يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

الخلايا الجذعية المشتقة الفيروسية Ag محددة T الخلايا الليمفاوية قمع النسخ المتماثل HBV في الفئران

6.8K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/60043

⸱

سبتمبر 25, 2019

 ,  ,  , 
1Department of Microbial Pathogenesis and Immunology, Texas A&M University Health Science Center, 2Department of Ophthalmology, Harvard Medical School

في هذه المقالة

ملخص

يعرض هنا بروتوكول للقمع الفعال لفيروس التهاب الكبد B (HBV) النسخ المتماثل في الفئران باستخدام نقل الخلايا بالتبني (ACT) من الخلايا الجذعية المشتقة من الخلايا الجذعية مستضد الفيروسي (Ag) محددة T الخلايا الليمفاوية. يمكن تكييف هذا الإجراء للعلاج المناعي المحتمل القائم على ACT للعدوى بفيروس التهاب الكبد V.

الملخص

عدوى فيروس التهاب الكبد B هي قضية صحية عالمية. مع إصابة أكثر من 350 مليون شخص في جميع أنحاء العالم، لا تزال عدوى فيروس التهاب الكبد V السبب الرئيسي لسرطان الكبد. وهذا مصدر قلق كبير، لا سيما في البلدان النامية. فشل الجهاز المناعي في تركيب استجابة فعالة ضد فيروس التهاب الكبد V يؤدي إلى العدوى المزمنة. وعلى الرغم من وجود لقاح فيروس التهاب الكبد B ويجري إنشاء أدوية جديدة مضادة للفيروسات، فإن القضاء على خلايا خزان الفيروس لا يزال موضوعاً صحياً رئيسياً. يرد موضح هنا طريقة لتوليد مستضد فيروسي (Ag) محدد CD8+ الخلايا الليمفاوية T السامة للخلايا (CTLs) المستمدة من الخلايا الجذعية متعددة القوى المستحثة (iPSCs) (أي iPSC-CTLs)، والتي لديها القدرة على قمع النسخ المتماثل HBV. يتم إجراء النسخ المتماثل للفيروس HBV بكفاءة في الفئران من خلال الحقن الهيدرودينامي لبلازميد تعبير HBV، pAAV/HBV1.2، في الكبد. ثم، يتم نقل سطح HBV Ag-Specific الماوس iPSC-CTLs بالتبني، مما يمنع إلى حد كبير النسخ المتماثل HBV في الكبد والدم، فضلا عن يمنع HBV التعبير Ag سطح في خلايا الكبد. يوضح هذا الأسلوب النسخ المتماثل HBV في الفئران بعد الحقن الهيدرودينامي وأن الخلايا الجذعية المشتقة من الخلايا الجذعية الفيروسية Ag-Specific CTLs يمكن منع النسخ المتماثل HBV. يوفر هذا البروتوكول طريقة مفيدة للعلاج المناعي HBV.

المقدمة

بعد العدوى الحادة، يتحكم الجهاز المناعي التكيفي (أي الحصانة الفكاهية والخلوية) في الجزء الأكبر من التهاب الكبد الوبائي الحاد المرتبط بـ HBV. ومع ذلك، لا يستطيع عدد من الناس في المناطق الموبوءة بفيروس التهاب الكبد الحلقي V القضاء على الفيروسات ثم تحويلها كأفراد مزمنين. أكثر من 25٪ من المرضى المزمنين (>250 مليون شخص) في جميع أنحاء العالم تطوير مرض الكبد التدريجي، مما أدى إلى تليف الكبد و / أو سرطان الخلايا الكبدية (HCC)1. ونتيجة لذلك، لا يزال القضاء على الخلايا المصابة بإصرار يمثل مشكلة صحية عامة، على الرغم من وجود لقاح متاح2 ويجري تطوير العديد من الأدوية المضادة للفيروسات. يشمل العلاج القياسي لعدوى فيروس التهاب الكبد متعدد السنوات IFN-α، والنيوكليوزيد، ونظائرها النيوكليوتيدات. هذه العوامل لديها نشاط مضاد للفيروسات مباشرة وقدرات التحوير المناعي. ومع ذلك، يظهر التحويل المصلي لمستضد HBe (Ag)+ الناقلين مع الأجسام المضادة للحمض الهيدروكلوريك (Ab) وفقدان حمض الديوكسيريبونوكليك المصلي بشكل فردي في حوالي 20٪ من المرضى المعالجين، والسيطرة المناعية الكاملة للفيروس التحقق من الحرمان من HBsAg لا يزيد عن 5٪3. وعلاوة على ذلك، فإن الاستجابة للعلاج في كثير من الأحيان ليست دائمة. التطعيم الوقائي مع HBs Ag المؤتلف فعال للغاية في الوقاية من العدوى، ولكن التطعيم العلاجي HBs Ag غير فعال. ومن الواضح أن الاستجابات المناعية التي تتوسط فيها الخلايا T تلعب دوراً حاسماً في السيطرة على عدوى فيروس التهاب الكبد V وضعف الكبد. ومع ذلك، في مرضى التهاب الكبد المزمن، وغالبا ما يتم حذف خلايا T HBV التفاعلية، مختلة وظيفيا، أو تحويل استنفدت4،5،6. وبالتالي، في الأفراد المصابين بعدوى فيروس التهاب الكبد متعدد الكلور المستمر، لم تنجح أي محاولات لإعادة المناعة الخاصة بفيروس التهاب الكبد الفيروسي (أي الحصانة القائمة على الخلايا T) عن طريق العلاج المضاد للفيروسات، أو السيتوكينات المناعية، أو التحصين العلاجي.

نقل الخلايا بالتبني (ACT) من خلايا T Ag Ag هو علاج فعال موجهة للقضاء في نهاية المطاف على الخلايا الكبدية المتبقية wih HBV7،8. وقد تبين أن إصابة الفئران المصابة بفيروس التهاب الكبد الوبائي تسبب التهاب الكبد الوبائي العابر والمعتدل، وانخفاض كبير في نسخ حمض الريبونوكليك (RNA) في خلايا الكبد. في هذه الدراسات، لم تمنع CTLs نسخ جينات التهاب الكبد V ولكنها عززت تدهور نصوص فيروس التهاب الكبد1 9. الـ HBV CtLs مهم لمنع العدوى الفيروسية والتوسط لإزالة فيروس التهاب الكبد10و11. بالنسبة للعلاجات المستندة إلى ACT، اقترح التوسع في المختبر لخلايا T الخاصة بـ HBV مع تفاعل عال لإعادة التوطين في الجسم الحي لتكون طريقة مثالية12،13،14؛ ومع ذلك، فإن النهج الحالية مقيدة فيما يتعلق بقدراتها على توليد وفصل وزراعة الكميات والصفات المناسبة من الخلايا T الخاصة بفيروس التهاب الكبد الغذائي من المرضى للعلاجات المحتملة.

على الرغم من أن التجارب السريرية تقدم السلامة، وإمكانية التطبيق العملي، والنشاط العلاجي المحتمل للعلاجات القائمة على الخلايا عن طريق الخلايا T المهندسة التي هي محددة لخلايا الكبد المصابة بفيروس التهاب الكبد، وهناك مخاوف بشأن الآثار غير المواتية التي تحدث من استجابات المناعة الذاتية بسبب التفاعل المتبادل من مستقبلات الخلايا T الاقتران (TCR)15،16، خارج الهدف Ag الاعتراف من قبل TCR غير محددة17 وعلى الهدف خارج السمية من قبل مستقبلات Ag chimeric (CAR) 18 سنة , 19 مع الأنسجة الصحية. حاليا، الخلايا T المعدلة وراثيا، والتي لديها فقط استمرار على المدى القصير في الجسم الحي، وعادة ما تكون متوسطة أو في وقت لاحق الخلايا T. حتى الآن، الخلايا الجذعية متعددة القوى (PSCs) هي المصدر الوحيد المتاح لتوليد أعداد عالية من الخلايا T من نوع واحد Ag السذاجة20،21،22،23. يتم تحويل PSCs المستحثة (iPSCs) ببساطة من الخلايا الجسدية للمريض من خلال استخدام تحويل الجينات من عدة عوامل النسخ. ونتيجة لذلك، فإن الـ iPSCs لها خصائص مماثلة لخصائص الخلايا الجذعية الجنينية (ESCs)24. بسبب المرونة والإمكانية للقدرة اللانهائية على التجديد الذاتي، بالإضافة إلى استبدال الأنسجة، يمكن تطبيق العلاجات المستندة إلى iPSC على نطاق واسع في الطب التجديدي. وعلاوة على ذلك، فإن الأفواج التي تقوم عليها هذه المراكز قد تحسن إلى حد كبير العلاجات الحالية القائمة على الخلايا.

والهدف العام لهذه الطريقة هو توليد كمية كبيرة من CTLs الخاصة بفيروس التهاب الكبد متعدد الكلور من iPSCs (أي iPSC-CTLs) للعلاج المناعي القائم على ACT. المزايا على التقنيات البديلة هي أن HBV محددة iPSC-CTLs لديها TCR من نوع واحد والنمط الظاهري السذاجة، مما يؤدي إلى مزيد من الذاكرة T خلية التنمية بعد ACT. ومن الواضح أن ACT من فيروس التهاب الكبد CV محددة iPSC-CTLs يزيد من هجرة خلايا CD8+ T وظيفية في الكبد ويقلل من النسخ المتماثل HBV في كل من الكبد والدم من الفئران تدار. هذه الطريقة تكشف عن إمكانية استخدام الفيروسية Ag محددة iPSC-CTLs للعلاج المناعي HBV ويمكن تكييفها لتوليد خلايا أخرى الفيروسية Ag محددة iPSC-T للعلاج المناعي الفيروسي.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

تتم الموافقة على جميع التجارب الحيوانية من قبل لجنة رعاية الحيوانات في جامعة تكساس A&M (IACUC; #2018-0006) ويتم إجراؤها وفقا للمبادئ التوجيهية لرابطة تقييم واعتماد العناية بالحيوانات المختبرية. يتم استخدام الفئران خلال 6-9 أسابيع من العمر.

1. توليد خلاياCD8 وT الفيروسية الخاصة بAg من iPSCs (iPSC-CD8+ الخلايا T)

  1. إنشاء المنشآت الرجعية
    ملاحظة: ترتبط جينات TCR α وβ بتسلسل 2A الذاتي الشق. ناقلات الفيروسات الرجعية MSCV-IRES-DsRed (MiDR) هو DsRed+ 23.
    1. [سوب-ريبّر] [هبس]183-191 ([فلّتريلتي]) [ا-سوبّوند] [أ2-سوبّوند] [هووس-مورين] هجين [تّر] ([س183] [تكر]) مورثات ([ف33] و [فه28]) داخل ال [مندر] أن يخلق ال [س183] [ميدر] بناء(الشكل 1[ا])25.
  2. الانتراب الفيروسي
    ملاحظة: تستخدم خلايا Platinum-E (Plat-E) في تغليف الفيروسات الرجعية (التي تحمل جينات S183 TCR)، والتي سيتم استخدامها في الترانسدوكتيون. خلايا Plat-E هي خلايا التعبئة والتغليف الرجعية فعالة الكامنة وراء الخلايا 293T, التي تم تطويرها عن طريق بنيات التعبئة والتغليف فريدة من نوعها عن طريق المروج EF1α للتعبير عن البروتين بنية الرجعية, بما في ذلك هفوة, بول, وenv ecotropic.
    1. على طبق ثقافة 100 مم، البذور 3 × 106 خلايا Plat-E في 8 مل من DMEM ثقافة المتوسطة التي تحتوي على 10٪ مصل العجل الجنين (FCS) في حاضنة في 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2، 1 يوم قبل الانعراض.
    2. في اليوم 0، transfect s183 MiDR بناء في خلايا Plat-E باستخدام كاشف الحمض النووي transfection25.
    3. في اليوم الأول، البذور 1 × 106 iPSCs (GFP+) في لوحة ثقافة الجيلاتين المغلفة مسبقا.
    4. في الأيام 2-3، جمع الفيروسات الرجعية التي تحتوي على supernatant من ثقافة الخلية Plat-E لتبديل iPSCs مع S183 TCR في وجود 1,6-dibromohexane الحل25.
    5. في اليوم 4، trypsinize s183 TCR الجينات المنقولة iPSCs، الطرد المركزي في 400 × ز لمدة 5 دقائق والبذور 3 × 105 iPSCs في طبق ثقافة 100 مم المغلفة مسبقا مع 3 × 10 6 206/7 (irSNL76/7) خلايا التغذية25.
    6. في اليوم 5 أو 6 من التقاء، trypsinize الخلايا، الطرد المركزي في 400 × ز لمدة 5 دقائق وعملية لفرز الخلايا. التطفل على الخلايا الحية، وفرز GFP وDsRED الخلايا المزدوجة الإيجابية (s183 TCR الجينات التي تنتقل عن طريق الجينات iPSCs) باستخدام فارز الخلايا عالية السرعة. على غرار الخطوة 1.2.5، شارك في زراعة الخلايا التي تم فرزها على خلايا التغذية irSNL76/7 للاستخدام في المستقبل25.
  3. تمايز خلايا iPSC-CD8+ T الخاصة بـ HBV
    ملاحظة: يمكن للخلايا سترومال OP9-DL1/DL4 overexpress كل من الشق ligands DL1 و DL4، وiPSCs المشاركة في الزراعة مع iPSCs يمكن تعزيز الشق الإشارات بوساطة T خلية التمايز26.
    1. تنمو s183 TCR الجينات المستحثة iPSCs (s183/iPSCs) في أحادية الخلية OP9-DL1-DL4 في وسائل الإعلام المتوسطة الأساسية α-الحد الأدنى (MEM) التي تحتوي على 20٪ مصل البقر الجنيني (FBS)27. إدراج murine Flt3 ligand (mFlt-3L؛ التركيز النهائي = 5 نانوغرام/مل) في الثقافة.
    2. في اليوم 0، البذور 0.5-1.0 × 105 S183/iPSCs في طبق ثقافة 10 سم نمت سابقا مع خلايا OP9-DL1-DL4. التحقق من أن الخلايا OP9-DL1-DL4 في حالة من الملاءمة 80-90%.
    3. في اليوم 5، شطف iPSCs مع 10 مل من الفوسفات المخزنة مؤقتا المالحة (PBS)، يستنشق قبالة PBS، إضافة هذا إلى 4 مل من 0.25٪ تريبسين، وحضانة في حاضنة 37 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة. تتراكم جميع الحلول الهضمية التي تحتوي على الخلايا والطرد المركزي في 400 × ز لمدة 5 دقائق في 15-30 درجة مئوية.
    4. قم بإستقان الخلايا الفائقة وإعادة تعليقها في 10 مل من وسائل الإعلام iPSC. نقل تعليق الخلية إلى لوحة بيتري 10 سم جديدة وحضانة في حاضنة لمدة 30 دقيقة في 37 درجة مئوية.
    5. بعد 30 دقيقة، جمع وسائط iPSC التي تحتوي على الخلايا العائمة. تمرير تعليق الخلية من خلال مصفاة خلية 70 ميكرومتر وحساب رقم الخلية.
    6. البذور 5 × 105 خلايا في طبق الثقافة نمت سابقا خلايا OP9-DL1-DL4 مع حالة من 80٪ -90٪ مترافق كما هو موضح في الخطوة 1.3.1.
      ملاحظة: تمايز الخلايا T كل 2-3 أيام الخلايا المشتقة من iPSC تحتاج إلى إعادة البذور مع طبقة جديدة من الخلايا OP9-DL1-DL4.
  4. التقييم
    1. التغيرات المورفولوجية للمركبات iPSCs المُنَمَلّة
      1. مراقبة الخلايا تحت المجهر في أيام مختلفة.
        ملاحظة: بحلول اليوم 5، المستعمرات لها خصائص تشبه mesoderm، وتظهر مورفولوجيا كلاسيكية على شكل المغزل تشبه الخلايا الليفية الجلدية البشرية والنمو المستدام في المختبر. بحلول اليوم 8، تبدأ مجموعات صغيرة مستديرة من الخلايا في الظهور.
    2. تحليل iPSCs المختلفة عن طريق قياس التدفق
      1. في أيام مختلفة من الثقافة المشتركة، وتحليل الخلايا المشتقة من iPSC كما هو موضح سابقا25 (الشكل 1B، C).
    3. التحليل الوظيفي للمراكز المتوسطة من أجل الصحة والإدارة للإعلام المُمَرَفَلة
      1. في اليوم 28 من الثقافة المشتركة، وجمع الخلايا iPSC-CD8+ T من الثقافات من خلال حصاد الخلايا العائمة، trypsinize الخلايا المتبقية مع 0.25٪ تريبسين، إعادة تعليق في 8 مل من وسائل الإعلام iPSC، الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 400 × ز في 15-30 درجة مئوية، وإزالة وسائل الإعلام، ثم إعادة تعليق الخلايا في 10 مل من وسائل الإعلام.
      2. احتفظ بالخلايا المعاد تعليقها في طبق طازج بحجم 10 سم في حاضنة بزاوية 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة ولتجميع الخلايا العائمة. ثم شطف الخلايا مرة واحدة مع PBS الباردة.
      3. احتضان 3 × 106 T الخلايا المستنفدة splenocytes (CD4-CD8-) من الطحال من الفئة H-2 I بالضربة القاضية، HLA-A2.1-المعدلة وراثيا (HHD) الفئران مع 5 ميكرومتر s183 الببتيد (FLLTRILTI) في 200 ميكرولتر من وسائل الإعلام في 4 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
      4. إنتاج خليط من الخلايا iPSC-CD8+ T مع الخلايا البراقة النبضية مع الببتيد s183 (الخلايا T: الخلايا الصفرة = 1:4؛ استخدام 0.75 × 106 خلايا T). احتضان خليط من الخلايا في 37 درجة مئوية في حاضنة CO2 لمدة 40 ساعة. خلال آخر 7 ساعة، إضافة 4 ميكرولتر من بريفيلدين A المخففة في الثقافة (التركيز النهائي من 1000x، والتي سيتم تخفيفها في وسائل الإعلام ثقافة 1X) لمنع عمليات النقل أثناء تنشيط الخلية.
      5. وصمة عار الخلايا وإجراء تحليل التدفق الخلوي من IFN-γ داخل الخلايا كما هو موضح سابقا(الشكل 2).

2- الحث على تكرار فيروس التهاب الكبد B من خلال التسليم الهيدرودينامي لبلازميد HBV

ملاحظة: تم إنشاء pAAV/HBV1.2 كما هو موضح مسبقًا9. يتم دمج الحمض النووي الكامل HBV 1.2 في pAAV المتجه.

  1. الشحنات الهيدروديناميكية من بلازميد HBV من خلال الوريد الذيل
    1. تسخين الفئران HHD باستخدام مصباح الحرارة لمدة 5 دقائق في القفص من أجل مد الوريد الذيل.
    2. احتجاز الحيوان عن طريق مقيد، وذيول الماوس نظيفة مع رذاذ الإيثانول 70٪.
    3. تسليم البلازميد في الكبد.
    4. قياس وزن جسم الماوس باستخدام مقياس قياس.
    5. تخفيف 10 ميكروغرام من بلازميد HBV في ما يعادل 8٪ من كتلة الجسم PBS (على سبيل المثال، 1.6 مل للماوس 20 غرام). تحميل بلازميد المخفف في حقنة 3 مل مع 26 G × 1×2"(0.45 × 12 ملم) إبرة تحت الجلد.
    6. حدد موقع أحد الأوردة الخلفية الجانبية في الثلث الأوسط من الذيل ووضع الإبرة في أي من الوريد الجانبي. إدارة الحقن التي تحتوي على بلازميد HBV من خلال الوريد الذيل في غضون 3 - 5 s.
  2. القياس الكمي لفيرميا من مصل الدم للفئران المصابة
    ملاحظة: يحدث النسخ المتماثل HBV من اليوم 3-35 في مصل الماوس. يُعد ّ نسخ الحمض النووي ذروته في اليوم السابع ويقلل تدريجيًا. لا يتم مسح الحمض النووي HBV من المصل حتى اليوم 35.
    1. جمع مصل الدم من الفئران المصابة
      1. جمع ما يقرب من 0.1 مل من الدم في أنبوب الطرد المركزي الصغير من كل فأر في 3، 5، 7، و 10 أيام بعد العدوى عن طريق نزيف الرجعية المدارية في أنبوب الطرد المركزي الصغير 1.5 مل، ثم احتضان في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 20 دقيقة.
      2. طرد مركزي العينة في 6000 × ز لمدة 15 دقيقة في 4 درجة مئوية وجمع supernatant المصل بعد الطرد المركزي.
    2. تنقية الحمض النووي من مصل الدم باستخدام مجموعة استخراج الحمض النووي المتاحة تجاريا بناء على توصيات الشركة المصنعة. وباختصار، تسى الخلايا في عمود يستند إلى السيليكا، وأداء الغسل، واستخراج الحمض النووي عن طريق إضافة الإيثانول 100٪ إلى عمود elution والطرد المركزي في 6000 × ز لمدة 1 دقيقة.
    3. استخدام 100 نانوغرام من الحمض النووي HBV من elution لتحليل PCR في الوقت الحقيقي. استخدام التمهيديات التالية وتحقيقات: إلى الأمام 5 'TAGGAGGCTGTGTAATAAtTGG 3 '؛ عكس 5 'GCACAGCTTGGAGGCTTGT 3 '؛ التحقيق 5 'TCACCTCTGCCTAATC 3'.
      1. استخدام جينوم HBV المحتوي على بلازميد (pAAV/HBV1.2) للمنحنى القياسي وإجراء PCR في الوقت الحقيقي في حجم إجمالي قدره 10 ميكرولتر(الشكل 3).
    4. إعداد تفاعل PCR في حجم إجمالي قدره 10 ميكرولتر كما هو موضح في الجدول 1.
    5. إعداد برنامج PCR في الدراجات الحرارية كما هو موضح في الجدول 2. معدل الانتقال إلى درجة الحرارة المبرمجة هو 20 درجة مئوية / ث لإزالة النضريز / الصلب و 5 درجة مئوية / ث للتمديد. قياس الفلورة في نهاية مرحلة الصلب لكل دورة لرصد PCR في الوقت الحقيقي.

3. الحد من النسخ المتماثل HBV عن طريق ACT من الخلايا الفيروسية Ag محددة iPSC-CD8+ T

  1. نقل الخلايا بالتبني (ACT)
    1. تمييز s183/iPSCs (1.3.7) على الخلايا سترومال OP9-DL1-DL4 في وجود mFlt-3L و mIL-7 لمدة 8 أيام على النحو المبين في القسم 1.3.
    2. في اليوم 22، جمع الخلايا iPSC-CD8+ T من لوحة 10 سم مع التربسين، ثم يغسل ويعلق كل لوحة 10 سم في 10 مل من وسائل الإعلام الطازجة. إضافة الخلايا إلى لوحة 10 سم جديدة والعودة إلى الحاضنة لمدة 30 دقيقة كما هو الحال في القسم 1.3. بعد 30 دقيقة، وجمع الخلايا العائمة.
    3. استخدام مصفاة النايلون 70 م لتمرير الخلايا للقضاء على مجموعات الخلايا وعد رقم الخلية. تكييف الخلايا إلى تركيز 1.5 × 107 خلايا / مل في حل PBS الباردة واستخدام مصفاة النايلون 70 م لتمرير الخلايا للقضاء على مجموعات الخلايا مرة أخرى إذا لزم الأمر. إبقاء الخلايا على الجليد حتى ACT.
    4. حقن تعليق الخلايا 200 ميكرولتر (3 × 106 خلايا) في 4-6 أسابيع من العمر الفئران HHD من خلال الوريد الذيل.
  2. تحريض النسخ المتماثل للفيروس التهاب الكبد V
    1. في اليوم 14 بعد نقل الخلية، قم بإجراء التسليم الهيدرودينامي لبلازميد HBV من خلال الوريد الذيل كما هو موضح في القسم 2.1.
  3. الكشف عن بروتين الفيروس من الكبد المصاب
    1. التضحية الفئران في الأيام 3 و 5 و 7 و 14 و 21 بعد العدوى. للقتل الرحيم، في كل قفص، استخدم 1-2 لتر من ثاني أكسيد الكربون (CO2)في المرحلة الأولى. عندما يتطور الحيوان فقدان الوعي، كسب معدلتدفق ثاني أكسيد الكربون حول 4-5 لتر / دقيقة.
    2. فصل الكبد عن طريق قطع الجلد السطحي من البريطون باستخدام مقص وملقط وسحب قليلا الكبد مرة أخرى للكشف عن بطانة الجلد الداخلية تجويف البريكوني. جمع وقطع عينات الكبد (طول × عرض × ارتفاع = 0.5 سم × 0.5 سم × 0.3 سم) من الفئران المصابة لتناسب بسهولة في شريط التضمين وكتلة في 10٪ محايدة العازلة فورمالين لمدة 4-24 ساعة.
    3. الشارات عينات الكبدباستخدام 2.5 M حمض الفورميك؛ شطف في الزيلين لمدة 3 دقائق، شطف 2X في 100٪ الإيثانول، شطف 2X في 95٪ الإيثانول، شطف 2X في الماء منزوع الأيونات (DI) لمدة 2 دقيقة، ثم decalcify عينات الكبد في 1 m حمض الإيثيلينديامينيتيتيك (EDTA) في المقابل. التعامل مع في درجة حرارة شبه الغليان (90 درجة مئوية) لمدة 20 دقيقة.
    4. تبريد أنسجة الكبد الثابتة لمدة 30 دقيقة. تجفيف الأنسجة في سلسلة من تركيزات متزايدة من الإيثانول لتحل محل الماء، ومن ثم تزج في الغمر الزيلين. تضمين الأنسجة المتسللة في كتل الشمع. جعل بالتساوي عمودي وأفقي المقطع للتلطيخ. إعداد 4 أقسام ميكروتومي مع ميكروتومي انزلاق.
    5. تمرير المقاطع من خلال deparaffinization والإماهة باستخدام الزيلين والإيثانول، ثم تنفيذ تلطيخ الفلورسنت المناعي من الأقسام.
    6. وصمة عار المقاطع مع 200 درجة مئوية من سطح HBV Ag-Specific الأجسام المضادة (1:100 تخفيف في حل حظر). قم باحتضان الأقسام مع الجسم المضاد لمدة 2 ساعة في RT في غرفة رطبة بنسبة 75%-100%، واغسل 5x في 1x PBS لمدة 5 دقائق.
    7. استخدم كاشفمضاد للتلاشي يحتوي على 4'، 6-دياميدينو-2-فينيليندول (DAPI) للتلطيخ النووي لمكافحة وصمة عار الشرائح. إضافة غطاء مع حوالي 300 درجة مئوية من محلول تلطيخ DAPI المخفف (300 nM في 1X PBS) والتحقق من صحة غطاء كامل تغطية. إبقاء الشرائح في الظلام في 4 درجة مئوية حتى التفتيش تحت المجهر الفلورسنت.
  4. تسلل الخلايا الالتهابية في الفئران المصابة
    1. التضحية الفئران كما هو موضح في الخطوة 3.3.1. جمع الكبد وجعل المقاطع كما هو موضح في الخطوة 3.3.4.
    2. وصمة عار القسم مع هيماتوكسيلين ويوسين (H & E) لتقييم تسلل الخلايا الالتهابية في الكبد.
    3. تخزين الشرائح في الظلام في 4 درجة مئوية حتى مزيد من التحليل تحت المجهر الفلورسنت.
    4. تصور الشرائح تحت المجهر الفلوري للكشف عن تسلل الخلايا الالتهابية إلى الكبد(الشكل 4).
  5. الكشف عن الحمض النووي HBV الكبد المصاب
    1. عزل الحمض النووي الفيروسي.
    2. قتل الفئران وجمع عينات الكبد وفقا للقسم 3-3.
    3. Lyse أنسجة الكبد في Nonindet P-40 (NP-40) الليسيس العازلة (50 mM Tris-HCL، 1 MM EDTA، 1٪ NP-40) التي تحتوي على كوكتيل مثبطات البروتياز.
    4. لفترة وجيزة الطرد المركزي في 16،000 × ز لإزالة النوى والحطام الخلية.
    5. احتضان السيتوبلازممع مع النوكسيال المجهري (نوكليس S7؛ 150 وحدة / مل) وCaCl2 (5 MM) في 37 درجة مئوية لمدة 90 دقيقة لتحلل حمض النوى خارج النوى (NC).
    6. تعطيل nuclease S7 بإضافة 10 MM EDTA.
    7. يعجل النوكليوكابسيس مع البولي ايثيلين غليكول (PEG)، وتعطيل بنسبة 0.5٪ كبريتات دودسيل الصوديوم (SDS)، وهضم مع 0.6 ملغ / مل proteinase K (PK) في 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
    8. استعادة الأحماض النووية الفيروسية عن طريق استخراج الكلوروفورم الفينول وهطول الأمطار الإيثانول.
    9. حل الحمض النووي الفيروسي المستخرج على هلام أغاروز 1.2٪ والكشف عن طريق تحليل وصمة عار الجنوبية القياسية باستخدام32 P-المسمى HBV الحمض النووي التحقيق.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

كما هو موضح هنا، يتم إنشاء خلايا HBV الفيروسية Ag-CD8-CD8+ T بواسطة نظام زراعة في المختبر. بعد ACT من هذه الفيروسية Ag-Specific iPSC-CD8+ T الخلايا منع إلى حد كبير النسخ المتماثل HBV في نموذج murine (ملف تكميلي 1). يتم نقل iPSC الماوس مع MIDR البنى الرجعية ترميز الجين الهجين HBV HCR الإنسان الماوس (HBs183-191محددة، S183)، ثم يتم زرع iPSCs التي يسببها الجينات مع خلايا OP9-DL1/DL4 التعبير عن ligands الشق (كل من DL1 و DL4) الجزيئات في وجود rFlt3L و rIL-7. في اليوم 28 من الثق...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

يقدم هذا البروتوكول أسلوب لإنشاء CTLs iPSC-CTLs خاص بـ Ag الفيروسية لاستخدامها كـ ACT لمنع النسخ المتماثل HBV في طراز murine. في عدوى فيروس التهاب الكبد الفيروسي المزمن، يشكل الجينوم الفيروسي كروموسوم صغير مستقر، الحمض النووي الدائري المغلق بشكل مشترك (cccDNA) الذي يمكن أن يستمر طوال عمر الخلايا الكبدية. استهداف إزالة الكروموسوم الصغير الفيروسي قد يؤدي إلى علاج عدوى فيروس التهاب الكبد الفيروسي المزمن. يستهدف العلاج المضاد للفيروسات الحالي النسخ العكسي للفيروس ولكنه نادراً ما يؤسس السيطرة المناعية على تكرار فيروس التهاب ا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

يشكر المؤلفون الدكتور آدم ج غيرينغ من معهد أبحاث مستشفى تورونتو العام على توفير الـ cDNA لـ HBs183-91 (s183) (FLLTRILTI)- الجينات الهجينة التي تم تقييدها من قبل الإنسان والمورين، والدكتور بي جير تشين من جامعة تايوان الوطنية لتوفيره pAAV/HBV 1.2 بناء. ويدعم هذا العمل من قبل المعهد الوطني للصحة منحR01AI121180، R01CA221867 و R21AI109239 إلى J. S.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
HHD الفئرانمعهد باستور ، باريس ، فرنساH-2 من الفئة الأولى بالضربة القاضية ، الفئران HLA-A2.1 المعدلة وراثيا (HHD)
iPS-MEF-Ng-20D-17RIKEN Cell BankAPS0001
SNL76 / 7ATCCSCRC-1049
OP9ATCCCRL-2749
pAAV / HBV1.2 البلازميدالدكتور باي جير تشين (مستشفى جامعة تايوان الوطنية ، تايوان)بناء الحمض النووي HBV
HBs183-91 (s183) (FLLTRILTI) جينات TCR الخاصةالدكتور آدم جيه جيرينج (معهد أبحاث مستشفى تورنتو العام ، تورنتو ، كندا) جيناتTCR الهجينة المقيدة ب A2 الخاصة ب FLLTRILTI (V & alpha ؛ 34 و V & beta ؛ 28)
OVA257 &ndash ؛ 264 جينا محددا ل TCRالدكتور داريو أ. فيجنالي (جامعة بيتسبرغ ، بنسلفانيا)جينات TCR المقيدة ب H-2Kb الخاصة ب SIINFEKL
الأجسام المضادةBiolegend100236
الأجسام المضادة المضادة ل CD44 (IM7)BD Pharmingen103012
الأجسام المضادةBiolegend100408
المضادة ل CD8 (53-6.7) Biolegend100732
مكافحة IFN-& جاما; (XMG1.2) الجسم المضادBiolegend505810
الأجسام المضادة لعامل نخر الورم الورم (MP6-XT22)Biolegend506306
& alpha ؛ -MEMInvitrogenA10490-01
الأجسام المضادة ل HBsالحرارية فيشرMA5-13059
ACK عازلة التحللLonza10-548E
Brefeldin ASigmaB7651
DMEMInvitrogenABCD1234
FBSHycloneSH3007.01
FACSria Fusion Cell فارزBD656700
الجيلاتينMilliporeSigmaG9391
GeneJammerAgilent204130
HLA-A201-HBs183-91-PE PentamerProimmuneF027-4A - 27
HRP الأجسام المضادة الثانوية المضادة للفئرانInvitrogenA27025
mFlt-3LPeprotech250-31L
mIL-7Peprotech217-17
Nuclease S7Roche10107921001
ParaformaldehydeMilliporeSigmaP6148-500Gتحذير: مسببات الحساسية ، مسرطنة ،
عازلة نفاذيةBiolegend421002
PolybreneMilliporeSigma107689
ProLong & trade ؛ حامل الذهب المضاد للبهتان مع DAPIInvitrogenP36931
QIAamp MinElute Virus Spin KitQiagen57704
سامة

المراجع

  1. Scaglione, S. J., Lok, A. S. Effectiveness of hepatitis B treatment in clinical practice. Gastroenterology. 142 (6), 1360-1368 (2012).
  2. Osiowy, C. From infancy and beyond... ensuring a lifetime of hepatitis B virus (HBV) vaccine-induced immunity. Human Vaccines & Immunotherapeutics. 14 (8), 2093-2097 (2018).
  3. Gish, R. G., et al. Loss of HBsAg antigen during treatment with entecavir or lamivudine in nucleoside-naive HBeAg-positive patients with chronic hepatitis B. Journal of Viral Hepatitis. 17 (1), 16-22 (2010).
  4. Kurktschiev, P. D., et al. Dysfunctional CD8+ T cells in hepatitis B and C are characterized by a lack of antigen-specific T-bet induction. Journal of Experimental Medicine. 211 (10), 2047-2059 (2014).
  5. Fisicaro, P., et al. Antiviral intrahepatic T-cell responses can be restored by blocking programmed death-1 pathway in chronic hepatitis B. Gastroenterology. 138 (2), 682-693 (2010).
  6. Schurich, A., et al. The third signal cytokine IL-12 rescues the anti-viral function of exhausted HBV-specific CD8 T cells. PLoS Pathogens. 9 (3), 1003208(2013).
  7. Gehring, A. J., et al. Engineering virus-specific T cells that target HBV infected hepatocytes and hepatocellular carcinoma cell lines. Journal of Hepatology. 55 (1), 103-110 (2011).
  8. Xia, Y., et al. Interferon-gamma and Tumor Necrosis Factor-alpha Produced by T Cells Reduce the HBV Persistence Form, cccDNA, Without Cytolysis. Gastroenterology. 150 (1), 194-205 (2016).
  9. Huang, L. R., Wu, H. L., Chen, P. J., Chen, D. S. An immunocompetent mouse model for the tolerance of human chronic hepatitis B virus infection. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 103 (47), 17862-17867 (2006).
  10. Wong, P., Pamer, E. G. CD8 T cell responses to infectious pathogens. Annual Review of Immunology. 21, 29-70 (2003).
  11. Murray, J. M., Wieland, S. F., Purcell, R. H., Chisari, F. V. Dynamics of hepatitis B virus clearance in chimpanzees. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 102 (49), 17780-17785 (2005).
  12. Hinrichs, C. S., et al. Adoptively transferred effector cells derived from naive rather than central memory CD8+ T cells mediate superior antitumor immunity. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 106 (41), 17469-17474 (2009).
  13. Hinrichs, C. S., et al. Human effector CD8+ T cells derived from naive rather than memory subsets possess superior traits for adoptive immunotherapy. Blood. 117 (3), 808-814 (2011).
  14. Kerkar, S. P., et al. Genetic engineering of murine CD8+ and CD4+ T cells for preclinical adoptive immunotherapy studies. Journal of Immunotherapy. 34 (4), 343-352 (2011).
  15. Kuball, J., et al. Facilitating matched pairing and expression of TCR chains introduced into human T cells. Blood. 109 (6), 2331-2338 (2007).
  16. van Loenen, M. M., et al. Mixed T cell receptor dimers harbor potentially harmful neoreactivity. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 107 (24), 10972-10977 (2010).
  17. Cameron, B. J., et al. Identification of a Titin-derived HLA-A1-presented peptide as a cross-reactive target for engineered MAGE A3-directed T cells. Science Translational Medicine. 5 (197), (2013).
  18. Fedorov, V. D., Themeli, M., Sadelain, M. PD-1- and CTLA-4-based inhibitory chimeric antigen receptors (iCARs) divert off-target immunotherapy responses. Science Translational Medicine. 5 (215), (2013).
  19. Maus, M. V., et al. T cells expressing chimeric antigen receptors can cause anaphylaxis in humans. Cancer Immunolology Research. 1 (1), 26-31 (2013).
  20. Haque, R., et al. Programming of regulatory T cells from pluripotent stem cells and prevention of autoimmunity. Journal of Immunology. 189 (3), 1228-1236 (2012).
  21. Vizcardo, R., et al. Regeneration of human tumor antigen-specific T cells from iPSCs derived from mature CD8(+) T cells. Cell Stem Cell. 12 (1), 31-36 (2013).
  22. Nishimura, T., et al. Generation of rejuvenated antigen-specific T cells by reprogramming to pluripotency and redifferentiation. Cell Stem Cell. 12 (1), 114-126 (2013).
  23. Lei, F., et al. In vivo programming of tumor antigen-specific T lymphocytes from pluripotent stem cells to promote cancer immunosurveillance. Cancer Research. 71 (14), 4742-4747 (2011).
  24. Kim, J. B., et al. Oct4-induced pluripotency in adult neural stem cells. Cell. 136 (3), 411-419 (2009).
  25. Lei, F., Haque, R., Xiong, X., Song, J. Directed differentiation of induced pluripotent stem cells towards T lymphocytes. Journal of Visualized Experiments. (63), e3986(2012).
  26. Lei, F., Haque, M., Sandhu, P., Ravi, S., Ni, Y., Zheng, S., Fang, D., Jia, H., Yang, J. M., Song, J. Development and characterization of naive single-type tumor antigen-specific CD8+ T lymphocytes from murine pluripotent stem cells. OncoImmunology. 6, (2017).
  27. Haque, M., et al. Melanoma Immunotherapy in Mice Using Genetically Engineered Pluripotent Stem Cells. Cell Transplantation. 25 (5), 811-827 (2016).
  28. Tan, A. T., et al. Use of Expression Profiles of HBV DNA Integrated Into Genomes of Hepatocellular Carcinoma Cells to Select T Cells for Immunotherapy. Gastroenterology. , (2019).
  29. Wu, L. L., et al. Ly6C(+) Monocytes and Kupffer Cells Orchestrate Liver Immune Responses Against Hepatitis B Virus in Mice. Hepatology. , (2019).
  30. Haque, M., et al. Stem cell-derived tissue-associated regulatory T cells suppress the activity of pathogenic cells in autoimmune diabetes. Journal of Clinical Investigation Insights. , (2019).
  31. Chisari, F. V., et al. Structural and pathological effects of synthesis of hepatitis B virus large envelope polypeptide in transgenic mice. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 84 (19), 6909-6913 (1987).
  32. Wirth, S., Guidotti, L. G., Ando, K., Schlicht, H. J., Chisari, F. V. Breaking tolerance leads to autoantibody production but not autoimmune liver disease in hepatitis B virus envelope transgenic mice. Journal of Immunology. 154 (5), 2504-2515 (1995).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

B CD8 B
الخلايا الجذعية المشتقة الفيروسية Ag محددة T الخلايا الليمفاوية قمع النسخ المتماثل HBV في الفئران
اتصل بنا
أوصِ بها للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

2026 © حقوق الطبع والنشر MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.