Method Article

طرق البحث في بلاستيدات الخضراء: استكشاف استهداف وتحديد مواقع وتفاعلات بروتينات البلاستيدات الخضراء

DOI:

10.3791/59935

⸱

August 15th, 2019

1Department of Plant Sciences, University of Oxford

In This Article

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

البلاستيدات الخضراء هي العضيات التي تحدد النباتات1. إلى جانب العديد من الوظائف الأيضية والتطورية والإشارات الأخرى، تعد البلاستيدات الخضراء مسؤولة عن عملية التمثيل الضوئي – وهي العملية التي يتم فيها استغلال طاقة ضوء الشمس لتشغيل أنشطة الحياة الخلوية. وبالتالي، فإن البلاستيدات الخضراء ضرورية، ليس فقط للنباتات بل أيضا للعدد الهائل من النظم البيئية التي تعتمد على النباتات، وللزراعة. تتكون البلاستيدات الخضراء من آلاف البروتينات المختلفة، معظمها مشفر بالنواة ويتم استيرادها من السيتوسول قبل أن يتم توجيهها داخليا إلى أحد عدة أقسام داخل العضيات المميزةبوضوح 1. لتحقيق فهم أكثر اكتمالا لتطوير ووظائف بلاستيدات الكلوروبلاستيد، ولتمكين استراتيجيات التكنولوجيا الحيوية التي تشمل معالجة البلاستيدات الخضراء التي تعالج التحديات العالمية المرتبطة بالأمن الغذائي أو الطاقة الحيوية، سيكون من الضروري تحديد استهداف وتحديد مواقع وتفاعلات البروتينات المهمة للبلاستيدات الخضراء. تصف هذه المجموعة مجموعة من التقنيات المهمة والتكميلية التي يمكن استخدامها لتحقيق هذه الأهداف. تركز المجموعة بشكل أساسي على النبات النموذجي المستخدم على نطاق واسع أرابيدوبسيس ثاليانا (ثالي كريس)، لكن يمكن أيضا تكييف هذه الطرق وتطبيقها على كائنات أخرى.

تتضمن المجموعة أوصافا لتقنيتين مختلفتين لتحليل استيراد البروتينات المشفرة بالنواة إلى البلاستيدات الخضراء عبر غلاف الغشاء المزدوج. يصف مقال لينغ وجارفيس2 طريقة في المختبر، حيث يتم حضن البلاستيدات الخضراء المعزولة ببروتين سلفي مشمس مشع. يتم تحديد مدى امتصاص البلاستيدات الخضراء للبروتين السلف من خلال مراقبة تغير حجم البروتين الناتج عن انقسام الببتيد العابر (تسلسل القائد المستهدف)، باستخدام SDS-PAGE وتصوير الفوسفور. الطريقة المعروضة هي تطوير لنهج استخدم لدراسة استيراد بروتين البلاستيدات الخضراء في المختبر لعقود عديدة، ويتضمن خطوات إضافية تمكن من تقييم استجابة آلية الاستيراد لظروف الإجهاد التي يعانيمنها المصنع. من ناحية أخرى، يصف مقال لي وآخرون طريقة في الجسم الحي تعتمد على التعبير المؤقت لبروتين كيمري أولي، يحمل مجال بروتين فلوري، في الخلايا السليمة (البروتوبلاستيات). في هذا الاختبار، يمكن متابعة مدى استيراد البروتينات الخضراء بطريقتين مختلفتين: من خلال مراقبة تحديد وكثافة إشارة الفلورة باستخدام مجهر الفلورة؛ وتحليل تغير حجم البروتين الذي يحدث نتيجة انقسام الببتيدات العابرة باستخدام القطع المناعي. هاتان الطريقتان متكاملتان للغاية، ويمكن أن تعطي نتائج مقنعة عند استخدامها معا في 5 بالتوازي.

بمجرد استيراد بروتين عبر الغلاف إلى البلاستيد الخضراوي وإزالة الببتيد العابر منه، قد يتخذ شكله النهائي في السدى (الحجرة المائية الداخلية الرئيسية للعضية)، أو يشارك في أحد مسارات الفرز الداخلية1. وباعتبارها موقعا لمجمعات التمثيل الضوئي الوفيرة للغاية، تعد أغشية الثيلاكويد وجهة رئيسية لهذا النوع من الفرز الداخلي؛ في الواقع، يتضمن استهداف بروتين الثيلاكويد مسارات متعددة متميزة ميكانيكيا. يصف مقال آشر وآخرون مجموعة من الطرق المخبرية التي تتيح دراسة مسارات نقل مختلفة لبروتين الثيلاكويد. تتضمن هذه الطرق حضانة الثيلاكويدات المعزولة مع بروتين أولي موسوم بالإشعاع، وفي بعض الحالات مستخلص سترومال مركز. يتم مراقبة مدى امتصاص البروتين من قبل الثيليكويدات من خلال تقييم انقسام إشارة الاستهداف، وحماية البروتين من بروتاز الثيرموليسين المطبق خارجيا، باستخدام SDS-PAGE وتصوير الفسفر. بالطبع، الثيلاكويدات ليست الحجزيرة الفرعية الوحيدة للبلاستيدات الخضراء، وغالبا ما يكون من المرغوب فيها أن تكون لديك القدرة على تقييم أقسام أخرى أيضا. في هذا الصدد، فإن مقال بوتشنك وآخرون مهم بشكل خاص، لأنه يصف طرق تجزئة البلاستيدات الخضراء لإنتاج عينات نقية للغاية تتوافق مع أغشية الغلاف والسترومات والثيلاكويدات. بمجرد تحضيرها، يمكن تحليل هذه الكسور بواسطة التطهير المناعي و/أو مطيافية الكتلة، لتوفير ثروة من المعلومات حول تحديد مواقع بروتينات البلاستيدات الخضراء تحت العضوية9.

فيما يتعلق بتحليل تفاعلات البروتين والبروتين والتجمعات المعقدة متعددة البروتينات، تم وصف منهجيتين مختلفتين في المجموعة. يقدم مقال شانموغابالاجي وآخرون 10 طريقة لتنقية الألفة لمجمعات البروتينات الخضراء الكلوروبلاستي. تتضمن هذه التقنية تحليل النباتات المعدلة وراثيا التي تعبر عن مكون من المجمع المعني تم هندسته لحمل علامة ألفة (ما يسمى بعلامة تنقية الألفة المتتالية، أو علامة TAP). يتم استغلال قدرة هذا الوسم على الارتباط بقوة بمصفوفة خاملة كجزء من استراتيجية التنقية. تركز الطريقة المعروضة تحديدا على تنقية آلية استيراد البروتينات الخضراء (والتي تتكون من مركبات متعددة البروتينات تسمى TOC وTIC مدمجة في أغشية الغلاف1)، ولكن من حيث المبدأ يمكن تكييفها لدراسة أي من تجمعات البروتينات المتعددة الأخرى الموجودة في البلاستيداتالخضراء 11. تصف المقالة التي كتبها رانتالا وآخرون نهجا تكميليا لتوصيف العقدات بناء على الرحلان الكهربائي في الظروف الأصلية. تتضمن التقنية، كما هو موضح هنا، تحرير مركبات التمثيل الضوئي من الثيلاكويدات المنقاء باستخدام منظف خفيف غير أيوني، تليها فصلها باستخدام البلو نيتيف (BN)-PAGE. قد يتبع الدقة الأولية للمركبات بعد ثان من الرحلان الكهربائي تحت ظروف التغيير، وهذا يمكن من تصور المكونات الفردية لكل مركب المحددة في البعد الأول. كما هو الحال مع طريقة TAP، يمكن تكييف هذا النهج الأصلي بنجاح لدراسة مركبات بروتينية أخرى داخل العضية13,14. وبأي من النهجين، يمكن تحليل المجمعات المنقاة بطرق متنوعة، بما في ذلك عن طريق التطهير المناعي ومطياف الكتلة.

معا، تقدم المقالات المدرجة في هذه المجموعة مجموعة قوية من التقنيات التكميلية التي، بالاقتران مع المواردالحالية 15,16، يمكن استخدامها لتحسين فهمنا بشكل كبير للجوانب المتنوعة لتكوين ووظائف الخلايا الخضراء، خاصة تلك المرتبطة ارتباطا وثيقا بالبروتيوم العضوي. نظرا لأن البلاستيدات الخضراء مسؤولة عن الجزء الأكبر من الإنتاج الأولي بالتمثيل الضوئي الأرضي، ولها أدوارا حيوية في استجابات النباتات للبيئة (بما في ذلك الإجهادات الحيوية وغير الحيوية)، فإن هذه العضيات المذهلة ستظل حتما محور رئيسي للأبحاث الأساسية والتطبيقية حول العالم لسنوات قادمة.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

البلاستيدات الخضراء هي العضيات التي تحدد النباتات1. إلى جانب العديد من الوظائف الأيضية والتطورية والإشارات الأخرى، تعد البلاستيدات الخضراء مسؤولة عن عملية التمثيل الضوئي – وهي العملية التي يتم فيها استغلال طاقة ضوء الشمس لتشغيل أنشطة الحياة الخلوية. وبالتالي، فإن البلاستيدات الخضراء ضرورية، ليس فقط للنباتات بل أيضا للعدد الهائل من النظم البيئية التي تعتمد على النباتات، وللزراعة. تتكون البلاستيدات الخضراء من آلاف البروتينات المختلفة، معظمها مشفر بالنواة ويتم استيرادها من السيتوسول قبل أن يتم توجيهها داخليا إلى أحد عدة أقسام داخل العضيات المميزةبوضوح 1. لتحقيق فهم أكثر اكتمالا لتطوير ووظائف بلاستيدات الكلوروبلاستيد، ولتمكين استراتيجيات التكنولوجيا الحيوية التي تشمل معالجة البلاستيدات الخضراء التي تعالج التحديات العالمية المرتبطة بالأمن الغذائي أو الطاقة الحيوية، سيكون من الضروري تحديد استهداف وتحديد مواقع وتفاعلات البروتينات المهمة للبلاستيدات الخضراء. تصف هذه المجموعة مجموعة من التقنيات المهمة والتكميلية التي يمكن استخدامها لتحقيق هذه الأهداف. تركز المجموعة بشكل أساسي على النبات النموذجي المستخدم على نطاق واسع أرابيدوبسيس ثاليانا (ثالي كريس)، لكن يمكن أيضا تكييف هذه الطرق وتطبيقها على كائنات أخرى.

تتضمن المجموعة أوصافا لتقنيتين مختلفتين لتحليل استيراد البروتينات المشفرة بالنواة إلى البلاستيدات الخضراء عبر غلاف الغشاء المزدوج. يصف مقال لينغ وجارفيس2 طريقة في المختبر، حيث يتم حضن البلاستيدات الخضراء المعزولة ببروتين سلفي مشمس مشع. يتم تحديد مدى امتصاص البلاستيدات الخضراء للبروتين السلف من خلال مراقبة تغير حجم البروتين الناتج عن انقسام الببتيد العابر (تسلسل القائد المستهدف)، باستخدام SDS-PAGE وتصوير الفوسفور. الطريقة المعروضة هي تطوير لنهج استخدم لدراسة استيراد بروتين البلاستيدات الخضراء في المختبر لعقود عديدة، ويتضمن خطوات إضافية تمكن من تقييم استجابة آلية الاستيراد لظروف الإجهاد التي يعانيمنها المصنع. من ناحية أخرى، يصف مقال لي وآخرون طريقة في الجسم الحي تعتمد على التعبير المؤقت لبروتين كيمري أولي، يحمل مجال بروتين فلوري، في الخلايا السليمة (البروتوبلاستيات). في هذا الاختبار، يمكن متابعة مدى استيراد البروتينات الخضراء بطريقتين مختلفتين: من خلال مراقبة تحديد وكثافة إشارة الفلورة باستخدام مجهر الفلورة؛ وتحليل تغير حجم البروتين الذي يحدث نتيجة انقسام الببتيدات العابرة باستخدام القطع المناعي. هاتان الطريقتان متكاملتان للغاية، ويمكن أن تعطي نتائج مقنعة عند استخدامها معا في 5 بالتوازي.

بمجرد استيراد بروتين عبر الغلاف إلى البلاستيد الخضراوي وإزالة الببتيد العابر منه، قد يتخذ شكله النهائي في السدى (الحجرة المائية الداخلية الرئيسية للعضية)، أو يشارك في أحد مسارات الفرز الداخلية1. وباعتبارها موقعا لمجمعات التمثيل الضوئي الوفيرة للغاية، تعد أغشية الثيلاكويد وجهة رئيسية لهذا النوع من الفرز الداخلي؛ في الواقع، يتضمن استهداف بروتين الثيلاكويد مسارات متعددة متميزة ميكانيكيا. يصف مقال آشر وآخرون مجموعة من الطرق المخبرية التي تتيح دراسة مسارات نقل مختلفة لبروتين الثيلاكويد. تتضمن هذه الطرق حضانة الثيلاكويدات المعزولة مع بروتين أولي موسوم بالإشعاع، وفي بعض الحالات مستخلص سترومال مركز. يتم مراقبة مدى امتصاص البروتين من قبل الثيليكويدات من خلال تقييم انقسام إشارة الاستهداف، وحماية البروتين من بروتاز الثيرموليسين المطبق خارجيا، باستخدام SDS-PAGE وتصوير الفسفر. بالطبع، الثيلاكويدات ليست الحجزيرة الفرعية الوحيدة للبلاستيدات الخضراء، وغالبا ما يكون من المرغوب فيها أن تكون لديك القدرة على تقييم أقسام أخرى أيضا. في هذا الصدد، فإن مقال بوتشنك وآخرون مهم بشكل خاص، لأنه يصف طرق تجزئة البلاستيدات الخضراء لإنتاج عينات نقية للغاية تتوافق مع أغشية الغلاف والسترومات والثيلاكويدات. بمجرد تحضيرها، يمكن تحليل هذه الكسور بواسطة التطهير المناعي و/أو مطيافية الكتلة، لتوفير ثروة من المعلومات حول تحديد مواقع بروتينات البلاستيدات الخضراء تحت العضوية9.

فيما يتعلق بتحليل تفاعلات البروتين والبروتين والتجمعات المعقدة متعددة البروتينات، تم وصف منهجيتين مختلفتين في المجموعة. يقدم مقال شانموغابالاجي وآخرون 10 طريقة لتنقية الألفة لمجمعات البروتينات الخضراء الكلوروبلاستي. تتضمن هذه التقنية تحليل النباتات المعدلة وراثيا التي تعبر عن مكون من المجمع المعني تم هندسته لحمل علامة ألفة (ما يسمى بعلامة تنقية الألفة المتتالية، أو علامة TAP). يتم استغلال قدرة هذا الوسم على الارتباط بقوة بمصفوفة خاملة كجزء من استراتيجية التنقية. تركز الطريقة المعروضة تحديدا على تنقية آلية استيراد البروتينات الخضراء (والتي تتكون من مركبات متعددة البروتينات تسمى TOC وTIC مدمجة في أغشية الغلاف1)، ولكن من حيث المبدأ يمكن تكييفها لدراسة أي من تجمعات البروتينات المتعددة الأخرى الموجودة في البلاستيداتالخضراء 11. تصف المقالة التي كتبها رانتالا وآخرون نهجا تكميليا لتوصيف العقدات بناء على الرحلان الكهربائي في الظروف الأصلية. تتضمن التقنية، كما هو موضح هنا، تحرير مركبات التمثيل الضوئي من الثيلاكويدات المنقاء باستخدام منظف خفيف غير أيوني، تليها فصلها باستخدام البلو نيتيف (BN)-PAGE. قد يتبع الدقة الأولية للمركبات بعد ثان من الرحلان الكهربائي تحت ظروف التغيير، وهذا يمكن من تصور المكونات الفردية لكل مركب المحددة في البعد الأول. كما هو الحال مع طريقة TAP، يمكن تكييف هذا النهج الأصلي بنجاح لدراسة مركبات بروتينية أخرى داخل العضية13,14. وبأي من النهجين، يمكن تحليل المجمعات المنقاة بطرق متنوعة، بما في ذلك عن طريق التطهير المناعي ومطياف الكتلة.

معا، تقدم المقالات المدرجة في هذه المجموعة مجموعة قوية من التقنيات التكميلية التي، بالاقتران مع المواردالحالية 15,16، يمكن استخدامها لتحسين فهمنا بشكل كبير للجوانب المتنوعة لتكوين ووظائف الخلايا الخضراء، خاصة تلك المرتبطة ارتباطا وثيقا بالبروتيوم العضوي. نظرا لأن البلاستيدات الخضراء مسؤولة عن الجزء الأكبر من الإنتاج الأولي بالتمثيل الضوئي الأرضي، ولها أدوارا حيوية في استجابات النباتات للبيئة (بما في ذلك الإجهادات الحيوية وغير الحيوية)، فإن هذه العضيات المذهلة ستظل حتما محور رئيسي للأبحاث الأساسية والتطبيقية حول العالم لسنوات قادمة.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تشمل طلبات البراءات GB1803833.1، GB1803834.9، GB1815206.6 وUS 16/643507 التطبيق التجاري لأبحاث المؤلف.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتم تمويل البحث في مختبر المؤلف من قبل مجلس أبحاث التكنولوجيا الحيوية والعلوم البيولوجية (BBSRC؛ المراجع للمنح BB/N006372/1، BB/R005591/1، BB/R009333/1، BB/R016984/1).

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Biogenesis and homeostasis of chloroplasts and other plastids. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (12), 787-802 (2013).">Jarvis, P., López-Juez, E. Biogenesis and homeostasis of chloroplasts and other plastids. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (12), 787-802 (2013).
  2. Analysis of protein import into chloroplasts isolated from stressed plants. Journal of Visualized Experiments. (117), (2016).">Ling, Q., Jarvis, P. Analysis of protein import into chloroplasts isolated from stressed plants. Journal of Visualized Experiments. (117), (2016).
  3. A simple method for isolating import-competent Arabidopsis chloroplasts. FEBS Letters. 529 (2-3), 215-220 (2002).">Aronsson, H., Jarvis, P. A simple method for isolating import-competent Arabidopsis chloroplasts. FEBS Letters. 529 (2-3), 215-220 (2002).
  4. A method for isolating a high yield of Arabidopsis chloroplasts capable of efficient import of precursor proteins. Plant Journal. 27 (1), 59-65 (2001).">Fitzpatrick, L. M., Keegstra, K. A method for isolating a high yield of Arabidopsis chloroplasts capable of efficient import of precursor proteins. Plant Journal. 27 (1), 59-65 (2001).
  5. Regulation of chloroplast protein import by the ubiquitin E3 ligase SP1 is important for stress tolerance in plants. Current Biology. 25 (19), 2527-2534 (2015).">Ling, Q., Jarvis, P. Regulation of chloroplast protein import by the ubiquitin E3 ligase SP1 is important for stress tolerance in plants. Current Biology. 25 (19), 2527-2534 (2015).
  6. Studying protein import into chloroplasts using protoplasts. Journal of Visualized Experiments. (142), (2018).">Lee, J., Kang, H., Hwang, I. Studying protein import into chloroplasts using protoplasts. Journal of Visualized Experiments. (142), (2018).
  7. Isolation of physiologically active thylakoids and their use in energy-dependent protein transport assays. Journal of Visualized Experiments. (139), (2018).">Asher, A., Ganesan, I., Klasek, L., Theg, S. M. Isolation of physiologically active thylakoids and their use in energy-dependent protein transport assays. Journal of Visualized Experiments. (139), (2018).
  8. Preparation of chloroplast sub-compartments from Arabidopsis for the analysis of protein Localization by immunoblotting or proteomics. Journal of Visualized Experiments. (140), (2018).">Bouchnak, I., Moyet, L., Salvi, D., Kuntz, M., Rolland, N. Preparation of chloroplast sub-compartments from Arabidopsis for the analysis of protein Localization by immunoblotting or proteomics. Journal of Visualized Experiments. (140), (2018).
  9. AT_CHLORO: the first step when looking for information about subplastidial localization of proteins. Methods in Molecular Biology. 1829, 395-406 (2018).">Salvi, D., et al. AT_CHLORO: the first step when looking for information about subplastidial localization of proteins. Methods in Molecular Biology. 1829, 395-406 (2018).
  10. Affinity purification of chloroplast translocon protein complexes using the TAP tag. Journal of Visualized Experiments. (141), (2018).">Shanmugabalaji, V., Douet, V., Agne, B., Kessler, F. Affinity purification of chloroplast translocon protein complexes using the TAP tag. Journal of Visualized Experiments. (141), (2018).
  11. A Ycf2-FtsHi heteromeric AAA-ATPase complex is required for chloroplast protein import. Plant Cell. 30 (11), 2677-2703 (2018).">Kikuchi, S., et al. A Ycf2-FtsHi heteromeric AAA-ATPase complex is required for chloroplast protein import. Plant Cell. 30 (11), 2677-2703 (2018).
  12. Analysis of thylakoid membrane protein complexes by blue native gel electrophoresis. Journal of Visualized Experiments. (139), (2018).">Rantala, M., Paakkarinen, V., Aro, E. M. Analysis of thylakoid membrane protein complexes by blue native gel electrophoresis. Journal of Visualized Experiments. (139), (2018).
  13. Characterization of the preprotein translocon at the outer envelope membrane of chloroplasts by blue native PAGE. Plant and Cell Physiology. 47 (3), 363-371 (2006).">Kikuchi, S., Hirohashi, T., Nakai, M. Characterization of the preprotein translocon at the outer envelope membrane of chloroplasts by blue native PAGE. Plant and Cell Physiology. 47 (3), 363-371 (2006).
  14. Stable megadalton TOC-TIC supercomplexes as major mediators of protein import into chloroplasts. Plant Journal. 92 (2), 178-188 (2017).">Chen, L. J., Li, H. M. Stable megadalton TOC-TIC supercomplexes as major mediators of protein import into chloroplasts. Plant Journal. 92 (2), 178-188 (2017).
  15. Methods in Molecular Biology. JM, W. alker 775, Humana Press. New York City. 432(2011).">Jarvis, R. P. Methods in Molecular Biology. JM, W. alker 775, Humana Press. New York City. 432(2011).
  16. Methods in Molecular Biology. JM, W. alker 774, Humana Press. New York City. 374(2011).">Jarvis, R. P. Methods in Molecular Biology. JM, W. alker 774, Humana Press. New York City. 374(2011).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Chloroplast Protein ImportProtein LocalizationProtein InteractionsThylakoid MembranesSubcellular FractionationAffinity PurificationBlue Native PAGEFluorescence MicroscopyImmunoblottingSDS PAGE

Related Articles