم حصاد أوراق ن. بنتامايانا ومعالجتها كما هو موضح في D. (K) تم تنقية mAb 2F5 من استخراج أوضح باستخدام أعمدة تقارب DFE(L). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Protocol

1. زراعة نباتات التبغ المعدلة وراثيا

ملاحظة: يتم وصف تصميم بروتين الانصهار DFE وتوليد النباتات المعدلة وراثيا في مكان آخر^5،17.

1. إنبات شتلات التبغ المعدلة وراثيا في التربة. ري النباتات مع 1.0 غرام · L^-1 حل الأسمدة. نقل النباتات إلى واحد، 100 مم × 100 مم × 60 مم (الطول والعرض والارتفاع) الأواني عندما تنمو إلى قطر ~ 0.04 م.
2. زراعة نباتات التبغ المعدلة وراثيا في الدفيئة مع فترة ضوئية 16 ساعة (25/22 درجة مئوية ضوء / نظام درجة الحرارة المظلمة)، مع الرطوبة النسبية 70٪ والإخصاب الآلي مع 1.0 غرام · L^-1 حل الأسمدة لمدة 15 دقيقة كل ساعة.
3. بعد 7 أسابيع، حصاد جميع الأوراق باستثناء أوراق cotyledon الأربعة في قاعدة الجذعية النباتية. قم بمعالجة الأوراق المقطوعة على الفور على النحو الموضح أدناه.

2. هطول الأمطار الحرارة من بروتينات الخلية المضيفة

1. إعداد حمام مائي مع حجم العمل 20 L في وعاء ساخنة الفولاذ المقاوم للصدأ (0.3 م × 0.3 م × 0.3 م). في البداية، وضع مضخة مغناطيسية في حمام المياه لإثارة السائل بشكل دائم مع تدفق 5 L دقيقة^-1. قم بتركيب ترموستات قابل للتعديل على حمام الماء للتحكم في درجة الحرارة (الخطوتان 2.4 و2.8).
   تحذير: جميع الخطوات التالية تصل إلى 2.10 تنطوي على التعامل مع السائل الساخن. ارتداء معدات الحماية الشخصية المناسبة بما في ذلك قفازات معزولة حراريا ونظارات واقية.
2. أضف 15 لترًا من الماء منزوع الأيونات إلى حمام الماء وسخن السائل إلى 70 درجة مئوية.
3. ضع دلو 10 لتر مملوء بـ 5 لتر من الماء منزوع الأيونات على النمام المغناطيسي. إضافة فوسفات الصوديوم إلى تركيز نهائي من 120 MM. ضبط الحموضة إلى 8.14 باستخدام 10 M حمض الهيدروكلوريك. عندما تذوب جميع المكونات، أضف المخزن المؤقت المركز الناتج (5 لتر) إلى حمام الماء من الخطوة 2.2.
4. تحريك حمام الماء حتى تصل درجة الحرارة إلى 70 درجة مئوية. استخدام حمض الهيدروكلوريك 10 M لضبط الحموضة إلى 8.14 إذا لزم الأمر. مواصلة التحريض لمدة 15 دقيقة على الأقل بعد الوصول إلى درجة الحرارة المطلوبة ودرجة الحموضة لضمان أن التجمع بأكمله في التوازن الحراري.
5. إعداد دلو 20 لتر (0.3 م × 0.3 م × 0.3 م) مليئة بالماء منزوع الأيونات عند درجة حرارة ~ 17 درجة مئوية (مطلوب للخطوة 2.9).
6. إعداد 400 غرام aliquots من أوراق التبغ المقطوع من الخطوة 1.3. ضع aliquot واحد في سلة مثقبة (0.2 م × 0.2 م × 0.2 م؛ عرض المسام على الأقل 0.02 م × 0.02 م). تجنب ملء السلة بالمواد النباتية أو تعبئة الأوراق بإحكام شديد لتجنب إتلاف الأنسجة.
7. غمر السلة بالكامل في المخزن المؤقت الساخن من الخطوة 2.4 وتأكد من أن جميع الأوراق تبقى تحت السطح السائل. استخدام ملعقة سيليكون ثيرمتا إلى عقد الأوراق تحت السطح إذا لزم الأمر.
8. حضانة أوراق التبغ لمدة 1.5 دقيقة في السائل الغسل في حين أن المضخة لا تزال تثير السائل. مراقبة درجة حرارة السائل خلال فترة الحضانة بأكملها. تجنب سد مدخل المضخة مع أوراق التبغ.
9. إزالة سلة أوراق التبغ من المخزن المؤقت واستنزاف العازلة المتبقية من الأوراق لمدة 30 ق. نقل السلة إلى دلو مليئة بالماء البارد (من الخطوة 2.5) وتزج الأوراق لمدة 30 ق. إزالة سلة واستنزاف المياه المتبقية من le aves لمدة 30 ق قبل التجانس (الخطوة 3).
10. كرر الخطوات من 2.6 إلى 2.9 مع aliquots الطازجة من 2.6 حتى تتم معالجة الكتلة الحيوية المقطوعة بالكامل. مراقبة باستمرار وضبط درجة الحموضة ودرجة حرارة العازلة ابيضاض في حمام المياه.
    ملاحظة: يمكن تخزين المواد النباتية المقشرة على الجليد لمدة تصل إلى 30 دقيقة عندما تكون هناك حاجة إلى عدة دورات ابيضاض لمعالجة الكتلة الحيوية بأكملها. كما يمكن تخزين الأوراق المقشرة في أكياس مختومة بالفراغ عند درجة حرارة 80 درجة مئوية لمدة 3 أسابيع على الأقل. ومع ذلك، يوصى بالمعالجة الفورية لأن التخزين المطول يمكن أن يقلل من عائد DFE.

3. استخراج البروتين وتوضيحه

تحذير: تتضمن الخطوات التالية خلاط مع شفرات دوارة. لا تعمل في وعاء الخلاط عند تشغيل أو تركيبها على وحدة المحرك.

1. وضع 150 غرام (كتلة الرطب) من أوراق التبغ المقشرة (الخطوة 2.9) في وعاء خلاط وإضافة 450 مل من العازلة استخراج (50 مل فوسفات الصوديوم، 500 مل كلوريد الصوديوم، 10 مل ديسولفيت الصوديوم، درجة الحموضة 7.5). أغلق غطاء الخلاط بإحكام لمنع تسرب المواد النباتية أو المخزن المؤقت.
2. تجانس الأوراق لمدة 3X لمدة 30 ثانية، مع فواصل 30 ثانية بين كل نبضة. تأكد من أن جميع الأوراق متجانسة وأن لا أحد التمسك الجزء العلوي من وعاء خلاط. إذا لزم الأمر، فتح الخلاط خلال فواصل ودفع أسفل الأوراق التي عصا في الجزء العلوي من السفينة، وذلك باستخدام ملعقة سيليكون نظيفة.
3. بعد التجانس، خذ عينة 1.0 مل من التجانس للتحليل اللاحق (الخطوة 7).
4. جمع التجانس في وعاء من حجم كاف (على سبيل المثال إذا كان العمل مع الكتلة الحيوية الإجمالية من 1.0 كجم، واستخدام سفينة بسعة لا تقل عن 5 لتر). كرر الخطوات من 3.1 إلى 3.3 حتى يتم تجانس كافة الكتلة الحيوية المقشرة.
5. قم بتركيب فلتر كيس في حامل فلتر ووضع وعاء آخر بحجم مناسب (انظر 3.4) أسفل التجميع. تطبيق التجانس على مرشح كيس بمعدل ~ 0.15 L دقيقة^-1. أخذ عينات من filtrate كيس بعد كل لتر للتحليل اللاحقة (الخطوة 7) وقياس عكر تجمع filtrate حقيبة كما تخفيف 1:10 في العازلة استخراج باستخدام مقياس العكر أو جهاز مماثل.
6. مزيد من التوضيح تجمع filtrate حقيبة باستخدام 0.02 م² من K700 (أعلى) وKS50 (أسفل) عمق مرشح طبقة الجمع لكل لتر من تجمع كيس filtrate. تطبيق معدل تدفق من 3.0 لتر دقيقة^-1·m^-2 تصل إلى أقصى ضغط من 0.2 MPa. ثم إزالة الجسيمات المتبقية عن طريق تمرير filtrate أوضح من خلال مرشح معقمة 0.2 م كما هو موضح سابقا⁵.

4. تنقية من DFE التقارب Ligand

1. إعداد نظام الكروماتوغرافيا السائل ة البروتين السريع عن طريق التنظيف مع عازلة الإلوتيون (10 مل فوسفات الصوديوم، 300 مليون متر إيميدازول، PH 7.4)، العازلة غسل (10 مليون متر فوسفات الصوديوم، والحموضة 7.4) والعازلة الاعتدال (20 مليون متر فوسفات الصوديوم، 500 مل كلوريد الصوديوم، PH 7.4). جبل عمود يحتوي على ~ 50 مل من الراتنج الأجاروز عبر المرتبطة مخلب لكل كيلوغرام من الكتلة الحيوية ورقة (~ 2.5 لتر عمق filtrate).
2. شحن العمود مع أيونات النيكل عن طريق تطبيق 5 أحجام العمود (السيرة الذاتية) من 200 مل محلول كبريتات النيكل وغسله مع 5 السيرة الذاتية من العازلة elution. استخدام معدل تدفق من 50 سم ح^-1 ورصد إشارات الأشعة فوق البنفسجية في 260، 280 و 558 نانومتر لجميع الخطوات الكروماتوغرافيا اللاحقة.
3. معادلة العمود مع 10 السيرة الذاتية للمخزن المؤقت للتوازن. ثم تحميل 50 السيرة الذاتية من استخراج النبات أوضح (من الخطوة 3.6) على العمود مشروط.
4. اغسل العمود بـ 10 السيرة الذاتية للمخزن الاحتياطي للغسيل. Elute البروتين الانصهار DFE مع 5 السيرة الذاتية elution العازلة وجمع الكسر التي تحتوي على المنتج مرة واحدة في إشارات الأشعة فوق البنفسجية في 280 نانومتر و 558 نانومتر قد زادت إلى أكثر من 5 مليون أودو فوق خط الأساس.
5. أخذ عينة قدرها 0.2 مل من كسر الإلوتيون من أجل قياس تركيز البروتين القابل للذوبان الكلي (ملعقة صغيرة) (الخطوة 7.1)، تركيز DFE (الخطوتين 7.2 و7.3)، ونقاء DFE (الخطوة 7.4).
6. قم بتركيب عمود يحتوي على حوالي 50 مل من راتنج الديإكسترون المرتبط عبر الموجات فوق نظام كروماتوغرافيا. معادلة العمود مع 5 السيرة الذاتية من اقتران العازلة (200 MM HEPES، 500 مل كلوريد الصوديوم، درجة الحموضة 8.5). حقن 10 مل من كسر elution DFE (الخطوة 4.4) لتبادل العازلة ورصد امتصاص الأشعة فوق البنفسجية في 280 و 558 نانومتر.
7. جمع الكسر التي تحتوي على DFE مرة واحدة في إشارات الأشعة فوق البنفسجية في 280 نانومتر و 558 نانومتر قد زادت إلى أكثر من 5 موالا فوق خط الأساس. أخذ عينة 0.2 مل وتحديد تركيز TSP، تركيز DFE، ونقاء DFE (الخطوة 7).
8. ركز عينة DFE النقية (من الخطوة 4.7) إلى 15 غرام L^-1 باستخدام أنبوب تركيز الطرد المركزي في 3000 × ز عند 4 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة في جهاز طرد مركزي. متابعة مع رد فعل اقتران (الخطوة 5).
   ملاحظة: تخزين الحل DFE في 4 درجة مئوية إذا كان لا يمكن تنفيذ خطوات التركيز أو اقتران على الفور.

5. اقتران DFE إلى تنشيط عبر مرتبطة الراتنج أجاروز

ملاحظة: لا تحل محل isopropanol المستخدمة لتخزين الأعمدة التي تعمل NHS حتى تكون جميع المعدات والحلول لاقتران جاهزة. لا تدع الأعمدة تجف أبداً.

1. إعداد نموذج تصميم التجارب (DoE) لتحسين اقتران DFE بالراتنج المنشط، مع درجة الحموضة، وتكوين المخزن المؤقت، وتركيز DFE كعوامل. يتم وصف تفاصيل أسلوب DoE في مكان آخر¹⁵.
2. إعداد محلول الأربطة المتقاربة (من الخطوة 4.8) في نطاق تركيز يتراوح بين 0.5-15 غرام· L^-1 أو كما هو محدد في DoE وتخزينها على الجليد حتى رد فعل اقتران جاهزة (الخطوة 5.5). ملء ما لا يقل عن عشرة محاقن 2 مل مع الحل DFE وإعداد محول لتركيب المحاقن على NHS تنشيط عبر ربط أعمدة agarose مع حجم السرير من 1.0 مل.
3. لكل 10 أعمدة تستخدم لاقتران، وإعداد 30 مل من محلول التعطيل (0.5 M الإيثانولامين، 0.5 M كلوريد الصوديوم، درجة الحموضة 8.3)، 30 مل من محلول درجة الحموضة المنخفضة (0.1 م خلات الصوديوم، 0.5 M كلوريد الصوديوم، درجة الحموضة 4.0) و 10 مل من محلول التخزين (0.05 M فوسفات الصوديوم ، 0.1٪ (م / الخامس) أزيد الصوديوم، والحموضة 7.0).
4. إعداد 20 مل من حمض الهيدروكلوريك 1 مل في أنبوب واحتضانه على الجليد لمدة 20 دقيقة على الأقل.
5. افتح عمود agarose مختوم مُفعّل بـ NHS ويحمّل محول الحقنة في مدخل العمود. منع أي الهواء دخول العمود عن طريق تطبيق قطرة من المخزن المؤقت على مدخل المحول قبل توصيله إلى المحاقن.
6. اغسل العمود بـ 6 مل من حمض الهيدروكلوريك المثلج بنصف لتر 1 مل (من الخطوة 5.4) بمعدل تدفق قدره <1 مل دقيقة^-1 ثم انتقل على الفور إلى الخطوة 5.7.
7. حقن 1.5 مل من محلول DFE (الخطوة 5.2) باستخدام حقنة 2 مل بمعدل تدفق قدره <1 مل دقيقة^-1 وجمع كسر التدفق من خلال مقياس الدقة (الخطوة 5.4) للتحليل اللاحق (الخطوة 7). أغلق العمود في كلا الطرفين واحتضن لمدة 15-45 دقيقة عند 22 درجة مئوية، اعتمادا على إعداد وزارة المعدات.
8. حقن 6 مل من محلول التعطيل متبوعاً بـ 6 مل من محلول درجة الحموضة المنخفض بمعدل تدفق قدره <1 مل دقيقة^-1 لإزالة الأربطة غير المقيدة بشكل مشترك من الراتنج. ثم حقن 6 مل من حل التعطيل واحتضان العمود لمدة 15 دقيقة.
9. حقن 6 مل من محلول درجة الحموضة المنخفضة في العمود، متبوعاً بـ 6 مل من محلول التعطيل. ثم حقن آخر 6 مل من محلول درجة الحموضة المنخفضة في العمود.
10. حقن 2 مل من محلول التخزين في العمود وتخزينها في 4 درجة مئوية.

6. اختبار تنقية mAbs من مستخلصات النباتات أوضح

1. إعداد 100 مل من استخراج النبات واضحة تحتوي على 2F5⁵ أو supernatant من نظام التعبير القائم على الخلية المفضلة، والتي تحتوي أيضا على 2F5.
2. إعداد عازلة للتوازن (20 مليون متر من فوسفات الصوديوم، و500 مليون متر من كلوريد الصوديوم، ودرجة الحموضة 7.4)، وحاجز إيلوتيون منخفض الحموضة (0.05 مليون سيترات، 0.05 م كلوريد الصوديوم، ودرجة الحموضة 4.0-3.25)، وحاجز إلوتيون عالي القوة (1.0-4.0 M كلوريد المغنيسيوم، 0.1 م HEPES، pH 8.0)
3. مسح نظام الكروماتوغرافيا مع المخازن المؤقتة. قم بتحميل عمود تقارب DFE (من الخطوة 5.10) على نظام الكروماتوغرافيا ومعادل مع 5 السيرة الذاتية للمخزن الاحتياطي للتوازن بمعدل تدفق قدره 1.0 مل دقيقة^-1. مراقبة امتصاص الأشعة فوق البنفسجية في 280 نانومتر.
   ملاحظة: تحميل استخراج النبات أو خلية الثقافة supernatant على العمود يمكن أن يسبب زيادة في الضغط الخلفي. تعيين تنبيه الضغط العالي في 0.2 MPa لتجنب الأضرار التي لحقت نظام الكروماتوغرافيا أو عمود DFE.
4. تحميل 80 مل من استخراج النبات أوضح أو supernatant (الخطوة 6.1) على العمود بمعدل تدفق قدره 0.5 مل دقيقة^-1 لضمان وقت الاتصال من 2 دقيقة. تخزين عينات التدفق من خلال في 4 درجة مئوية إذا كان التحليل الفوري عينة غير ممكن.
5. اغسل العمود بـ 6 السيرة الذاتية للمخزن الاحتياطي للتوازن. جمع عينة من غسل في بداية ووسط ونهاية هذه الخطوة.
6. Elute mAb 2F5 مع 5 السيرة الذاتية من منخفض الحموضة الإلتصاق العازلة أو عالية الأيونية قوة الإلتثال العازلة (0.1 M HEPES، 1.25 M كلوريد المغنيسيوم، درجة الحموضة 8.0). جمع كسر DFE عندما زادت إشارة الأشعة فوق البنفسجية 280 نانومتر إلى 5 mAU فوق خط الأساس.
   1. تحسين المخزن المؤقت للإلتبيلة لكل زوج من الأجسام المضادة للepitope. بالنسبة لـ 2F5، حقق كلوريد المغنيسيوم 1.25 M توازنًا مثاليًا بين استرداد المنتج واستقرار الأربطة.
      ملاحظة: محلول كلوريد المغنيسيوم عرضة لهطول الأمطار. لذلك، حل كلوريد المغنيسيوم في ~ 700 مل من الماء. إذابة HEPES بشكل منفصل في 100 مل من الماء وضبط درجة الحموضة إلى 8.0. أضف محلول كلوريد المغنيسيوم المذاب إلى محلول HEPES وأضف الماء إلى الحجم النهائي من 1.0 لتر. لا تقم بضبط الحموضة بعد حل كلوريد المغنيسيوم لأن هذا سوف يسبب هطول الأمطار.
7. تحليل جميع العينات التي اتخذت خلال الخطوات 6.4-6.6 باستخدام طريقة برادفورد، وليثيوم دوديسيلسلفات بوليأكريلاميد هلام الكهربائي (LDS-PAGE) وصدى بلازمون السطح (SPR) مطيافية (الخطوة 7).

7. تحليل العينات

1. قياس تركيز TSP باستخدام طريقة برادفورد^18،19.
   1. في ثلاثة أضعاف، ماصة 2.5 ميكرولتر من كل عينة في بئر واحد من لوحة 96 جيدا. استخدام ثمانية معايير الزلال المصل البقري (BSA) في ثلاثة أضعاف تغطي نطاق 0-2000 ملغ · ^L-1.
   2. إضافة 200 درجة مئوية من الكاشف برادفورد إلى كل بئر ومزيج من قبل الأنابيب بلطف صعودا وهبوطا. الحفاظ على مستوى الماصات لتجنب تشكيل الفقاعات التي تشوه القراءة اللاحقة.
   3. احتضان لوحة لمدة 10 دقيقة في 22 درجة مئوية وقياس امتصاص في 595 نانومتر في مقياس الطيف الضوئي. حساب تركيز TSP في العينات استناداً إلى منحنى قياسي من خلال النقاط المرجعية BSA.
2. قياس DFE عن طريق قياس الفلورة
   1. في ثلاثة أضعاف، ماصة 50 درجة مئوية من كل عينة في آبار واحدة من لوحة سوداء 96 جيدا نصف منطقة. تشمل ستة معايير DsRed تغطي نطاق 0-225 ملغ · ^L-1.
   2. قياس الفلورة مرتين باستخدام 530 ± 30 نانومتر مرشح الإثارة و 590 ± 35 نانومتر مرشح الانبعاثات في مقياس الطيف. حساب تركيز DFE في العينات استناداً إلى منحنى قياسي من خلال النقاط المرجعية DsRed.
3. قياس تركيز 2F5 بواسطة التحليل الطيفي SPR^20.
   1. إعداد المخزن الاحتياطي تشغيل HBS-EP (10 m4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic Acid (HEPES), 3 m ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), 150 mM كلوريد الصوديوم, 0.005% v/v توين-20, p H 7.4) وتصفية تعقيمه من خلال تمريره من خلال فراغ 0.2 ميكرومتر زجاجة أعلى مرشح. Degas العازلة لمدة 15 دقيقة.
   2. قم بتوصيل المخزن المؤقت لتشغيل HBS-EP بأداة SPR قبل إرساء رقاقة سطح dextran carboxymethylated ومعادلة النظام باستخدام الوظيفة الرئيسية. بدء تشغيل يدوي مع معدل تدفق 30 ميكرولتر دقيقة^-1 وشرط سطح رقاقة عن طريق حقن بالتناوب 30 مل حمض الهيدروكلوريك و هيدروكسيد الصوديوم 25 M (حقنتين لكل منهما) على خلايا التدفق 1 و 2 بمعدل تدفق 30 ميكرولتر دقيقة^-1 لمدة 1 دقيقة.
   3. إعداد 300 درجة مئوية من 500 ملغ · L^-1 بروتين حل في خلات الصوديوم 10 MM (درجة الحموضة 4.0). قنينات الذوبان التي تحتوي على 0.4 م 1-إيثيل-3-(3-ثنائي ميثيل أمينوبروبيل) هيدروديميد هيدروكلوريد (EDC) و 0.1 M NHS والطرد المركزي في 16,000 × غرام لمدة دقيقة واحدة قبل خلط 70 ميكرولتر من EDC و 70 ميكرولتر من NHS.
   4. نقل خليط EDC / NHS والبروتين A الحل إلى 7 مم قارورة عينة بلاستيكية ووضعها في رف العينة. قم بتنشيط سطح رقاقة dextran من كاربوكسيميثيلاتيد عن طريق حقن خليط EDC/NHS على خلايا التدفق 1 و 2 بمعدل تدفق قدره 10 ميكرولتر^{دقيقة -1} لمدة 10 دقائق.
   5. الزوجين البروتين A إلى سطح dextran carboxymethylated المنشط عن طريق حقن البروتين حل على خلية التدفق 2 بمعدل تدفق 15 ميكرولتر^{دقيقة -1} لمدة 15 دقيقة.
   6. أثناء اقتران البروتين A، إذابة قارورة من 1.0 M إيثانولامين هيدروكلوريد (درجة الحموضة 8.5) والطرد المركزي في 16،000 × ز لمدة دقيقة واحدة. نقل 150 ميكرولتر إلى قارورة بلاستيكية 7 مم ومكان في الصك. عند اكتمال الخطوة 7.3.5، قم بإلغاء تنشيط سطح الرقاقة عن طريق حقن محلول الإيثانولامين على خلايا التدفق 1 و2 بمعدل تدفق قدره 10 ميكرولتر^{دقيقة -1} لمدة 7 دقائق.
   7. حالة سطح رقاقة عن طريق حقن بالتناوب 30 مل حمض الهيدروكلوريك و هيدروكسيد الصوديوم 25 M (حقنتين لكل منهما) على خلايا التدفق 1 و 2 بمعدل تدفق 30 ميكرولتر دقيقة^-1 لمدة 0.5 دقيقة.
   8. إعداد معايير الأجسام المضادة 2F5 في المخزن الاحتياطي تشغيل HBS-EP بتركيز 500 درجة مئوية · L^-1 وعينات مخففة تحتوي على 2F5 في HBS-EP إلى تركيز نهائي في نطاق 20-1000 ميكروغرام· ^L-1. حقن العينات والمعايير على خلايا التدفق 1 و 2 بمعدل تدفق 30 ميكرولتر دقيقة^-1 لمدة 3 دقائق.
   9. طرح إشارة الوحدات النسبية (RU) لخلية التدفق 1 (الخلية المرجعية) من إشارة خلية التدفق 2 (خلية القياس) لكل عينة وحساب تركيز الأجسام المضادة استناداً إلى إشارة RU من الحقن القياسية 2F5.
   10. بعد كل عينة أو حقن القياسية، وتجديد سطح رقاقة عن طريق حقن حمض الهيدروكلوريك 30 مل بمعدل تدفق 30 ميكرولتر دقيقة^-1 لمدة 0.5 دقيقة على خلايا التدفق 1 و 2.
   11. رسم تركيز 2F5 لكل عينة تدفق من خلال من الخطوة 6.4 ضد تدفق من خلال حجم للحصول على منحنى اختراق 2F5. حساب كمية حقن 2F5 عندما تم التوصل إلى 10٪ من تركيز التحميل 2F5 للحصول على قدرة الربط الديناميكي 10٪ (DBC).
4. تحليل عينات البروتين من قبل LDS-PAGE.
   1. افتح جل بوليأكريلاميد BisTris LDS جاهز الاستخدام 4-12% وضعه في وحدة الكهربائي. نقل 800 مل من المخزن المؤقت قيد التشغيل (50 مل MES، 50 mM Tris base، 0.1٪ (م / الخامس) SDS، 1 MM EDTA، pH 7.3) في وحدة وإضافة 0.5 مل من محلول مضاد للأكسدة.
   2. في أنبوب رد فعل 1.5 مل، مزيج 10 ميكرولتر من المخزن المؤقت التحميل مع 4 ميكرولتر من عامل الحد و 26 ميكرولتر من عينة البروتين. احتضان الأنبوب في كتلة الحرارة لمدة 10 دقائق في 80 درجة مئوية. الطرد المركزي الأنبوب في 500 × ز لمدة 30 ث.
   3. قم بتحميل جل البولي أكريلاميد LDS (10 ميكرولتر من العينة لكل حارة) وتحميل 5 ميكرولتر من معيار البروتين الملطخ مسبقًا (10-180 كيلوداً) في ممر منفصل.
   4. أغلق غرفة الكهربائي وقم بتوصيل مصدر الطاقة. وينبغي تشغيل الكهربائي لمدة 40 دقيقة وثابت 200 V.
   5. إزالة هلام من غرفة الكهربائي. فتح تغليف هلام وغسل هلام لمدة 15 دقيقة في الماء على شاكر في 19 دورة في الدقيقة. وصمة عار هلام لمدة 1 ساعة في حل تلطيخ على شاكر في 19 دورة في الدقيقة.
   6. Destain هلام لمدة 1 ساعة في الماء على شاكر في 19 دورة في الدقيقة. امسح الجل ضوئيًا باستخدام ماسح ضوئي للأفلام.

Results

التعبير وتنقية الرباط التقارب

تم التعبير عن البروتين الانصهار DFE في نباتات التبغ المعدلة وراثيا نمت في الدفيئة. وكان العائد ~ 120 mg·kg^-1 كتلة ورقة مع متوسط الكتلة الحيوية من ~ 130 غرام لكل مصنع. وكان نقاء DFE <5% من ملعقة صغيرة في مستخلصات النباتات الخام قبل الغسل ولكن زادت إلى ~ 40٪ بعد المعالجة الحرارية في 70 درجة مئوية لمدة 1.5 دقيقة، والتي عجلت > 97٪ من بروتينات الخلية المضيفة. تم دمج خطوة الغسل بسهولة في روتين الحصاد والاستخراج (الشكل1) واستغرق أقل من 2 ساعة من الوقت الإضافي، بما في ذلك إعداد حمام المياه. وكان الانتعاش العام من DFE 23.5 ملغ كجم¹ مع نقاء > 90٪. وكانت الخطوات المسؤولة عن فقدان المنتج هي الغسل، والترشيح العمق، وIMAC، مع خسائر محددة من 40٪ و 27٪ و 45٪، على التوالي. كان عمق مرشح قدرة في المتوسط 135 ± 36 L م^-2 (± SD، n = 3) وبالتالي في النطاق العلوي من القيم المبلغ عنها في الأدب²¹. زيادة غلة DFEمع عمر النبات (الشكل 2).

تعطيل الرباط التقارب على أعمدة الكروماتوغرافيا التي تنشطها دائرة الصحة الوطنية

خلال اختبارات الاقتران الأولية، وجدنا أن المخزن المؤقت HEPES (درجة الحموضة 8.3) زيادة كفاءة اقتران إلى 89 ± 6٪ (± SD، n = 3) مقارنة مع 78 ± 9٪ (± SD، n = 3) للحاجز بيكربونات الموصى بها من قبل الشركة المصنعة. ولذلك، تم استخدام HEPES لجميع تجارب الاقتران اللاحقة. تم اختيار نهج وزارة الطاقة لتحسين كفاءة اقتران DFE إلى راتنج الآغاروز المرتبط بـ NHS. ازدادت الكمية المطلقة من DFE المعطلة على الراتنج مع كتلة DFE حقن في العمود واستقرت في ~ 15 غرام · L^-1 في حين انخفض العائد اقتران باستمرار كماتم حقن المزيد من DFE (الشكل 2). وكان العائد اقتران أيضا > 50٪ أقل في المخزن المؤقت الحمضية، مما يدل على الحاجة إلى فحص لظروف اقتران مناسبة لكل ligand على أساس كل حالة على حدة. تم تحديد الظروف المثالية من حيث العائد اقتران، والكمية المطلقة من DFE المعطلة وتكاليف العمود باستخدام أداة التحسين العددي لبرنامج DoE. وكانت أكثر الظروف استصواباً (درجة الحموضة 9.0 و7.0 ملغم من DFE لكل 1 مل من راتنج الأجاروز المترابط) موجودة على هضبة كبيرة وبالتالي كانت قوية. الجزيئات DFE الاحتفاظ الفلورة الحمراء حتى بعد اقتران، وكثافة اللون تتوافق معالكمية الإجمالية من DFE المعطلة (الشكل 2). لذلك، يمكن استخدام لون العمود كمعلمة مراقبة جودة بسيطة لتقدير كفاءة الاقتران وجودة العمود. وأكد الفلورة أيضا أن DFE البروتين الانصهار تجميعها في حالة رباعية من DsRed الأصلي.

الشكل 2: تحسين تجميد DFE إلى راتنج الأجاروز المرتبط بـ NHS. (A) LDS-PAA هلام مع تراكب وصمة عار الغربية من عينات التجانس وelution من مقتطفات مصنع DFE المعدلة وراثيا unblanched وبلانش. تم حصاد النباتات بعد 38 أو 45 أو 52 يوما من البذر. تم تنفيذ البقع الغربية باستخدام المضادة له₆-الأجسام المضادة⁵. (B) المبلغ الإجمالي للربط تقارب DFE المقترنة في الاعتماد إذا اقتران درجة الحموضة والكتلة الإجمالية من DFE تنقية حقن على NHS تنشيط عبر ربط أعمدة agarose. تشير النقاط الحمراء إلى التجارب الفعلية التي أجريت لإنشاء نموذج سطح الاستجابة. (C) أعمدة تقارب DFE بعد إجراء الاقتران. الأرقام تتوافق مع شروط اقتران أبرز في لوحة B. dps = أيام بعد البذر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

اختبار العزلة 2F5 باستخدام الراتنج تقارب DFE

تم إنتاج الأجسام المضادة المؤتلف 2F5 بشكل عابر في نباتات نيكوتيانا بنتاميانا المزروعة في فيتوترون⁵. تم اختبار التقاط 2F5 من استخراج النبات الخام باستخدام أعمدة تقارب إلى جانب ~ 7.0 ملغ DFE تنقية (الخطوة 6). الإلواء من راتنجات البروتين A عادة ما ينطوي على العازلة الحمضية (درجة الحموضة ~ 3.3)¹³. لذلك، قمنا في البداية بتقييم مختلف المخازن المؤقتة للانخفاض في درجة الحموضة (pH 6.0-3.25) لأعمدة DFE. وقد نجح الإنعلاث من 2F5 في قيم درجة الحموضة أقل من 4.5 مع أعلى انتعاش من ~ 35٪ في درجة الحموضة 3.25. ومع ذلك، فإن انخفاض درجة الحموضة تعطيل كل من الأجسام المضادة (كما أكد ذلك قياس الطيف SPR) وLigand DFE (كما هو مبين في فقدان اللون وانخفاض DBC، الشكل3). وكان من المتوقع أن هذا الأخير نظرا لأن التشوهات DsRed الأصلي في درجة الحموضة <4.0^22,23. لتجنب المنتج وdenaturation ligand، اختبرنا كلوريد المغنيسيوم كعامل الإلتاءب البديل لأنه قد تم استخدامه سابقا لelute mAbs من راتنجات التقارب الأخرى^24. وكان تركيز كلوريد المغنيسيوم من 1.25 M كافية لelute 2F5 من الراتنج تقارب DFE مع استرداد 105 ± 11٪ (± SD، ن = 3) ونقاء 97 ± 3٪ (± SD، ن = 3). وكان هذا الأداء مماثلة للبروتين A الراتنجات^25،26. وكان ثابت تفكك التوازن(K D) من DFE تنقية 2F5 الأجسام المضادة وFuzeon ligand الاصطناعية 791 pM في حين أن من البروتين A-تنقية النظير كان 763 PM⁵. وعلاوة على ذلك، لم يلاحظ فقدان كبير للألوان في الراتنج على مدى ما مجموعه 25 دورة ربط وelute. انخفض DBC من الراتنج تقارب DFE في 10٪ 2F5 اختراق خطيا على مدى 25 دوراتإلى ~ 15٪ من القيمة الأولية (الشكل 3).

الشكل 3: اختبار عزل 2F5 من المستخلصات النباتية الواضحة باستخدام راتنجات DFE المتقاربة. (أ) راتنجات تقارب DFE بعد دورة واحدة من الإلتاءب باستخدام المخازن المؤقتة ذات قيم الحموضة المختلفة في النطاق 4.0-3.0 ونفس الراتنجات بعد خطوة تحييد عند درجة الحموضة 6.0. (B) راتنجات تقارب DFE بعد دورة واحدة وست دورات من تنقية 2F5 باستخدام 1.25 M أو 4.00 M كلوريد المغنيسيوم كما eluent. (C) كروماتوغرام من تجارب التحميل الأمامي (منحنيات كسر من خلال) لتحديد القدرة ملزمة ديناميكية تعتمد على دورة من الراتنج DFE باستخدام كلوريد المغنيسيوم كما eluent. تم قياس منحنيات كسر من خلال ل4.0 M و 1.25 M المخازن العازلة كلوريد المغنيسيوم elution وأرقام دورة مختلفة. (D) القدرة الملزمة الديناميكية المعتمدة على الدورة من DFE باستخدام كلوريد المغنيسيوم 1.25 M كما eluent. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Discussion

تطبيقات من الرواية تقارب راتينج

لقد أظهرنا أن راتنجات الكروماتوغرافيا المتقاربة المخصصة لالتقاط mAbs يمكن تصنيعها عن طريق تعطيل الرباط الذي يحتوي على epitope خاص بـ mAb إلى agarose عبر المرتبطة بـ NHS. لتصميم مثل هذا الراتنج، كان من الضروري معرفة تسلسل الظهارة واستخدام epitope خطي. الراتنجات الناتجة مفيدة لالتقاط mAbs لأنها يمكن أن تحل محل مكلفة البروتين A خطوات الكروماتوغرافيا تقارب. التفاعل بين 2F5 و DFE في دراسة الحالة لدينا تم التوسط من قبل النعت الربية-paratope ملزمة، لذلك يجب أن يكون لدينا ligand أكثر انتقائية من البروتين A، الذي يربط إلى منطقة Fc من معظم المورين وIgGs الإنسان. لأن هناك حاجة إلى الأربطة الفردية لكل mAb، قد تبدو طريقتنا في البداية مناسبة أساسا للأجسام المضادة التي يتم إنتاجها على نطاق واسع جدا. ومع ذلك، من خلال الجمع بين نهجنا مع التعبير السريع البروتين العابر القائم على النبات، يمكن إعداد الأربطة تقارب جديدة في أقل من 2 أسابيع²⁷ مع الحد الأدنى من الجهد²⁸. وبالتالي، فإن الطريقة هي أيضا مناسبة لتنقية mAb على نطاق صغير.

الإنتاج والتحسينات المحتملة للربط التقارب

النباتات تقدم منصة إنتاج سريعة وآمنة للربط التقارب^5،29،30،مثل بروتين الانصهار DFE واردة في دراسة الحالة لدينا. وقلّل غسل المواد النباتية إلى حد كبير كمية بروتينات الخلايا المضيفة في خطوة واحدة، وتم دمجها بسهولة في روتين توضيح قياسي. ومع ذلك، كان استرداد ligand منخفضة في الإعداد الحالي، وربما يرجع ذلك إلى استقراره الحراري المعتدل وبعض غير محددة ملزمة لطبقات فلتر، كما ذكرت للمنتجات الأخرى^31،32،33. هندسة الناقل لزيادة استقراره الحراري قد يساعد بالتالي على تحسين غلة الرباط في المستقبل، كما هو موضح لمرشح لقاح الملاريا CCT، إنزيم مضاد للورم PpADI أو mesophilic β-glucosidase^{34، 35و36}. وينطبق الشيء نفسه على خطوة الترشيح العمق، حيث هندسة البروتين قد تساعد على الحد من غير محددة ملزمة لمادة فلتر³⁷. ويمكن أيضا خفض تكاليف الإنتاج لDFE وligands مماثلة عن طريق تحسين الكفاءة العامة للتوضيح باستخدام flocculants أو إضافات فلتر^38،39.

عندما يتم استخدام DsRed كناقل، فإنه يشكل مجمع رباعي. وهذا مفيد لأنه يزيد من عدد الepitopes لكل ligand، ولكنه قد يجعل أيضا الرباط أكثر عرضة للتفكيك أو denaturation أثناء الكروماتوغرافيا تقارب. بروتين الناقل الأحادي مثل mCherry قد يكون من الأفضل، لأنه مستقر عند درجة الحموضة منخفضة^40،وإدراج تكرار جنبا إلى جنب من epitope من شأنه أن يزيد من متعطشا للربط وبالتالي زيادة قدرة الراتنج^{5، 26 , 41}- وبالنسبة للبروتينات البسيطة التي تحمل الموجات الإنقلت (أي تلك التي ليس لها روابط ثنائيكبريتيد أو تعديلات ما بعد الترجمة) فإن نظم الإنتاج الميكروبية قد تقلل من تكاليف التصنيع وتجعل الأربطة أكثر قدرة على المنافسة مع البروتين ألف. على سبيل المثال، تم التعبير عن بروتين الفلورسنت الأخضر في الخلايا البكتيرية مع العائد من ~ 1 غرام · كجم^-1 الكتلة الحيوية، والتي من شأنها أن تقلل بشكل كبير من تكاليف إنتاج الأربطة⁴².

بغض النظر عن المضيف التعبير، كان مطلوبا ربط تقارب تنقية أثناء اقتران لتقليل تجميد بروتينات الخلية المضيفة أو مكونات وسائل الإعلام التي يمكن أن تقلل خلاف ذلك انتقائية الراتنج والقدرة. إدراج علامة بولي الهيستيدين لتنقية IMAC زيادة النقاء إلى ~ 90٪ في خطوةواحدة، وتسهيل إنتاج ligand سريع وغير مكلفة 5،^43،44. ومع ذلك، فإن موقف علامة الانصهار مهم لأنه لديه القدرة على إعاقة بشكل معقم ملزم الظهارية أو للحث على انشقاق إما العلامة أو epitope من الناقل^45،46.

تعطيل الرباط التقارب على أعمدة الكروماتوغرافيا التي تنشطها دائرة الصحة الوطنية

وقد تم التعطيل يدويا أو باستخدام نظام كروماتوغرافيا. ويبدو أن أحجام التخزين المؤقت الصغيرة لكل عمود تفضل المناولة اليدوية (على سبيل المثال، بسبب الحد الأدنى من أحجام النفايات). ومع ذلك، إذا كانت هناك حاجة إلى أعمدة متعددة/أكبر، فإن نظام الكروماتوغرافيا يجعل من السهل التحكم في ظروف الاقتران (مثل معدلات التدفق المنظمة) وبالتالي فمن الأرجح أن يحقق نتائج قابلة للاستنساخ من حيث DBC. تشير بياناتنا إلى أن المخزن المؤقت للاقتران ودرجة الحموضة لها تأثير هام على كفاءة الاقتران وتكاليف العمود الإجمالية. عوامل الفرز التي تؤثر على رد فعل اقتران وتعديلها لكل بروتين الناقل (أو حتى لكل الناقل ligand الانصهار) يمكن بالتالي تحسين كفاءة اقتران وأداء الراتنج، ونحن نوصي هذا النهج.

اختبار العزلة 2F5 باستخدام الراتنج تقارب DFE

إنتاج المنتج والنقاء هي جوانب هامة من أداء الراتنج، وفي حالة DFE حققنا العائد من 105 ± 11٪ (± SD، ن = 3) ونقاء 97 ± 3٪ (± SD، n = 3)، وهو ما يمكن مقارنته مع أداء الراتنجات البروتين A القياسية^{25 ،26}. مؤشر أداء رئيسي آخر للراتنجات بشكل عام (وخاصة بالنسبة لتلك التي تقوم على ربط اتّصال التقاربيّة) هو DBC عند 10% من المنتجات، لأن هذه المعلمة تؤثر على كمية الراتنج المطلوبة لعملية محددة وبالتالي التكاليف. ل ال [دف] [ليغد], كان ال [دبك] أوّليّة حوالي 4 [غ]· L^-1 الراتنج، وهو ~ 13٪ من القيمة المقابلة للبروتين A في ظل ظروف مماثلة (فقط 2 دقيقة وقت الاتصال)^25،47 ولكن حوالي 15 أضعاف أعلى بالمقارنة مع راتنجات التقارب مخصصة أخرى مثل المضادة للFSH المناعية ligand باستخدام نفس وقت الإقامة من 2 دقيقة⁴⁸. انخفض DBC من DFE إلى 15٪ من قيمة البداية بعد 25 دورات الربط وelute، في حين أن هناك حاجة إلى أكثر من 50 دورات لنفس الخسارة من DBC في الراتنجات البروتين A التجارية⁴⁹. ومع ذلك، من المهم أن نلاحظ أن الناقل لدينا لم يتم تحسينها حتى الآن إلى نفس المدى كما البروتين A، الذي تم التحقيق بشكل شامل وتحسينعلى مدى العقود الأربعة الماضية⁸.

حتى الآن قمنا بتحسين استقرار الراتنج واستعادة المنتج عن طريق التحول من العازلة انخفاض درجة الحموضة elution إلى تركيز عال من كلوريد المغنيسيوم (الشكل3)، كما أوصى في الدراسات السابقة¹³. اللون الأحمر المميز للربط تقارب لم تتلاشى إلى حد كبير خلال 25 دورات ربط وelute، لذلك نحن نتكهن بأن البروتياز النباتية الذاتية في استخراج النبات أوضح³¹ قد يكون اقتطاع وبالتالي تعطيل epitope من الليغاان. ولذلك، فإن تصميم الوصلات المقاومة للبروتياز لربط الناقل والظهارية قد يساعد على الحفاظ على DBC الأولي على مدى عدد موسع من الدورات. وبالنظر إلى التعبير السريع والبسيط وتنقية الرباط DFE، واقترانه مباشرة إلى راتنجات الكروماتوغرافيا التجارية، وغلة منتجاتها الممتازة ونقاءها، نعتقد أن أسلوبنا يوفر بديلا ً مناسباً للبروتين A لل تنقية mAbs ومشتقات الأجسام المضادة التي لا تربط البروتين A، وخاصة إذا كان التحسينات على الناقل والرابط يمكن تحسين DBC واستقرار ligand. وقد أيد هذا الافتراض من قبل الفرق الصغير في ثابت التفكك من DFE تنقية والبروتين A-تنقية 2F5 الأجسام المضادة^5،مما يشير إلى أن لدينا ربط تقارب جديد يسمح باستعادة mAbs عالية الجودة.

الفوائد والقيود الحالية للطريقة

إنتاج الرباط تقارب كاندماج وراثي مع بروتين الناقل يزيد من الذوبان في المخازن المؤقتة المائية وبالتالي التوافق مع ظروف اقتران ligand نموذجية. وعلى النقيض من ذلك، قد تكون الببتيدات الفارغة المستمدة من تركيب الببتيد المرحلة الصلبة الذوبان محدودة في ظل هذه الظروف بسبب تسلسلها⁵⁰، والتي لا يمكن تغييرها لأنها تمليها سلسلة الأحماض الأمينية من epitope المعترف بها من قبل mAb ل أن تكون تنقية. لذلك استخدم آخرون توليف على الراتنج من الأربطة الببتيد⁵¹. وكانت قدرة الربط ثابت من الراتنج الناتجة عالية (~ 80 غرام · L^-1)،ولكن عملية إعداد الراتنج طويلة، لم يتم الإبلاغ عن قدرة ملزمة ديناميكية والنقاء والانتعاش التي تم الحصول عليها كانت أقل مما كانت عليه في نهجنا. ميزة إضافية من ربط البروتين الانصهار في نطاق المختبر هو أن ligand والمتغيرات منها يمكن أن تنتج بسرعة، وتنقية واختبارها مع الحد الأدنى من الجهد في سهلة الاستخدام عالية من خلال نظام التعبير⁵².

والقيود الحالية للطريقة المعروضة هنا هي القدرة الدينامية المنخفضة للربط البالغة 3 ز· L^-1 وخفضه 90٪ على مدى 25 دورات ربط وelute⁵. ويمكن معالجة هذه القيود في المستقبل عن طريق تطبيق شروط تحميل أقل صرامة واستبدال الناقل DsRed الحالي بمتغير هندسي أكثر استقرارا ً على التوالي. على سبيل المثال، مضاعفة وقت الاتصال الحالي من 2 إلى 4 دقائق لديه القدرة على مضاعفة قدرة الربط الديناميكي كما هو مبين لبعض راتنجات البروتين A²⁶.

استكشاف الاخطاء

يسلط الجدول التالي الضوء على المشاكل المحتملة التي يمكن مواجهتها أثناءهذا البروتوكول ويوفر تلميحات حول كيفية حلها (الجدول 1).

الجدول 1: المشاكل المحتملة التي يمكن مواجهتها والإصلاحات الممكنة.
خطوة البروتوكول	المشكله	Couse	اصلاح
1	النباتات لا تنمو	ظروف النمو المهددة	التحقق من الحموضة والموصلية من الأسمدة
			التحقق من درجة الحرارة وظروف الضوء
2 و 3	كميات كبيرة من بروتينات الخلية المضيفة موجودة بعد استخراج	هطول الأمطار غير الكامل	تحقق من درجة الحرارة أثناء الغسل
			تحقق من التحريض في حمام الغسل
2 و 3	لم يتم العثور على أي منتج في مستخلص النبات	درجة حرارة عالية جداً	التحقق من درجة الحرارة ودرجة الحموضة أثناء الغسل
		درجة الحموضة في المخزن المؤقت ابيضاض منخفضة جدا
3	تبقى أجزاء الجذعية أو الأوراق الكبيرة بعد الاستخراج	خلط غير كامل في الخلاط	تأكد من أن المواد النباتية لا تشكل المكونات في الخلاط
3	زيادة الضغط السريع أثناء الترشيح العمق	تحديد عامل التصفية و/أو الاتجاه غير صحيح	التحقق من نوع عامل التصفية واتجاهه
4	القليل من البروتين الانصهار خلال الإلتوى / الكثير من البروتين الانصهار في التدفق من خلال	لم يتم شحن راتنج IMAC بالأيونات المعدنية	تحقق مما إذا كان راتنج IMAC مشحونًا بشكل صحيح بالأيونات
		فقدت بروتين الانصهار علامة التقارب	تجنب أشعة الشمس الشديدة وارتفاع درجات الحرارة أثناء زراعة النباتات
4	بروتين الانصهار المفقود أثناء التركيز	بروتين الانصهار المرتبط بالغشاء	التحقق من نوع الغشاء
			تأكد من أن عامل التركيز لم يكن مرتفعاً جداً
5	انخفاض العائد اقتران	تسلسل غير صحيح من اقتران الكاشف إضافة	التحقق من تسميات الكواشف وتسلسل الإضافة
		إعداد غير صحيح للأعمدة قبل اقتران	التحقق من شروط preparaiton العمود
5 و 6	انخفاض مباب العائد	انخفاض التعبير mAb في الكتلة الحيوية النباتية	اختبار التعبير mAb في الكتلة الحيوية
		انخفاض كثافة الرباط	تحقق من نقاء إعداد البروتين الانصهار
7	تركيزات بروتين منخفضة جدا / عالية في برادفورد حسب	تشكيل فقاعة أثناء الأنابيب	تحقق من وجود فقاعات في بالت 96 جيدا
7	تركيز منخفض من الماب أثناء قياس موارد البرنامج الخاصة	بروتين للخطر رقاقة	مقارنة مع نتائج mAb القياسية مع التركيز المعروف
		تخفيف عينة غير صحيحة	التحقق من معدل التخفيف والمخزن المؤقت

الجدول 1: إطلاق النار من المتاعب.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 لتر / 20 لتر دلو	n / a	/ a	معدات التبييض
2100P مقياس التعكر	المحمول Hach	4650000	مقياس التعكر
& Auml ؛ KTApure	GE Helthcare	29018226	نظام الكروماتوغرافيا
Allegra 25R	Beckman Coulter	369434	الطرد المركزي
طقم اقتران أمين	المركزي GE Healthcare	BR100050	SPR
طقم اقتران أمين طقم اقتران أمين	GE Healthcare	BR100050	SPR مجموعة اقتران رقاقة SPR
الأجسام المضادة 2G12	Fraunhofer IME	n / a	معيار ل SPR القياس
الكمي خلاط	Waring	800EG	خلاط
BP-410	Fuhr	2632410001	مرشح
كيس CanoScan 5600F	Canon	2925B009	الماسح
أنبوب الطرد المركزي 50 مل	تفاعل 1110504 Labomedic
مخلب Sepharose FF	GE Helthcare	17-0575-01	راتنج الكروماتوغرافيا
Cond 3320	WTW	EKA 3338	مقياس التوصيل
خبير التصميم (R) 8	Stat-Ease، Inc.	برنامج	Discovery
Compfort	Gilson	F81029	ماصة متعددة القنوات
فوسفات ثنائي الصوديوم	Carl Roth GmbH	4984.3	مكون الوسائط
زجاجات متنوعة	زجاجات Schott Duran	n / a	زجاجات Glas
Dri Block DB8	Techne	Z381373	كتلة حرارية
DsRed	Fraunhofe IME	n / a	Standart
EDTA	Carl Roth GmbH	8043.2	مكون عازلة
EnSpire	Perkin Elmer	2390-0000	قارئ الألواح
ETHG-912	Oregon Scientific	086L001499-230	ميزان حرارة
F9-C	GE Helthcare	29027743	جامع الكسور
Ferty 2 Mega	Kammlott	5.220072	سماد
فورما - 86C ULT الفريزر	ThermoFisher	88400	الفريزر
HEPES	Carl Roth GmbH	9105.3	المكون العازل
Hettich الطرد المركزي Mikro 200	Hettich	2400	جهاز الطرد المركزي
HiPrep 26/10	GE Helthcare	GE17-5087-01	عمود اللوني
HiTrap NHS المنشط Sepharose HP ، 1 مل	GE Helthcare	17-0716-01	كروماتوغرافيا الأعمدة
حمض الهيدروكلوريك	Carl Roth GmbH	4625.1	مكون العازلة
Imidazole	Carl Roth GmbH	3899.2	مكون العازلة
K700	Pall	5302305	طبقة مرشح العمق
KM02 الأساسية	IKA	n / A	محرك مغناطيسي
KS50P 60D	Pall	B12486	طبقة مرشح العمق
L / S 24	Masterflex	SN-06508-24	الأنابيب
Lauda E300	Lauda Dr Wobser GmbH	Z90010	جهاز الدوران الغاطس
كلوريد المغنيسيوم	Carl Roth GmbH	KK36.2	مكون العازلة
Masterflex L / S	Masterflex	HV-77921-75	المضخة التمعجية
Minisart 0.2 & micro ؛ m	Sartorius	16534K	وحدة التصفية
Nalgene Rapid-Flow PES الزجاجة العلوية	Thermo Fischer Scientific	595-4520	الترشيح الفراغي للمخازن المؤقتة SPR
كبريتات النيكل	Carl Roth GmbH	T111.1	مكون العازلة
Novex NuPAGE 4-12٪ BisTris LDS المواد الهلامية	Invitrogen	NP0336BOX	LDS-PAA
Novex X-cell Mini Cell	Invitrogen	EI0001	غرفة الصفحة
NuPAGE 20x تشغيل العازلة	Invitrogen	NP0002	مركز العازلة
NuPAGE مضاد للأكسدة	Invitrogen	NP0005	مضاد للأكسدة
Pageسلم بروتين المسطرة (10-180 كيلو دالتون)	Invitrogen	26616	معيار البروتين
مثقب مخافق	n / a	n / a	ابيضاض
PH 3110	WTW	2AA110	PH meter
PowerPac HC	Biorad	1645052	وحدة الرحلان الكهربائي
بروتين A من المكورات العنقودية الذهبية< / em>	Sigma-Aldrich	P7837-5MG	طلاء رقائق SPR
Sephadex G-25 ديكستران ناعم ، متقاطع	Helthcare	17003301	راتنج كروماتوغرافيا
ملعقة سيليكون	n / a	n / a	ملعقة
سيمبلي بلو SafeStain	Invitrogen	LC6060	محلول تلطيخ جل
أسيتات الصوديوم	Carl Roth GmbH	6773.1	مكون عازلة
أسيتات الصوديوم	Carl Roth GmbH	X891.1	مكون الوسائط
أزيد الصوديوم	Sigma Aldrich	S2002-100G	مكون الوسائط
كلوريد الصوديوم	Carl Roth GmbH	P029.2	مكون العازلة
سترات الصوديوم	Carl Roth GmbH	HN13.2	مكون عازلة
ثنائي كبريتيت الصوديوم	Carl Roth GmbH	243973-100G	مكون الوسائط
فوسفات الصوديوم	Carl Roth GmbH	T877.2	مكون الوسائط
مستشعر التقارب SPR - أجهزة استشعار أمين	سييرا عالية السعة GmbH / Bruker Daltonics	SPR-AS-HCA	SPR رقاقة
SPR-2/4 البلازمون السطحي محلل الرنين	Sierra Sensors GmbH / Bruker Daltonics	n / a	جهاز SPR
SSM3	ستيوارت	10034264	وعاء ساخن صغير جيروروسكوب
، 20 لتر	Clatronic	n / A	غرفة ابيضاض
محاقن معقمة ، 2 مل	B. Braun	4606027V	حقاقن
adpter (Union Luer F)	GE Helthcare	181112-51	محول حقنة
TE6101	Sartorius	TE6101	مقياس دقيق
Tween-20 (Polysorbate)	Merck	8170721000	مكون العازلة
يونيكورن 6.4	GE Helthcare	29056102	برنامج الكروماتوغرافيا
أكياس فراغ	Ikea	203.392.84	مصنع storge
VelaPad 60	Pall	VP60G03KNH4	تصفية الإسكان
Vortex-Genie 2	الصناعات العلمية	SI-0236	Vortex
XK-26/20 عمود مبيت	GE Helthcare	28-9889-48	عمود اللوني