المعروضة هنا هي طريقة الكهربائي لتسليم الحمض النووي بلازميد وتسمية الخلايا ependymoglial في telencephalon حمار وحشي الكبار. هذا البروتوكول هو وسيلة سريعة وفعالة لتصور وتتبع الخلايا الأيبندية الفردية ويفتح إمكانيات جديدة لتطبيق الكهربائي على مجموعة واسعة من التلاعبات الوراثية.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
طريقة الكهربائي في الجسم الحيوي تسليم الحمض النووي بلازميد في Telencephalon حمار وحشي الكبار
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
الكهربائي هو طريقة التغوط التي يتم فيها تطبيق حقل كهربائي على الخلايا لخلق المسام المؤقتة في غشاء الخلية وزيادة نفاذية، مما يسمح لجزيئات مختلفة ليتم إدخالها إلى الخلية. في هذه الورقة، يتم استخدام الكهربائي لإدخال بلازميدات إلى الخلايا الاستئصالية، والتي خط المنطقة البطينية من الدماغ حمار وحشي الكبار. جزء من هذه الخلايا يظهر خصائص الخلايا الجذعية ويولد الخلايا العصبية الجديدة في الدماغ حمار وحشي. لذلك، دراسة سلوكهم أمر ضروري لتحديد أدوارهم في تكوين الأعصاب وتجديدها. إدخال بلازميدات عن طريق الكهربائي يتيح وضع العلامات على المدى الطويل وتتبع خلية واحدة ependymoglial. وعلاوة على ذلك، يمكن تسليم البلازميدات مثل Cre recombinase أو Cas9 إلى خلايا ependymoglial واحدة، والتي تمكن من إعادة تركيب الجينات أو تحرير الجينات ويوفر فرصة فريدة لتقييم وظيفة الجينات المستقلة للخلية في السيطرة عليها، الطبيعية البيئه. وأخيراً، يتم استخدام هذا البروتوكول الكهربائي المفصل خطوة بخطوة للحصول على إدخال ناجح للبلازميدات في عدد كبير من الخلايا الاستئصالية واحدة.
المقدمة
حمار وحشي هي نماذج حيوانية ممتازة لفحص تجديد الدماغ بعد إصابة جرح طعنة. بالمقارنة مع الثدييات، على سلم التطور، والأنواع الأقل تطورا مثل حمار وحشي تظهر عموما معدلات أعلى من تكوين الأعصاب التأسيسية والمناطق الأوسع من سكن الخلايا الجذعية العصبية الكبار، مما يؤدي إلى توليد مستمر من الخلايا العصبية الجديدة في جميع أنحاء معظم مناطق الدماغ في حياة الكبار. ويبدو أن هذه الميزة ترتبط مع قدرة تجديدية أعلى بكثير من حمار وحشي بالمقارنة مع الثدييات1، كما حمار وحشي لديها إمكانات ملحوظة لتوليد الخلايا العصبية الجديدة بكفاءة في معظم نماذج إصابات الدماغ درس2، 3,4,5,6,7,8. هنا، يتم دراسة telencephalon سمك الحمار الوحشي، لأنها منطقة الدماغ مع تكوين الأعصاب بارزة في مرحلة البلوغ. هذه المناطق من تكوين الأعصاب الكبار هي متجانسة للمناطق العصبية في الدماغ الثدييات الكبار9،10،11.
المناطق العصبية وفيرة في telencephalon حمار وحشي موجودة بسبب وجود glia شعاعي مثل الخلايا أو خلايا ependymoglia. الخلايا الاستئصالية Ependymoglial بمثابة الخلايا الجذعية العصبية الكبار المقيمين ومسؤولة عن توليد الخلايا العصبية الجديدة في كل من الدماغ سليمة وتجديد3،5. وقد أظهرت تجارب تتبع النسب أن ependymoglia البطينية تتفاعل مع الإصابة، ثم تنتشر وتوليد الخلايا العصبية الجديدة التي تهاجر إلى موقع الآفة5. بسبب الطبيعة المتتربدة من الدماغ حمار وحشي، الخلايا ependymoglial خط السطح البطيني وبناء الجدار البطيني البطيني. يتكون الجدار البطيني الحويصلي من طبقة الخلايا الأورسية(الشكل 1A). الأهم من ذلك، تجسد ependymoglia حمار وحشي خصائص كل من الثدييات الغليا شعاعي والخلايا ependymal. العمليات شعاعي طويلة هي سمة نموذجية من خلايا غليا شعاعي، في حين أن ملحقات الخلوية وتقاطعات ضيقة (فضلا عن مواقفها البطينية) هي ملامح نموذجية من الخلايا ependymal12،13،14. لذلك، يشار إلى هذه الخلايا باسم الخلايا الإيبنموجلية.
لمتابعة في سلوك الجسم الحي من الخلايا ependymoglial واحدة أثناء التجدد، فإنها تحتاج إلى أن تكون وصفت بشكل موثوق. وقد سبق وصف أساليب مختلفة من وضع العلامات في الخلايا الحية للميكروسكوب الفلورسنت، مثل الصحفيين الذاتية أو الأصباغ lipophilic15. وقد تتطلب هذه الأساليب، على النقيض من الكهرباء، فترات زمنية أطول، وكثيراً ما لا تتيح إمكانية وضع علامات على خلية واحدة أو تتبع دائم طويل الأجل. الكهربة، ومع ذلك (إلى جانب وضع العلامات خلية واحدة)، ويوفر إمكانية إدخال الحمض النووي الجديد في الخلية المضيفة. وعلاوة على ذلك، بالمقارنة مع غيرها من أساليب نقل الحمض النووي في الخلايا، وقد ثبت الكهربائي لتكون واحدة من أكثر الطرق كفاءة16،17،18،19.
يعرض هنا بروتوكول الكهربائي الذي تم صقله لغرض وضع العلامات على الخلايا ependymoglial واحدة في telencephalon حمار وحشي الكبار. يسمح هذا البروتوكول بوضع العلامات على الخلايا الأيبنموغلية واحدة من أجل متابعتها على مدى فترة طويلة الأجل20 أو للتعامل مع مسارات محددة بطريقة الخلية المستقلة21،22.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
تم الاحتفاظ بجميع الحيوانات المستخدمة في هذا البروتوكول في ظل ظروف تربية موحدة، وأجريت التجارب وفقا للمبادئ التوجيهية واللوائح من اولة الاتحاد الأوروبي وحكومة بافاريا العليا (AZ 55.2-1-54-2532-0916).
1. إعداد خليط البلازميد للكهرباء
- تمييع بلازميد الاهتمام بالماء المعقم وإضافة حل سريع للمرقة الخضراء وصمة عار [1 ملغ /مل]. تأكد من أن التركيز النهائي للبلازميد هو 1 ميكروغرام/لتر.
- بمجرد إعداده، قم بخلط محلول البلازميد عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا عدة مرات أو عن طريق التنصت على الأصابع. يُحفظ في درجة حرارة الغرفة (RT) حتى الاستخدام.
ملاحظة: للكهرباء المشتركة لاثنين من البلازميدات في نفس الخلية، تأكد من أن تركيز كل بلازميد الفردية المستخدمة في الخليط هو على الأقل 0.8 نانوغرام / ميكرولتر مع نسبة الأضراس من 1:1 للحصول على كفاءة الكهرباء المشتركة 80٪-90٪.
2. الاستعدادات لإجراء الحقن والكهرباء
- إعداد الشعيرات الدموية الزجاجية (القطر الخارجي 1 ملم، القطر الداخلي 0.58 مم) اللازمة للحقن في جهاز سحب إبرة.
- من أجل حقن الكمية الصحيحة من بلازميد (انظر أعلاه)، وسحب الشعرية في درجة حرارة 68.5 درجة مئوية مع اثنين من الضوء واثنين من الأوزان الثقيلة (انظر جدول المواد لمواصفات الساحبة).
ملاحظة: في حالة استخدام سحب مختلفة، معايرة الشعرية لتقديم الحجم المناسب من مزيج الكهربائي. - تعيين جهاز الحقن يدويا إلى ضغط حقن من 200 هبأ (عن طريق تحويل مقبض بي) والضغط المستمر من 0 هبأ. تعيين وقت الحقن يدويا لوضع يدوي والسيطرة على الضغط مع دواسة القدم.
- قم بتعيين جهاز الكهرباء إلى "وضع LV" مع خمسة نبضات في 54-57 فولت (25 مللي ثانية لكل منها فواصل زمنية 1 ثانية). قم بتوصيل الأقطاب الكهربائية بالجهاز.
- إعداد خزان سمك واحد مع مياه السمك النظيفة، حيث سيتم إيقاظ الأسماك من التخدير بعد إجراء الكهربائي. تُنير المياه عن طريق إبقاء حجر الهواء الملحق بمضخة الهواء طوال فترة التعافي حتى تستيقظ الأسماك بالكامل.
- خذ اسفنجة المطبخ العادية وجعل قطع طولية في الاسفنجة لعقد الأسماك في أثناء عملية الحقن والكهرباء (انظر المنشور السابق3).
ملاحظة: وينبغي غسل اسفنجة المطبخ بانتظام أو تبادلها من أجل إزالة المواد الكيميائية السامة المحتملة. - وضع كمية صغيرة من الموجات فوق الصوتية متعددة الأغراض موصل للغاية هلام بجوار الإعداد حقن والكهربائي.
ملاحظة: وهذا يضمن الموصلية الكهربائية الكافية، وبالتالي، توزيع الخلايا الكهربائية في جميع أنحاء telencephalon كامل.
3. تخدير سمك الحمار الوحشي
- قبل التخدير، وإعداد محلول مخزون التخدير مع 0.2٪ MS222 في الماء المقطر وضبط درجة الحموضة إلى 7 مع تريز-حمض الهيدروكلوريك العازلة. تخفيف هذا المخزون 1:10 (أي إلى 0.02٪ MS222) باستخدام مياه السمك.
- التخدير الأسماك عن طريق الاحتفاظ بها في هذا الحل العمل حتى تتراجع حركة الجسم والخياشيم (عادة لبضع دقائق).
4. حقن محلول بلازميد
- ملء الشعرية الزجاج المعدة مع 10 ميكرولتر من محلول بلازميد باستخدام نصائح microloader. تجنب تشكيل فقاعات الهواء داخل الشعرية.
- اضغط على القائمة / تغيير الشعرية على جهاز الحقن. إدراج وتأمين الإبرة في حامل الإبرة.
- تحت مجهر مجسم مع التكبير من 3.2x أو 4X، وقطع فقط غيض من الشعرية باستخدام ملقط نهاية غرامة. تبديل جهاز الحقن من تغيير وضع الشعرية في وضع الحقن، ثم تطبيق الضغط مع دواسة القدم للتأكد من أن الحل بلازميد يعمل بسهولة من الإبرة ودون عائق.
- نقل الأسماك من خزان تربية إلى الحاوية (مربع من البلاستيك) مع محلول التخدير. انتظر لبضع دقائق حتى تهدأ حركة الخياشيم.
- ضع السمك في الاسفنجة المبللة مسبقاً مع الجانب الظهري الذي يواجه. تنفيذ جميع خطوات الحقن التالية تحت المجهر المجسم لضمان دقة الإجراء.
- باستخدام تشريح سكين صغير من الفولاذ المقاوم للصدأ مع 40 ملم حافة القطع وسمك 0.5 ملم، وخلق ثقب صغير في جمجمة الأسماك في الجانب الخلفي من telencephalon(الشكل 1B)،بجوار الحدود مع tectum البصرية.
ملاحظة: وينبغي تنفيذ هذه الخطوة بعناية منذ ثقب ينبغي أن تكون صغيرة جدا وسطحية، واختراق الجمجمة فقط، لتجنب تلف الدماغ. - إمالة الأسماك حسب الضرورة وتوجيه غيض من الشعرية الزجاجية نحو الجمجمة في الزاوية الصحيحة لتسهيل اختراق طرف الشعرية من خلال الحفرة.
- أدخل طرف الشعرية من خلال الثقب في الجمجمة بعناية حتى تصل إلى البطين الذيلاي (انظر الشكل 1B). وهذا يتطلب اختراق من خلال طبقة الخلايا الأوردية ependymal. يجب الحرص بشكل خاص على عدم إدراج الشعرية بعمق شديد لتجنب الاتصال مع أنسجة الدماغ. الحفاظ على الشعرية على وجه التحديد بين نصفي الكرة الأرضية، والبقاء داخل البطين فقط بعد ثقب طبقة ependymal الظهرية.
ملاحظة: وهذه خطوة حساسة جدا. يتم تحسين دقة هذا الإجراء باستخدام خطوط متحولة تصبغ مثل النحاسية24،مما يسمح أفضل التصور من موقف الشعرية الزجاج أثناء الحقن. - مع طرف الشعرية داخل البطين، حقن الحل بلازميد عن طريق تطبيق الضغط مع دواسة القدم لحوالي 10 ثانية، والذي يتوافق مع ما يقرب من 1 ميكرولتر من محلول بلازميد.
ملاحظة: إذا كان تغيير سحب إبرة، الشعيرات الدموية أو حاقن، ينبغي معايرة النظام من أجل تقديم دائما 1 ميكرولتر من محلول بلازميد. ويمكن إجراء المعايرة عن طريق قياس قطر قطرات البلازميد التي تُطرد إلى زيت معدني (مثل زيت البارافين) ثم حساب حجم القطرة. بعد 10 ثانية من الحقن، يجب أن يكون هناك ~ 1 ميكرولتر من سائل بلازميد طرد إلى الزيت المعدني. - تأكيد نجاح الخطوة السابقة من خلال مراقبة انتشار السائل في جميع أنحاء البطين.
5. الكهربائي
- إزالة الأسماك من حقن الإعداد في حين لا يزال عقد في الاسفنجة.
- تزج الجانب الداخلي من طرف الأقطاب الكهربائية في هلام الموجات فوق الصوتية.
- تغطية telencephalon الأسماك مع كمية صغيرة من هلام الموجات فوق الصوتية.
- وضع رأس السمك بين الأقطاب الكهربائية، ووضع القطب الإيجابي في الجانب البطني من رأس السمكة والقطب السلبي على الجانب الظهري(الشكل 1C)،في حين لا يزال عقد جسم السمكة في الاسفنجة. هذا يحدد اتجاه تدفق الحالية اللازمة لependymoglia الكهربائي المتمركزة في منطقة تحت البطين.
- اضغط على الأقطاب الكهربائية بلطف وعلى وجه التحديد ضد telencephalon(الشكل 1C). إدارة التيار مع دواسة القدم. عقد الأقطاب الكهربائية في مكان حتى يتم الانتهاء من جميع البقول الخمسة.
6. استعادة الأسماك
- دع السمك يتعافى في الخزان الذي تم إعداده من قبل، ومنهك باستمرار حتى يستيقظ. يمكن تطبيق هلام ليدوكائين على الجمجمة من أجل تخفيف أي ألم ربما وضعت.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
طريقة الكهربائي الموصوفة يسمح تسليم الحمض النووي بلازميد في الخلايا ependymoglial، والتي تقع بشكل سطحي في telencephalon حمار وحشي وتحت طبقة الخلايا الأوردية ependymal(الشكل 1A).
إذا كانت نتيجة الكهربائي إيجابية، وصفت الخلايا ependymoglial واحدة (الخلايا الحمراء في الشكل 2A، B)يمكن ملاحظتها بين الخلايا الأيبنديموجلية الأخرى (أبيض في الشكل 2A، B). اعتمادا على كفاءة عم...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
هذا البروتوكول الكهربائي هو موثوق بها في طريقة الجسم الحي من وضع العلامات على الخلايا الأيبنموجلية الفردية. قد يحتاج البروتوكول إلى مزيد من التكيف لتسمية أنواع الخلايا الأخرى مثل الخلايا العصبية أو oligodendrocytes. ولتحقيق وضع العلامات الناجحة، يمكن استخدام البلازميدات التي تحتوي على مروّجين مختلفين. الدجاج بيتا أكتين المروج، eF1alpha، CMV والمروج ubiquitin وقد استخدمت سابقا لدفع التعبير عن الجينات المختلفة في ependymoglia وذريتهم23. ومع ذلك، لوحظت حركية مختلفة للتعبير عبر الجينات التي ينبغي أن ت...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.
شكر وتقدير
شكر خاص لجيمس قبطي لتحرير المخطوطة. كما نعرب عن امتناننا للتمويل المقدم إلى JN من مؤسسة البحوث الألمانية (DFG) من قبل SFB 870 وSPP "التحليل التكاملي للOlfaction" و SPP 1738 "الأدوار الناشئة من RNAs غير الترميز في تطوير الجهاز العصبي واللدونة والمرض"، SPP1757 " عدم تجانس جليال"، واستراتيجية التميز في إطار مجموعة ميونيخ لأنظمة علم الأعصاب (EXC 2145 SyNergy – ID 390857198).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| <قوي > كاشف / مادة < / قوي > | |||
| سريع أخضر | سيجما ألدريتش | F7258-25G | لتلوين محلول البلازميد |
| MS222 | يجب تخزين Sigma-Aldrich | A5040-25G | MS222 في RT (حتى أسبوعين) وحمايتها من |
| هلام الموجات فوق الصوتية | الخفيف SignaGel ، Parker laboratories INC. | 15-60 | هلام القطب الكهربائي |
| < قوي > المعدات < / مضخة هواء قوية > | |||
| يمكن شراؤها TetraTec APS 50 ، 10l-60l | يمكن شراؤها في متاجر الأليفة | ||
| BTX Tweezertrodes Electrodes | Platinum Tweezertrode ، BTX Harvard Apparatus | 45-0486 | بقطر 1 |
| مم BTX ECM830 نظام التثقيب الكهربائي للموجة المربعة ، BTX جهاز هارفارد | 45-0662 | ||
| جهاز الحقن | FemtoJet 4i ، Eppendorf | 5252000013 | |
| الجدار القياسي Borosillicate Glass Capillary | Instruments Warner | 64-0766 | رقم الموديل: G100-4 |
| نصائح Microloader | Eppendorf | 5242956003 | |
| Micro-knife | أدوات العلوم الدقيقة | 10056-12 | |
| Joystick micromanipulator | Narishige Japan | MN - حامل إبرة 151 | |
| FemtoJet 4i ، حامل | Eppendorf 5252000013 | يأتي مع جهاز الحقن | |
| جهاز سحب الإبرة | Narishige Japan | رقم الموديل: PC-10 | تم إيقاف PC-10 بواسطة Narishige في عام 2017 واستبداله بأطباق PC-100 |
| Petri | Greiner Bio-One International | 633161 |
المراجع
- Kaslin, J., Ganz, J., Brand, M. Proliferation, neurogenesis and regeneration in the non-mammalian vertebrate brain. Philosophical Transactions of the Royal Society of London Series B Biological Sciences. 363 (1489), 101-122 (2008).
- Baumgart, E. V., Barbosa, J. S., Bally-Cuif, L., Gotz, M., Ninkovic, J. Stab wound injury of the zebrafish telencephalon: a model for comparative analysis of reactive gliosis. Glia. 60 (3), 343-357 (2012).
- Barbosa, J., et al. Live imaging of adult neural stem cell behavior in the intact and injured zebrafish brain. Science. 346 (6236), 789-793 (2015).
- Kishimoto, N., Shimizu, K., Sawamoto, K. Neuronal regeneration in a zebrafish model of adult brain injury. Disease Model and Mechanisms. 5 (2), 200-209 (2012).
- Kroehne, V., Freudenreich, D., Hans, S., Kaslin, J., Brand, M. Regeneration of the adult zebrafish brain from neurogenic radial glia-type progenitors. Development. 138 (22), 4831-4841 (2011).
- Marz, M., Schmidt, R., Rastegar, S., Strahle, U. Regenerative response following stab injury in the adult zebrafish telencephalon. Developmental Dynamics. 240 (9), 2221-2231 (2011).
- Ayari, B., Elhachimi, K. H., Yanicostas, C., Landoulsi, A., Soussi-Yanicostas, N. Prokineticin 2 expression is associated with neural repair of injured adult zebrafish telencephalon. Journal of Neurotrauma. , (2010).
- Skaggs, K., Goldman, D., Parent, J. M. Excitotoxic brain injury in adult zebrafish stimulates neurogenesis and long-distance neuronal integration. Glia. 62 (12), 2061-2079 (2014).
- Schmidt, R., Strahle, U., Scholpp, S. Neurogenesis in zebrafish - from embryo to adult. Neural Development. 8 (3), (2013).
- Alunni, A., Bally-Cuif, L. A comparative view of regenerative neurogenesis in vertebrates. Development. 143 (5), 741-753 (2016).
- Kizil, C., Kaslin, J., Kroehne, V., Brand, M. Adult neurogenesis and brain regeneration in zebrafish. Developmetal Neurobiology. 72 (3), 429-461 (2012).
- Than-Trong, E., Bally-Cuif, L. Radial glia and neural progenitors in the adult zebrafish central nervous system. Glia. 63 (8), 1406-1428 (2015).
- Lyons, D. A., Talbot, W. S. Glial cell development and function in zebrafish. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (2), a020586(2014).
- Obermann, J., et al. The Surface Proteome of Adult Neural Stem Cells in Zebrafish Unveils Long-Range Cell-Cell Connections and Age-Related Changes in Responsiveness to IGF. Stem Cell Reports. 12 (2), 258-273 (2019).
- Progatzky, F., Dallman, M. J., Lo Celso, C. From seeing to believing: labelling strategies for in vivo cell-tracking experiments. Interface Focus. 3 (3), 20130001(2013).
- Kusumanto, Y. H., et al. Improvement of in vivo transfer of plasmid DNA in muscle: comparison of electroporation versus ultrasound. Drug Delivery. 14 (5), 273-277 (2007).
- Zou, M., De Koninck, P., Neve, R. L., Friedrich, R. W. Fast gene transfer into the adult zebrafish brain by herpes simplex virus 1 (HSV-1) and electroporation: methods and optogenetic applications. Frontiers in Neural Circuits. 8 (41), (2014).
- Van Tendeloo, V. F., et al. Highly efficient gene delivery by mRNA electroporation in human hematopoietic cells: superiority to lipofection and passive pulsing of mRNA and to electroporation of plasmid cDNA for tumor antigen loading of dendritic cells. Blood. 98 (1), 49-56 (2001).
- Mars, T., et al. Electrotransfection and lipofection show comparable efficiency for in vitro gene delivery of primary human myoblasts. The Journal of Membrane Biology. 248 (2), 273-283 (2015).
- Barbosa, J. S., Di Giaimo, R., Gotz, M., Ninkovic, J. Single-cell in vivo imaging of adult neural stem cells in the zebrafish telencephalon. Nature Protocols. 11 (8), 1360-1370 (2016).
- Di Giaimo, R., et al. The Aryl Hydrocarbon Receptor Pathway Defines the Time Frame for Restorative Neurogenesis. Cell Reports. 25 (12), 3241-3251 (2018).
- Breunig, C. T., et al. One step generation of customizable gRNA vectors for multiplex CRISPR approaches through string assembly gRNA cloning (STAgR). PLoS One. 13 (4), e0196015(2018).
- Barbosa, J. S. In vivo single cell analysis reveals distinct behavior of neural stem and progenitor cells in homeostasis and regeneration in the adult brain. , University of Coimbra. Doctoral dissertation (2014).
- Kelsh, R. N., et al. Zebrafish pigmentation mutations and the processes of neural crest development. Development. 123, 369-389 (1996).
- Torper, O., et al. In Vivo Reprogramming of Striatal NG2 Glia into Functional Neurons that Integrate into Local Host Circuitry. Cell Reports. 12 (3), 474-481 (2015).
- Nguyen, L. T., Atobe, K., Barichello, J. M., Ishida, T., Kiwada, H. Complex formation with plasmid DNA increases the cytotoxicity of cationic liposomes. Biological and Pharmaceutical Bulletin. 30 (4), 751-757 (2007).
- Chapouton, P., Godinho, L. Neurogenesis. Chapter IV in The Zebrafish: Cellular and Developmental Biology, Part A Developmental Biology. Detrich, H. W. III, Westerfield, M., Zon, L. 100, Academic Press. (2010).
- Zhu, P., et al. Optogenetic Dissection of Neuronal Circuits in Zebrafish using Viral Gene Transfer and the Tet System. Frontiers in Neural Circuits. 3 (21), (2009).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
