Method Article

وضع علامات محددة من النيوكليويدات الميتوكوندريا لمرور الوقت المجهر الإضاءة منظم

DOI:

10.3791/60003

⸱

June 4th, 2020

 ,  , 
1Imaging Facility, Max Planck Institute of Immunobiology and Epigenetics

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يصف البروتوكول وضع علامات محددة على النيوكليويدات الميتوكوندريا مع وصمة عار هلام الحمض النووي المتاحة تجاريًا ، واكتساب سلسلة مرور الوقت من الخلايا الحية المسماة بواسطة المجهر المجهري للإضاءة المهيكلة (SR-SIM) ، والتتبع التلقائي لحركة النيوكليويد.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

النيوكليويدات الميتوكوندريا هي جزيئات مدمجة تشكلت من جزيئات الحمض النووي الميتوكوندريا المغلفة بالبروتينات. الحمض النووي الميتوكوندريا ترميز tRNAs, rRNAs, والعديد من البولي ببتيدات الميتوكوندريا الأساسية. النيوكليويدات الميتوكوندريا تقسيم وتوزيع داخل شبكة الميتوكوندريا الديناميكية التي تخضع للانشطار / الانصهار وغيرها من التغيرات المورفولوجية. عالية الدقة المجهر الفلوري الحي هو تقنية مباشرة لتوصيف موقف النيوكليويد والحركة. لهذه التقنية، يتم عادة تسمية النيوكليويدات من خلال العلامات الفلورية من مكونات البروتين الخاصة بهم، وهي عامل النسخ أ (TFAM). ومع ذلك، تحتاج هذه الاستراتيجية إلى تعبير مفرط عن بنية فلورية معلمة بالبروتين، والتي قد تسبب القطع الأثرية (المبلغ عنها لـ TFAM)، وغير ممكنة في كثير من الحالات. الأصباغ العضوية الملزمة للحمض النووي ليس لديها هذه العيوب. ومع ذلك، فإنها تظهر دائما تلطيخ من كل من DNAs النووية والميتوكوندريا، وبالتالي تفتقر إلى خصوصية النيوكليويدات الميتوكوندريا. من خلال الأخذ في الاعتبار الخصائص الفيزيائية والكيميائية لهذه الأصباغ ، اخترنا وصمة عار هلام الحمض النووي (SYBR Gold) وحققنا وضع علامات تفضيلية على النيوكليويدات الميتوكوندريا في الخلايا الحية. خصائص الصبغة ، وخاصة سطوعها العالي عند الربط بالحمض النووي ، تسمح بالقياس الكمي اللاحق لحركة النيوكليويد الميتوكوندريا باستخدام سلسلة زمنية من صور الإضاءة المنظمة فائقة الدقة.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تشكل جزيئات الحمض النووي الدائرية 16.5 كيلوبت في الثانية المادة الوراثية للالميتوكوندريا، وترميز 22 tRNAs، و2 rRNAs، و 13 polypeptides اللازمة لمجمعات الفوسفور التأكسدي الميتوكوندريا. الميتوكوندريا الحمض النووي ملزمة لالميتوكوندريا عامل النسخ أ (TFAM) والعديد من البروتينات الأخرى تشكل النيوكليويدات الميتوكوندريا1,2,3,4. نقل النيوكليودات الميتوكوندريا وإعادة توزيعها بين مكونات شبكة الميتوكوندريا5,6 خلال إعادة عرض مورفولوجية, الانشطار أو الانصهار اعتمادا على مرحلة دورة الخلية, الإجهاد, وعوامل أخرى (استعرضت في Pernas وآخرون7). بالإضافة إلى ذلك ، فإن حركة النيوكليويدات الميتوكوندريا ، متورطة في مرض الذئبة الليفي ةالجهازية 8 وقد تلعب دورًا في أمراض أخرى. المجهر الفلوري هو تقنية مباشرة لدراسات الخلايا الحية من العضيات ، ولكن هذه التقنية لديها قرار من > 200 نانومتر ، وهو أكبر من حجم النيوكليويدات الميتوكوندريا (~ 100 نانومتر9،10،11،12). وقد تم التحايل على هذا الحد من قبل ما يسمى "فائقة الدقة" تقنيات، مثل تحفيز استنفاد الانبعاثات (STED) والمجهر توطين جزيء واحد (SMLM)13،14. حتى الآن، تم تصوير النيوكليويدات الميتوكوندريا وغيرها من DNAs في الخلايا الحية عن طريق المجهر المباشر إعادة بناء بصري ستوكاستيك (dSTORM)15. لوحظت الهياكل الدقيقة شبه الميتوكوندريا مع مواقف ربط مع mtDNA من قبل STED في الخلايا الحية16. ومع ذلك ، تتطلب هذه التقنيات فائقة الدقة كثافة إضاءة عالية ، مما يسبب تأثيرات سامة ضوئية على الخلايا الحية17. ولذلك، مرور الوقت التصوير من النيوكليويدات الميتوكوندريا مع قرار وراء حد الحيود هو التحدي. لمعالجة هذا، استخدمنا فائقة الدقة المجهر الإضاءة منظم (SR-SIM)18. SIM يتطلب جرعة طاقة الإضاءة أقل بكثير من STED و SMLM19. وعلاوة على ذلك، وعلى النقيض من تقنيات STED وSMLM، SIM يسمح مباشرة متعددة الألوان ثلاثية الأبعاد (3D) التصوير، وأنه لا يتطلب خصائص الفيزياء الضوئية خاصة من الفلوروفوريات أو تكوين عازلة التصوير19.

الاستراتيجية التقليدية لتسمية النيوكليويدات الميتوكوندريا في الخلايا الحية هي وضع علامات الفلورسنت على بروتين النيوكليويد الميتوكوندريا ، مثل TFAM20. ومع ذلك، في كثير من الحالات، هذه الاستراتيجية غير مناسبة. وعلاوة على ذلك، الإفراط في التعبير عن البروتين الفلوري الموسومة TFAM تنتج قطعة أثرية خطيرة21. وضع العلامات على الحمض النووي مع الأصباغ العضوية له مزايا على البروتين الفلوري (FP) القائم على استراتيجية. الأصباغ العضوية خالية من القيود المتعلقة بوضع علامات FP: يمكن استخدامها لأي نوع من الخلايا أو الأنسجة ويمكن تطبيقها في أي وقت من التجربة. وقد تم الإبلاغ عن تصوير الخلايا الحية من النيوكليويدات الميتوكوندريا مع العديد من الأصباغ الملزمة للحمض النووي: DAPI22، SYBR الأخضر23، Vybrant DyeCycle24، وبيكوغرين15،25،26. عيب كبير من معظم الأصباغ الملزمة للحمض النووي لعلامات النوكلويد هو أنها تلطخ كل الحمض النووي داخل الخلية. استهداف صبغة فقط إلى الحمض النووي الميتوكوندريا أمر مرغوب فيه للغاية. لتحقيق ذلك، واختيار دقيق لصبغة تمتلك خصائص فيزيائية كيميائية مناسبة أمر ضروري. ومن المعروف أن الأصباغ الدهنية التي تمتلك شحنة إيجابية غير موضعية ، مثل rhodamine 123 ، تتراكم في الميتوكوندريا الحية ، والتي تحافظ على إمكاناتها السلبية للأغشية. بالإضافة إلى ذلك ، يجب أن تربط صبغة مثالية لعلامات محددة من النيوكليويدات الميتوكوندريا الحمض النووي مع تقارب عال وتنبعث منها الفلورسال الساطع على ربط الحمض النووي. وبالنظر إلى هذه المتطلبات، فإن بعض السماويين واعدة (على سبيل المثال، بيكوغرين)، ولكن الحمض النووي ملطخ بوفرة بهذه الأصباغ في وقت واحد مع الحمض النووي الميتوكوندريا15،25،26. يصف هذا البروتوكول وضع علامات محددة على النيوكليويدات الميتوكوندريا في الخلايا الحية مع صبغة سمين أخرى ، SYBR Gold (SG) ، وتتبع النيوكليويدات في الوقت الفاصل فوق الدقة مقاطع فيديو SIM. وعلاوة على ذلك، يمكن تصوير الخلايا الحية الملطخة بـ SG بأي نوع من المجهر الفلوري المقلوب (الكونستبك، قرص الغزل، epifluorescence، وما إلى ذلك) مناسبة للخلايا الحية ومجهزة بمصدر ضوء 488 نانومتر.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ملاحظة: جميع خطوط الخلية المذكورة هنا كانت مثقفة في جلوكوز عالي جلولتكو المعدلة النسر المتوسطة (DMEM) تكملها مع 10٪ مصل البقر الجنين (FBS)، الجلوتامين، البنسلين / العقديات، وبيروفات. معادلة جميع وسائل الإعلام والمكملات الغذائية لاستخدامها في يوم وضع العلامات والتصوير عن طريق الاحترار لهم تصل إلى 37 درجة مئوية في حاضنة تعيين إلى 5٪ CO2. جميع العمل ثقافة الخلية بما في ذلك وضع العلامات تجري في ظروف معقمة تحت غطاء تدفق لامي.

1. يعيش خلية وضع العلامات

  1. قبل يوم واحد من إجراء وضع العلامات، والثقافة 4 × 105 خلايا هيلا في 2 مل من المتوسط في طبق بيتري 35 ملم مع #1.5 قاع الزجاج. يمكن استخدام الشرائح ذات الغرف المتعددة، ولكن يجب تعديل وحدات التخزين بشكل متناسب مع حجم البئر. تمييع تعليق الخلية إلى ما يقرب من 50،000 خلية / مل والبذور 2 مل من تعليق الخلية في طبق بيتري 35 ملم.
  2. إعداد التخفيفات التالية من SYBR الذهب (SG) حل الأسهم التجارية: 1:5,000. إعداد Mitotracker الأحمر العميق (بقعة حمراء بعيدة) أو Mitotracker CMXRos الأحمر (وصمة عار حمراء)(جدول المواد؛الأسهم التجارية المخفف1:2000) في المتوسط ثقافة خالية من الحمراء الفينول. إعداد نفس مجموعة تخفيف بيكوغرين كما لSG.
    ملاحظة: الحلول الموضحة في الخطوة 1.2 هي حلول وضع العلامات 2x. حماية جميع الحلول التي تحتوي على الأصباغ الفلورية من الضوء قدر الإمكان.
  3. غسل الخلايا الملتصقة مع 2 مل PBS مرة واحدة. أضف 1 مل من الثقافة الخالية من الفينول الحمراء إلى طبق بيتري 35 مم. بالنسبة للشريحة ذات 8 غرف ذات الغرف بشكل جيد، استخدم وحدة تخزين تساوي 1/2 من إجمالي سعة البئر (على سبيل المثال، أضف 125 ميكرولتر إذا كانت القدرة الإجمالية للبئر 250 ميكرولتر).
  4. أضف 1 مل من محلول وضع العلامات 2x الذي تم إعداده في الخطوة 1.2 إلى 35 مم طبق بيتري. بالنسبة لشريحة ذات 8 غرف جيدة، استخدم وحدة تخزين تساوي 1/2 من إجمالي سعة البئر. احتضان الخلايا لمدة 30 دقيقة في 37 درجة مئوية تحت 5٪ CO2.
    ملاحظة: لا تحتضن الخلايا مع حل تسمية SG لفترة أطول من 1 ساعة، لأن أطول الحضانة سوف يسبب وضع العلامات من الحمض النووي.
  5. يستنشق بعناية المتوسطة التي تحتوي على الأصباغ الفلورية وغسل الخلايا مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني.
  6. أضف متوسط ثقافة الخلايا الخالية من الفينول الحمراء والحفاظ على الخلايا في الظلام في حاضنة CO2 عند 37 درجة مئوية حتى التصوير.
  7. صورة الخلايا الحية على المجهر SR-SIM مجهزة بوحدة حضانة (انظر أدناه).

2. SR-SIM صورة اقتناء

  1. تثبيت حاضنة المرحلة الأعلى على مرحلة المجهر. تعيين درجة الحرارة المطلوبة وتركيز ثاني أكسيد الكربون2 (على سبيل المثال، 37 درجة مئوية و 5٪ لخلايا الثدييات) والحفاظ على الدفء لمدة ساعة واحدة على الأقل قبل البدء في الحصول على الصورة.
  2. قم بتشغيل جميع مكونات مجهر SR-SIM، بما في ذلك الليزر، واتركها للإحماء لمدة ساعة واحدة على الأقل.
  3. اختيار التكبير عالية، فتحة رقمية عالية (NA) هدف الغمر (على سبيل المثال، 100x 1.46 زيت NA) الموصى بها لSR-SIM من قبل الشركة المصنعة المجهر.
  4. قم بتثبيت شريحة مغرفة أو طبق 35 مم مع خلايا تحمل علامة (من الخطوة 1.6) على مرحلة المجهر المحتضن.
  5. تحديد موقع المنطقة ذات الاهتمام على العينة، ويفضل أن يكون ذلك مع oculars. لتحقيق أفضل جودة تصوير SR-SIM، اختر الخلايا التي ترتبط بشكل جيد بالزجاج.
  6. استخدم كاميرا إلكترونية عالية المنتثة ذات التكلفة الخلفية تضاعف الجهاز المقترن بالشحن (EM-CCD) للحصول على صور SR-SIM.
  7. باستخدام برنامج الحصول على الصور، قم بتعيين مكسب EM مرتفع موصى به للكاميرا المستخدمة (على سبيل المثال، 300).
  8. قبل الحصول على سلسلة الفاصل الزمني لتتبع النيوكليويد، والحصول على صورة ذات لونين SR-SIM من نفس مجال الرؤية: قناة واحدة لتلطيخ الميتوكوندريا وآخر لSG. تعيين قناة اللون الأول المناسب لوصمة عار الميتوكوندريا المستخدمة (على سبيل المثال، لبقعة الميتوكوندريا الحمراء البعيدة، تعيين الإثارة في 633 نانومتر أو أكثر ومرشح الانبعاثات longpass 650 نانومتر). بالنسبة لإشارة SG، قم بتعيين الإثارة على 488 نانومتر وفلتر انبعاثات بانباس 500-550 نانومتر.
  9. باستخدام البرنامج، تعيين أدنى قوة ليزر ممكن لكلا 488 نانومتر وخطوط وصمة عار حمراء بعيدة.
    ملاحظة: الإعداد النموذجي هو 1٪ ليزر انتاج الطاقة المعدلة من قبل acousto البصرية القابلة للتبضع مرشح (AOTF).
  10. إذا كان مجهر SIM يكتسب القنوات بشكل تسلسلي فقط (إعداد كاميرا واحدة)، فقم بإيقاف تشغيل قناة اكتشاف البقع الحمراء البعيدة.
  11. تعيين الحصول على مستوى بؤري واحد عن طريق إيقاف تشغيل اقتناء Z-stack عن طريق إلغاء تحديد مربع Z-Stack في البرنامج.
  12. تعيين أقصر وقت ممكن التعرض الكاميرا EM-CCD.
  13. تعيين ثلاثة دوران للشبكة بدلا من خمسة دوران.
  14. لزيادة معدل الإطار، في علامة التبويب اقتناء البرنامج، تعيين الكاميرا لقراءة البيانات فقط من المنطقة المركزية من استشعار الكاميرا بدلا من"رقاقة كاملة".
    ملاحظة: على سبيل المثال، يسمح التحول من قراءة مساحة 1000 × 1000 بكسل بمستشعر كامل إلى قراءة 256 × 256 بكسل فقط بتقليل وقت التعرض للكاميرا من 50 مللي ثانية إلى 13.4 مللي ثانية ووقت الإطار الإجمالي من 1.8 ثانية إلى 1.2 ثانية. إذا تم قراءة جزء مركزي فقط من مستشعر الكاميرا ، فسيكون مجال الرؤية صغيرًا جدًا لهدف 63x أو 100x المستخدم عادةً لـ SR-SIM. وسيؤدي قصر وقت التعرض إلى تقليل نسبة الإشارة إلى الضوضاء في الصور.
  15. تحسين طاقة الليزر ووقت التعرض للكاميرا: احصل على صور ذات أبعاد ثنائية (2D) لخلايا تحمل علامة SR-SIM (2D) في العديد من قيم طاقة الليزر (على سبيل المثال، 0.5٪، 1٪، 1.5٪، 2٪) وعدة مرات التعرض (على سبيل المثال، 13.4 مللي ثانية، 25 مللي ثانية، 50 مللي ثانية).
  16. معالجة مجموعات بيانات SIM الخام (انظر الخطوة 3.1).
  17. اختر أوقات تعرض طاقة الليزر والكاميرا التي تنتج صور SIM مع نقاط مضيئة في الميتوكوندريا (أي النيوكليويدات) مع القليل من القطع الأثرية الناتجة عن معالجة SIM أو عدم وجودها. فحص المناطق خارج الميتوكوندريا (على سبيل المثال، 1٪ قوة ليزر الحالة الصلبة 488 نانومتر والتعرض 25 مللي ثانية من كاميرا EM-CCD).
  18. ابدأ في الحصول على سلسلة الفاصل الزمني باستخدام الإعدادات المحسنة في الخطوات 2.15-2.17.

3- معالجة البيانات وتحليلها

  1. معالجة مجموعات بيانات SIM الخام مع وحدة الإضاءة المنظمة من برنامج مناسب(جدول المواد):اختر خانة الاختيار التلقائية لمعلمات معالجة SIM. للمعالجة التلقائية لملفات متعددة، استخدم أداة معالجة الدُفعات، وفك تحديد استخدام التيار للدفعة،وانقر فوق تشغيل الدفعي وحدد ملفات متعددة لمعالجة بطاقة SIM.
  2. تحويل مجموعات البيانات سلسلة زمنية معالجة SIM إلى تنسيق ims مع برنامج محول الملفات Imaris (أي الإصدار المطابق لإصدار برنامج Imaris).
  3. افتح ملفًا محولًا في البرنامج (الإصدار 8.4.1 أو أحدث) يحتوي على ترخيص لوحدة النسب (أو المسار).
  4. بدء"البقع"إنشاء المعالج بالنقر فوق إضافة بقع جديدة رمز. سيتم تشغيل معالج للإنشاء.
  5. اختر علامة التبويب إنشاء المعالج.
  6. في الخطوة الأولى من المعالج، انقر فوق نقاط المسار (مع مرور الوقت) ثم انتقل إلى الخطوة الثانية من المعالج.
  7. تعيين قطر XY المقدر إلى 0.1-0.15 ميكرون، انقر فوق طرح الخلفية والمتابعة إلى الخطوة الثالثة.
  8. ضبط عتبة في مرشح"الجودة"عن طريق سحب الخط الرأسي في الرسم البياني بحيث يتم الكشف عن غالبية النيوكليويدات كـ "بقع"، في حين لا يتم الكشف عن القطع الأثرية (أي يتم وضع علامة على البقع المكتشفة ككرات متراكبة على الصورة). تحقق مما إذا كان هذا هو الحال على كل إطار وإعادة تعديل العتبة إذا لزم الأمر. انتقل إلى الرابع ثم إلى الخطوة الخامسة من المعالج.
  9. اختر خوارزمية الحركة التلقائية. تعيين المسافة القصوى إلى 0.5 ميكرون. تعيين حجم الفجوة القصوى إلى 0.
  10. ننظر في كل إطار في السلسلة الزمنية والتحقق مما إذا كان يتم رسمها أي مسارات كاذبة وإذا تم تقديم أي ثغرات بين المسارات (يتم وضع علامة على المسارات التي بناها المعالج مع الإعدادات الحالية على الفور كخطوط متراكبة على الصورة). ضبط"المسافة القصوى"إذا لزم الأمر. انتقل إلى الخطوة السادسة من المعالج. اختر عامل تصفية مدة المسار وحدد عتبة 3-5 s.
  11. إذا لم تكن البقع أو المسارات المكتشفة حاليًا مثالية، فعد إلى الخطوات السابقة للمعالج باستخدام أزرار التنقل (في أسفل إطار المعالج) اللازمة لضبط أي معلمة لإنشاء البقع أو المسارات.
  12. عندما تسمح المعلمات الدقيقة للبرنامج بالكشف عن جميع البقع وبناء المسارات بشكل صحيح، انقر فوق زر التنقل في السهم الأخضر في المعالج لتأكيد إنشاء المسارات.
  13. استخراج إحصائيات المسارات بالنقر فوق إطار رمز الإحصائيات. اختر معلمات الإحصائيات المطلوبة (علامات تبويب القيم التفصيلية والمتوسط تحت الإحصائيات)وقم بتصدير القيم كملفات CSV بالنقر فوق رمز محرك الأقراص المرن للقياس الكمي والتصور.
    ملاحظة: الحد الأقصى لسرعة المسار ، وسرعة المسار المتوسط ، وطول المسار ، وإزاحة المسار هي أمثلة على المعلمات المهمة.
  14. إذا كانت مجموعة بيانات الصور تحتاج إلى تقديم أو نشر، فقم بإنشاء لقطات و/أو ملفات فيديو تمثل سلسلة الفاصل الزمني مع مسارات متراكبة اختياريًا باستخدام أدوات اللقطة أو الرسوم المتحركة.

4. الحصول على صورة Confocal

  1. قم بتركيب حاضنة على خشبة المسرح على مرحلة المجهر، وحدد درجة الحرارة المطلوبة وتركيز ثاني أكسيد الكربون2 (أي 37 درجة مئوية و5٪ لخلايا الثدييات) والحفاظ على الدفء لمدة ساعة واحدة على الأقل قبل البدء في الحصول على الصورة.
  2. قم بتشغيل جميع مكونات مجهر المسح بالليزر البؤري، بما في ذلك الليزر، واتركه للإحماء لمدة ساعة واحدة على الأقل.
  3. اختيار الهدف المطلوب من منتصف إلى ارتفاع التكبير وأخذ العينات المكانية وفقا لمعايير Nyquist.
  4. بالنسبة لقناة SG، حدد الإثارة على 488 نانومتر ونطاق كشف يتراوح بين 500 و550 نانومترًا. لقناة البقعة الميتوكوندريا، تعيين إلى 561 نانومتر و 570-630 نانومتر الانبعاثات لصبغة حمراء، أو 633 نانومتر الإثارة و > 650 نانومتر الانبعاثات لصبغة حمراء بعيدة.
  5. تعيين أدنى طاقة ليزر ممكنة (عادة 1٪ أو أقل) التي تسمح بالحصول على الإشارات مع مكاسب كاشف PMT من 700 mV.
  6. الحصول على صور بؤرية لونين من الخلايا، حيث يتم الكشف عن النيوكليويدات الميتوكوندريا في "قناة SG" ويتم الكشف عن الميتوكوندريا في قناة "الأحمر" أو "الأحمر الأقصى".

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

توصيف تسمية الخلايا الحية مع SG
أولاً ، تميز توزيع SG في الخلايا عند الحضانة مع الصبغة عند تخفيفات مختلفة بالمجهر المحوري. بعد الحضانة مع تركيزات عالية من SG أو بيكوغرين، كل من الأصباغ وصفت في الغالب النوى وأظهرت تلطيخ punctate في السيتوبلازم(الشكل 1)،وبالمثل البيانات المنشورة لصبغة أخرى السيانين مشحونة بشكل إيجابي (أي بيكوغرين)15. ومع ذلك ، عند الحضانة مع SG في 1:10،000 تخفيف ، ظهر تلطيخ خافت في النوى ، بينما في ال...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هناك العديد من المكونات الحاسمة للبروتوكول: لتحقيق وضع العلامات التفضيلية للحمض النووي الميتوكوندريا ، يجب أن يبقى تركيز صبغة الحمض النووي الملزمة أثناء الحضانة منخفضًا جدًا (على سبيل المثال ، تمييع 1:10000 من مخزون تجاري نموذجي) ، وينبغي أن يكون وقت الحضانة 30 دقيقة. يجب ألا يتجاوز وقت الحضانة 1 ح. يجب استخدام صبغة الذهب SYBR؛ الأصباغ الأخرى الملزمة للحمض النووي ليست مشرقة بما يكفي لتوليد إشارة قوية عند وضع العلامات على تركيز منخفض.

الحد من بروتوكول لدينا هو أن يتم غسلها من الصبغة الميتوكوندر...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعترف المؤلفان بأسيفا أختار وأنجيليكا رامبولد (كل من معهد ماكس بلانك لعلم المناعة وعلم الوراثة اللاجينية) لتوفير خلايا هيلا.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Elyra PS1كارل زايسمجهر فائق الدقة متعدد الوسائط يحتوي على وحدة للفحص المجهري للإضاءة الهيكلية فائقة الدقة (SR-SIM)
ارتفاع نسبة الجلوكوز DMEMGIBCO / ThermoFisher31966021
طبق 35 مم ، قاع زجاجيIbidi Gmbh81158
ibidi 8-well microSlide ، قاع زجاجيIbidi Gmbh80827
Imaris 8.4.1Bitplane / Oxford Instrumentsحزمة برامج التصور
iXon 885Andor TechnologiesEMCCD مع مستشعر الإضاءة الخلفية
LSM880 AiryscanCarl Zeissمجهر متحد البؤر للمسح الضوئي بالليزر مع كاشف المصفوفة
Mitotracker CMXRos RedThermoFischerM7512الميتوكوندريا الحية ذات الخلية الحمراء وصمة عار
Mitotracker ديب ريد FMThermoFischerM22426بقعة الميتوكوندريا الحمراء الحية
بيكوGreenThermoFischerP7581خلية بقعة الحمض النووي
الدائمة خطة Apochromat 100x / 1.46 هدف الزيتكارل زايس
SYBR الذهبThermoFischerS11494خلية بقعة الحمض النووي
الدائمة Zen Black 2012 برنامجCarl Zeissبرامج الحصول على الصور ومعالجتها

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kaufman, B. A., et al. The mitochondrial transcription factor TFAM coordinates the assembly of multiple DNA molecules into nucleoid-like structures. Molecular Biology of the Cell. 18 (9), 3225-3236 (2007).
  2. Farge, G., et al. Protein sliding and DNA denaturation are essential for DNA organization by human mitochondrial transcription factor A. Nature Communications. 3, 1013(2012).
  3. Bogenhagen, D. F. Mitochondrial DNA nucleoid structure. Biochimica et Biophysica Acta. 1819 (9-10), 914-920 (2012).
  4. Kang, D., Kim, S. H., Hamasaki, N. Mitochondrial transcription factor A (TFAM): roles in maintenance of mtDNA and cellular functions. Mitochondrion. 7 (1-2), 39-44 (2007).
  5. Tauber, J., et al. Distribution of mitochondrial nucleoids upon mitochondrial network fragmentation and network reintegration in HEPG2 cells. International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 45 (3), 593-603 (2013).
  6. Garrido, N., et al. Composition and dynamics of human mitochondrial nucleoids. Molecular Biology of the Cell. 14 (4), 1583-1596 (2003).
  7. Pernas, L., Scorrano, L. Mito-Morphosis: Mitochondrial Fusion, Fission, and Cristae Remodeling as Key Mediators of Cellular Function. Annual Review of Physiology. 78, 505-531 (2016).
  8. Caielli, S., et al. Oxidized mitochondrial nucleoids released by neutrophils drive type I interferon production in human lupus. Journal of Experimental Medicine. 213 (5), 697-713 (2016).
  9. Okayama, S., Ohta, K., Higashi, R., Nakamura, K. Correlative light and electron microscopic observation of mitochondrial DNA in mammalian cells by using focused-ion beam scanning electron microscopy. Microscopy (Oxf). 63 (Suppl 1), i35(2014).
  10. Alan, L., Spacek, T., Jezek, P. Delaunay algorithm and principal component analysis for 3D visualization of mitochondrial DNA nucleoids by Biplane FPALM/dSTORM. European Biophysics Journal. 45 (5), 443-461 (2016).
  11. Kukat, C., et al. Super-resolution microscopy reveals that mammalian mitochondrial nucleoids have a uniform size and frequently contain a single copy of mtDNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (33), 13534-13539 (2011).
  12. Kukat, C., Larsson, N. G. mtDNA makes a U-turn for the mitochondrial nucleoid. Trends in Cell Biology. 23 (9), 457-463 (2013).
  13. Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
  14. Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nature Methods. 3 (10), 793-795 (2006).
  15. Benke, A., Manley, S. Live-cell dSTORM of cellular DNA based on direct DNA labeling. ChemBioChem. 13 (2), 298-301 (2012).
  16. Ishigaki, M., et al. STED super-resolution imaging of mitochondria labeled with TMRM in living cells. Mitochondrion. 28, 79-87 (2016).
  17. Waldchen, S., Lehmann, J., Klein, T., van de Linde, S., Sauer, M. Light-induced cell damage in live-cell super-resolution microscopy. Scientific Reports. 5, 15348(2015).
  18. Gustafsson, M. G., et al. Three-dimensional resolution doubling in wide-field fluorescence microscopy by structured illumination. Biophysical Journal. 94 (12), 4957-4970 (2008).
  19. Hirano, Y., Matsuda, A., Hiraoka, Y. Recent advancements in structured-illumination microscopy toward live-cell imaging. Microscopy (Oxf). 64 (4), 237-249 (2015).
  20. Brown, T. A., et al. Superresolution fluorescence imaging of mitochondrial nucleoids reveals their spatial range, limits, and membrane interaction. Molecular and Cellular Biology. 31 (24), 4994-5010 (2011).
  21. Lewis, S. C., Uchiyama, L. F., Nunnari, J. ER-mitochondria contacts couple mtDNA synthesis with mitochondrial division in human cells. Science. 353 (6296), aaf5549(2016).
  22. Dellinger, M., Geze, M. Detection of mitochondrial DNA in living animal cells with fluorescence microscopy. Journal of Microscopy. 204 (Pt 3), 196-202 (2001).
  23. Ban-Ishihara, R., Ishihara, T., Sasaki, N., Mihara, K., Ishihara, N. Dynamics of nucleoid structure regulated by mitochondrial fission contributes to cristae reformation and release of cytochrome c. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (29), 11863-11868 (2013).
  24. Zurek-Biesiada, D., et al. Localization microscopy of DNA in situ using Vybrant((R)) DyeCycle Violet fluorescent probe: A new approach to study nuclear nanostructure at single molecule resolution. Experimental Cell Research. 343 (2), 97-106 (2016).
  25. He, J. Y., et al. The AAA(+) protein ATAD3 has displacement loop binding properties and is involved in mitochondrial nucleoid organization. Journal of Cell Biology. 176 (2), 141-146 (2007).
  26. Ashley, N., Harris, D., Poulton, J. Detection of mitochondrial DNA depletion in living human cells using PicoGreen staining. Experimental Cell Research. 303 (2), 432-446 (2005).
  27. Jevtic, V., Kindle, P., Avilov, S. V. SYBR Gold dye enables preferential labeling of mitochondrial nucleoids and their time-lapse imaging by structured illumination microscopy. PLoS One. 13 (9), e0203956(2018).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Mitochondrial NucleoidsSYBR GoldStructured Illumination MicroscopyLive Cell ImagingTime lapse ImagingFluorescent DyeMitochondrial DNASuper resolution MicroscopyNucleoid TrackingCell Culture

Related Articles