يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

منصة زرع نخاع العظم للتحقيق في دور الخلايا التطبيب في مرض الكسب غير المشروع مقابل المضيف

7.5K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/60083

⸱

مارس 17, 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Cancer Division, Burnett School of Biomedical Sciences, University of Central Florida, 2Department of Biochemistry, Hanoi University of Pharmacy, 3Center for Cardiovascular Regeneration, Department of Cardiovascular Sciences, Houston Methodist Research Institute, 4Department of Epidemiology, University of Pittsburgh Graduate School of Public Health, 5Division of Cancer Control and Population Sciences, University of Pittsburgh Medical Center, Hillman Cancer Center

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

مرض الكسب غير المشروع مقابل المضيف هو أحد المضاعفات الرئيسية بعد زرع نخاع العظم اللوجيني. تلعب الخلايا التطبيبية دورًا حاسمًا في الإمراض لمرض الكسب غير المشروع مقابل المضيف. المادة الحالية يصف جديدة زرع نخاع العظم منصة للتحقيق في دور الخلايا التشجرات في تطوير مرض الكسب غير المشروع مقابل المضيف وتأثير الكسب غير المشروع مقابل سرطان الدم.

الملخص

زرع نخاع العظم الأوجيني (BMT) هو علاج فعال للأورام الدموية بسبب تأثير الكسب غير المشروع مقابل سرطان الدم (GVL) للقضاء على الأورام. ومع ذلك ، يقتصر تطبيقه على تطور مرض الكسب غير المشروع مقابل المضيف (GVHD) ، وهو أحد المضاعفات الرئيسية لـ BMT. يتم استحضار GVHD عندما الخلايا التائية في الطعوم المانحة الاعترافالوانتيجين التي تعبر عنها الخلايا المتلقية ويشن الهجمات المناعية غير المرغوب فيها ضد الأنسجة السليمة المتلقي. وهكذا، تم تصميم العلاجات التقليدية لقمع المتبرع T-خلية alloreactivity. ومع ذلك، فإن هذه النُهج تضعف إلى حد كبير تأثير GVL بحيث لا يتم تحسين بقاء المتلقي. وبالتالي فإن فهم آثار النهج العلاجية على BMT و GVL و GVHD أمر ضروري. بسبب قدرات التبذير وإفراز السيتوكين لتحفيز الخلايا التائية المانحة، تلعب الخلايا التطبيبة المتلقية (DCs) دورًا مهمًا في تحريض GVHD. ولذلك، يصبح استهداف البلدان النامية المتلقية نهجاً محتملاً للسيطرة على الـ GVHD. يقدم هذا العمل وصفاً لمنصة BMT جديدة للتحقيق في كيفية تنظيم البلدان النامية المضيفة لاستجابات GVH وGVL بعد الزرع. كما يقدم نموذج BMT فعال لدراسة بيولوجيا GVHD وGVL بعد الزرع.

المقدمة

زرع الخلايا الجذعية الدموية الأنجينية (BMT) هو علاج فعال لعلاج الأورام الخبيثة الدموية1،2 من خلال تأثير الكسب غير المشروع مقابل سرطان الدم (GVL)3. ومع ذلك ، فإن الخلايا اللمفاوية المانحة دائما ً ما تشن هجمات مناعية غير مرغوب فيها ضد الأنسجة المتلقية ، وهي عملية تسمى مرض الكسب غير المشروع مقابل المضيف (GVHD)4.

نماذج المورين من GVHD هي أداة فعالة لدراسة بيولوجيا GVHD واستجابة GVL5. الفئران هي نموذج الحيوان البحوث فعالة من حيث التكلفة. فهي صغيرة وفعالة مبوئيمع الجزيئات والبيولوجية في المراحل المبكرة من التنمية6. الفئران هي الحيوانات البحثية المثالية لدراسات التلاعب الجيني لأنها محددة وراثيا، وهو مثالي لدراسة المسارات البيولوجية والآليات6. وقد تم العديد من الفأرة الرئيسية المعقدة histocompatibility (MHC) نماذج غير متطابقة من GVHD راسخة، مثل C57BL/6 (H2ب)إلى BALB/c (H2د)وFVB (H2 q)→C57BL/6q(H2ب)5،,7. هذه هي نماذج قيمة بشكل خاص لتحديد دور أنواع الخلايا الفردية والجينات والعوامل التي تؤثر على GVHD. زرع من C57/BL/6 (H2ب)المتبرعين الوالدين إلى المتلقين مع الطفرات في MHC I (B6.C-H2bm1)و / أو MHC الثاني (B6.C-H2bm12)كشفت أن عدم التطابق في كل من الفئة MHC الأول والفئة الثانية هو شرط مهم لتطوير GVHD الحادة. وهذا يشير إلى أن كل من CD4+ وCD8+ الخلايا التائية مطلوبة لتطوير المرض7،8. وتشارك GVHD أيضا في سلسلة التهابية تعرف باسم 'عاصفة السيتوكين الموالية للالتهابات'9. طريقة التكييف الأكثر شيوعا في نماذج المورين هو تشعيع الجسم الكلي (TBI) عن طريق الأشعة السينية أو 137Cs. وهذا يؤدي إلى استئصال نخاع العظم للمتلقي، مما يسمح للمتبرع بتطعيم الخلايا الجذعية ومنع رفض الكسب غير المشروع. ويتم ذلك عن طريق الحد من انتشار الخلايا التائية المتلقية استجابة للخلايا المانحة. بالإضافة إلى ذلك ، تلعب التفاوتات الوراثية دورًا مهمًا في تحريض المرض ، والذي يعتمد أيضًا على MHC-mismatch81. لذلك ، تختلف جرعة التشعيع النقوي في سلالات الفئران المختلفة (على سبيل المثال ، BALB /c→ C57BL/6).

تنشيط الخلايا التائية المانحة من قبل مستضد المضيف الخلايا تقديم (APCs) أمر ضروري لتطوير GVHD. من بين APCs، الخلايا التشجرات (DCs) هي الأقوى. فهي قادرة على إحداث GVHD بشكل موروث بسبب الإنتضاد الأعلى، والتعبير عن جزيئات T-cell المشتركة المحفزة، وإنتاج السيتوكينات المؤيدة للالتهابات التي تستقطب الخلايا التائية إلى مجموعات فرعية مسببة للأمراض. البلدان النامية المتلقية حاسمة لتسهيل فتيلة الخلايا T والتعريفي GVHD بعد زرع11،12. وبناء على ذلك، أصبحت البلدان النامية أهدافا مثيرة للاهتمام في علاج GVHD12.

مطلوب TBI لتعزيز الترقيع الخلية المانحة. بسبب تأثير TBI ، يتم تنشيط البلدان النامية المتلقية والبقاء على قيد الحياة لفترة قصيرة بعد زرع12. وعلى الرغم من التقدم الكبير في استخدام الإضاءة الحيوية أو الفلور، فإن إنشاء نموذج فعال لدراسة دور البلدان النامية المتلقية في الـ GVHD لا يزال يشكل تحدياً.

لأن الخلايا التائية المانحة هي القوة الدافعة لنشاط GVL ، فإن استراتيجيات العلاج باستخدام الأدوية المثبطة للمناعة مثل المنشطات لقمع الخلايا التائية غالبًا ما تسبب انتكاسة الورم أو العدوى13. ولذلك، فإن استهداف البلدان النامية المتلقية قد يوفر نهجاً بديلاً لعلاج الـ GVHD مع الحفاظ على تأثير GVL وتجنب العدوى.

باختصار، توفر الدراسة الحالية منصة لفهم كيفية تنظيم أنواع مختلفة من الإشارات في البلدان النامية المتلقية لتطوير GVHD وتأثير GVL بعد BMT.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

تمت الموافقة على الإجراءات التجريبية من قبل لجنة الرعاية الحيوانية المؤسسية واستخدامها في جامعة وسط فلوريدا.

1. التعريفي GVHD

ملاحظة: يتم إجراء زرع الخلايا نخاع العظم الأوجيني (BM) (الخطوة 1.2) في غضون 24 ساعة بعد التشعيع. يتم تنفيذ جميع الإجراءات الموضحة أدناه في بيئة معقمة. تنفيذ الإجراء في غطاء زراعة الأنسجة واستخدام الكواشف المصفاة.

  1. اليوم 0: إعداد الفئران المتلقي.
    1. استخدم فئران الإناث البرية (WT) على خلفية BALB/c (CD45.2+ H2kd+) ، 10-12 أسبوعًا من العمر كمستلمين.
    2. الأذن الوسم ووزن المستلمين قبل TBI. ثم، وضع ما يصل إلى 11 الفئران في غرفة التشعيع والاحتفاظ بها في الرادياتير. يشع بجرعة واحدة من 700 cGy لمدة 10−15 دقيقة.
    3. إعادة الحيوانات المشععة إلى الأقفاص وإيوها في مرافق خالية من مسببات الأمراض قبل عملية الزرع.
      ملاحظة: يجب أن يكون الحد الأدنى لوزن الجسم للمستلمين حوالي 20 جم. استخدم هذا الوزن كمرجع لحساب فقدان وزن الجسم خلال الفترة التجريبية.
  2. اليوم الأول: إعداد نخاع العظم المستنفد للخلايا التّتية (TCD-BM) من الفئران المانحة.
    1. القتل الرحيم CD45.1/Ly5.1 C57BL/6 الفئران عن طريق ثاني أكسيد الكربونالاختناق والانتظار لمدة 2-3 دقيقة حتى أنهم فاقدو الوعي. إجراء خلع عنق الرحم كجريمة القتل الرحيم الثانوية إذا لزم الأمر.
    2. وضع كل ماوس على لوحة عمل نظيفة. تعقيم الفراء والجلد مع 70٪ ايزوبروبانول.
    3. جمع الساق وعظم الفخذ من كلا الساقين باستخدام ملقط ومقص. وضعها في الجليد الباردة RPMI تحتوي على 1٪ FCS و 100 U/mL البنسلين / ستربتومايسين و 2 مل L-الجلوتامين (1٪ RPMI) في أنابيب مخروطية 50 مل. تنظيف عظم الفخذ وعظام الساق جيدا عن طريق إزالة جميع أنسجة العضلات باستخدام ملقط ومقص. نقل عظم الفخذ والساق من أنابيب مخروطية 50 مل إلى طبق بيتري قطر92 ملم التي تحتوي على 1٪ RPMI.
    4. باستخدام مقص، وقطع نهايات عظم الفخذ أو الساق. ملء أنبوب 50 مل مع 25 مل من 1٪ RPMI 1640 المتوسطة. استخدم هذا لملء حقنة 3 مل متصلة بإبرة 26 G مع 3 مل من 1٪ RPMI. أدخل هذه الحقنة في العظام وادفع المكبس لطرد نخاع العظم (BM) من التجويف إلى أنبوب المجموعة مع 1٪ RPMI (~ 3 مل / عظم).
    5. كرر الخطوة 1.2.4 لجميع عظام الساق وعظم الفخذ المتبقية من الفئران المانحة الأخرى. إبقاء جميع أنابيب جمع على الجليد.
    6. جعل تعليق خلية واحدة عن طريق مسح قطع نخاع العظام من خلال مصفاة خلية شبكة 75 ميكرون. جمع تعليق خلية واحدة في أنبوب 50 مل.
    7. أنابيب الطرد المركزي في 800 × ز لمدة 5 دقيقة عند 4 درجة مئوية. يستنشق ويتجاهل الـ(سوبرناتانت) إعادة تعليق بيليه في PBS العازلة التي تحتوي على 0.5٪ الزلال مصل البقر (BSA) في 20 × 106 خلايا / مل. حفظ aliquot من 2 × 106 خلايا لتلطيخ النقاء.
    8. أضف الأجسام المضادة 1 في 0.05 ميكروغرام/106 خلايا14 واحتضان لمدة 30 دقيقة في 4 درجة مئوية. يغسل مرة واحدة مع 25 مل الجليد الباردة PBS. إعادة تعليق في 20 × 106/ مل في 0.5٪ BSA/10٪ تكمل الأرنب الشباب / 2٪ DNase (10،000 U/mL في العقيمة H2O). احتضان لمدة 45 دقيقة في 37 درجة مئوية وغسل 2x كما كان من قبل.
      ملاحظة: يتم استنفاد الخلايا التائية باستخدام mAb محددة لThy1، وهو بروتين يعبر عنه جميع الخلايا التائية، ولكن ليس الكريات البيض الأخرى.
    9. إعادة تعليق الخلايا في 20 مل من المخزن المؤقت PBS التي تحتوي على 0.5٪ BSA. عد خلايا نخاع العظام في 1٪ حمض الخليك باستخدام مقياس الهيموكيتومتر. الحفاظ على aliquot من 2 × 106 خلايا للتحقق من النقاء عن طريق قياس التدفق الخلوي بعد تنقية الخلايا.
      ملاحظة: يولد ماوس متبرع واحد عادةً حوالي 25 × 106 TCD-BM.
    10. استخدم قياس التدفق الخلوي لتأكيد نجاح استنفاد الخلايا التّتية. وصمة عار 1 × 106 خلايا، محفوظة من الخطوات 1.2.7 (قبل استنفاد الخلايا التائية) و 1.2.9 (TCD-BM بعد استنفاد الخلايا التائية) مع الأجسام المضادة التالية: α-CD3 (17A2)، α-CD4 (GK1.5)، وα-CD8α (53-6.7).
  3. اليوم الأول: إعداد الخلايا التائية من الفئران المانحة
    1. استخدم CD45.2+ H2kb+ C57BL/6 فئران من النوع البري (WT) كمتبرعين للخلايا التائية.
    2. القتل الرحيم C57BL/6 الفئران عن طريق ثاني أكسيد الكربون (CO2)الاختناق كما هو موضح في 1.2.1.
    3. تنظيف الفراء والجلد من الماوس جيدا مع الإيثانول 70٪. الطحال المكوس والغدد الليمفاوية وفصلها إلى تعليق خلية واحدة من الطحال باستخدام المحقنة المكبس و40 ميكرومتر مكروبين الشبكة. غسل مصفاة وحقنة المكبس مع 1٪ RPMI (1٪ FBS التي تحتوي على وسائل الإعلام RPMI) لجمع جميع الطحال.
    4. الطرد المركزي تعليق الخلية في 800 × ز لمدة 5 دقيقة في 4 درجة مئوية. إضافة 5 مل من ACK العازلة التخلص (1 mM Na2EDTA، 10 mM KHCO3،144 mM NH4Cl، درجة الحموضة 7.2) بعد التخلص من supernatant. احتضان تعليق الخلية لمدة 5 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
      ملاحظة: يتم استخدام المخزن المؤقت ACK الانزلاً لخلايا الدم الحمراء.
    5. إضافة 5 مل من 1٪ RPMI لوقف الانضاق. جهاز طرد مركزي عند 800 × ز لمدة 5 دقيقة عند 4 درجات مئوية. تجاهل السوبرناستانت.
    6. إعداد الجليد الباردة المغناطيسي تنشيط خلية الفرز (MACS) عازلة (0.5٪ BSA، 2 MM EDTA في PBS، درجة الحموضة 7.2). إزالة الغاز المخزن المؤقت قبل الاستخدام. إعادة تعليق الكريات الخلية في 5 مل من العازلة MACS.
    7. عد الطحال وتحقق من الخلايا الحية والميتة باستخدام مقياس الهيموكيتومتر و 1٪ trypan الأزرق. حفظ aliquot من 2 × 106 خلايا لتقييم العائد تنقية مع تحليل التدفق الخلوي.
    8. إعادة تعليق الطحال عند تركيز 200 × 106/ مل في العازلة MACS. إضافة 0.03 ميكرولتر من البيوتين المضادة للفأرة-تير-119، 0.03 ميكرولتر من البيوتين المضادة للفأرة CD11b، 0.03 ميكرولتر من البيوتين المضادة للفأرة-CD45R، و 0.03 ميكرولتر من البيوتين المضادة للفأرة-DX5 لكل 106 خلايا. احتضان لمدة 15 دقيقة في 4 درجة مئوية.
      ملاحظة: تم استخدام البيوتين المضادة للفأرة-تير-119، البيوتين المضادة للفأرة-CD11b، البيوتين المضادة للفأرة-CD45R، والبيوتين المضادة للفأرة-DX5 للتفاعل مع الكريات الحمراء، المحببة، B-الخلايا، وخلايا NK على التوالي. لذلك، يتم استنفاد هذه المجموعات الفرعية الخلية في الخطوةالتالية 15.
    9. إضافة 10 مل من الجليد الباردة MACS العازلة إلى تعليق الخلية. جهاز طرد مركزي عند 800 × ز لمدة 5 دقيقة عند 4 درجات مئوية. تجاهل السوبرناستانت.
    10. إعادة تعليق الكريات الخلية في المخزن المؤقت MACS بتركيز 100 × 106/ مل. أضف الميكروبات المضادة للبيوتين (0.22 ميكرولتر/106 خلايا) إلى تعليق الطحال. مزيج جيدا واحتضان لمدة 15 دقيقة إضافية في 4 درجة مئوية. غسل تعليق الخلية مرة واحدة مع 10 مل من الجليد الباردة MACS العازلة. الطرد المركزي في 800 × ز لمدة 5 دقيقة في 4 درجة مئوية والتخلص من supernatant.
    11. ضع عمود فصل مغناطيسي في المجال المغناطيسي. شطف العمود مع 3 مل من العازلة MACS. إسقاط تعليق الخلية على العمود. جمع تدفق من خلال تتكون من غير منضم، إثراء الخلايا التائية، في أنبوب مخروطي جديد 15 مل. اغسل عمود MS بـ 3 مل من مخزن MACS البارد.
      ملاحظة: تأكد من أن العمود فارغ قبل تنفيذ خطوات الغسيل.
    12. الطرد المركزي تعليق الخلية في 800 × ز لمدة 5 دقيقة في 4 درجة مئوية. إعادة تعليق بيليه الخلية في 5 مل من العازلة MACS.
    13. عد الخلايا في 1٪ trypan الأزرق باستخدام مقياس الهيموكيتومتر. حفظ aliquot من 2 × 106 خلايا للتحقق من النقاء عن طريق قياس التدفق الخلوي.
      ملاحظة: متوسط عائد الخلايا التائية الطحال معزولة بواسطة هذا الأسلوب ~ 20-25 × 106 خلايا لكل فأرة.
    14. تأكيد العائد من تخصيب الخلية التّتيّة بواسطة قياس التدفق الخلوي. وصمة عار 1 × 106 خلايا، محفوظة من الخطوات 1.3.7 (قبل استنفاد الخلايا التائية) و 1.3.13 (TCD-BM بعد استنفاد الخلايا التائية)، مع الأجسام المضادة التالية: α-CD3 (17A2)، α-CD4 (GK1.5)، وα-CD8α (53-6.7).
  4. اليوم الأول: حقن الفئران المشععة مع الخلايا التائية المانحة وTCD-BM.
    1. غسل TCD-BM وT-الخلايا 2x مع PBS (800 × ز لمدة 5 دقيقة في 4 درجة مئوية). إعادة تعليق الخلايا في PBS الجليد الباردة للحقن. ضبط تركيز الخلية إلى 20 × 106/ مل لTCD BM و 4 × 106/ مل للخلايا التائية.
    2. سخني الحيوان باستخدام مصباح تدفئة لزيادة وضوح عروق الذيل الثنائية. إذا لزم الأمر، ضع الماوس في الكبح.
    3. تنظيف سطح الذيل باستخدام 70٪ ايزوبروبانول. حقن TCD-BM (5 × 106 خلايا / فأرة) مع أو بدون خلايا T (0.75 × 106 خلايا / فأرة). يجب الحرص على عدم إدخال أي هواء في الحقنة.
    4. أزل الإبرة واضع مسحة مطهرة مباشرة على موقع الحقن 5-10 ق لوقف أي نزيف.
  5. تقييم GVHD في الأيام 2-80.
    1. تتبع بقاء الحيوان. رصد العلامات السريرية للGVHD المقتبسة من نظام التهديف الذي أنشأه كوك وآخرون16 ووزن جسم الفئران المتلقية 2x في الأسبوع. استخدام وزن الجسم المحدد قبل TBI لحساب فقدان وزن الجسم.
    2. وزن كل ماوس على حدة. تسجيل فقدان الوزن على النحو التالي: الصف 0 = أقل من 10٪؛ الصف 1 = 10% -20%؛ الصف 2 = أكثر من 20٪.
    3. تسجيل علامة الموقف من المستلمين: الصف 0 = لا حدس; الصف 0.5 = حدس طفيف ولكن يستقيم عند المشي؛ الصف 1 = يبقى الحيوان حدب عند المشي؛ الصف 1.5 = الحيوان لا تصويب; الصف 2.0 = موقف الحيوان على اللّزبالخلفي.
    4. تسجيل علامة التنقل للمستلمين: الصف 0 = نشط للغاية؛ الصف 0.5 = أبطأ من الفئران الساذجة؛ الصف 1.0 = يتحرك فقط عندما مطعون؛ الصف 1.5 = يتحرك قليلا عندما مطعون؛ الصف 2.0 = لا يتحرك عندما مطعون.
    5. تسجيل جلد المستلمين: الصف 0 = لا سحجات أو آفات أو تحجيم؛ الصف 0.5 = احمرار في منطقة واحدة محددة؛ الصف 1 = الكشط في منطقة واحدة أو كشط خفيف في منطقتين؛ الصف 1.5 = سحجات خطيرة في منطقتين أو أكثر؛ الصف 2.0 = سحجات شديدة، تكسير الجلد، والدم المجفف.
    6. تسجيل الفراء من المستلمين: الصف 0 = لا علامات غير طبيعية; الصف 0.5 = التخلص على جانب البطن أو مؤخر الرقبة ، الصف 1.0 = التخلص عبر أو جانب البطن والرقبة ؛ الصف 1.5 = غير مهذب والفراء ruffed؛ الصف 2.0 = الفراء مطفأ بشكل سيئ على البطن والظهر.
    7. تسجيل الإسهال من المتلقين: الصف 0 = لا الإسهال; الصف 0.5 = البراز طفيف ولينة؛ الصف 1.0 = معتدل (البراز الأصفر)؛ الصف 1.5 = معتدل (البراز الأصفر مع القليل من الدم)؛ الصف 2 = شديدة (أصفر فاتح والبراز الدموي، "براز الكعكة المجففة" تظهر في منطقة الكل).

2. نموذج الزرع المشترك

  1. توليد خلايا التشجرات المستمدة من نخاع العظم (BM-DCs).
    1. عزل نخاع العظم من عظم الفخذ والطيبي من WT أو العامل B (fB)-/- الفئران على خلفية B6 كما هو موضح في الخطوات 1.2.3−1.2.4. تدور الخلايا في 800 × ز لمدة 5 دقيقة.
    2. إعادة تعليق بيليه في 5 مل من ACK العازلة التليس لخلايا الدم الحمراء. احتضان تعليق الخلية لمدة 5 دقيقة على الجليد. أضف 10 مل من 1٪ RPMI إلى تعليق الخلية لوقف الانفصال والطرد المركزي في 800 × ز لمدة 5 دقيقة عند 4 درجة مئوية. تجاهل السوبرناستانت.
    3. إعادة تعليق الكريات الخلية في 10 مل من وسائل الإعلام الثقافة (RPMI 1460 التي تحتوي على 10٪ FBS، 100 U/mL من البنسلين / streptomycin، 2 mM l-الجلوتامين، و 50 mM α-mercaptoethanol) وضبط حجم لتلبية التركيز النهائي من 2 × 106 خلايا / مل.
    4. أضف 20 نانوغرام/مل عامل تحفيز للمستعمرة الحبيبية/مل (GM-CSF) إلى تعليق الخلايا. ثقافة خلايا نخاع العظام في 100 × 15 ملم أطباق بيتري في 37 درجة مئوية في 5٪ CO2 لمدة 6 أيام.
    5. استبدال نصف الوسائط الثقافية الجارية (حوالي 5 مل) بوسائط جديدة تحتوي على 40 نانوغرام/مل من GM-CSF في اليوم الثالث.
    6. Prewarm وسائل الإعلام الثقافة في حمام مائي في 37 درجة مئوية. جمع حوالي 5 مل من وسائل الإعلام من أطباق ثقافة نخاع العظم. جهاز طرد مركزي عند 800 × ز لمدة 5 دقيقة عند 4 درجات مئوية. تجاهل السوبرناستانت. إعادة تعليق بيليه الخلية في 5 مل وسائل الإعلام الثقافة التي تحتوي على 40 نانوغرام / مل GM-CSF.
    7. إضافة 25 ميكروغرام / مل lipopolysaccharide (LPS) إلى وسائل الإعلام في اليوم 6 من الثقافة لتنضج BM-DCs. حفظ aliquot من 2 × 106 خلايا لتحديد فعالية التمايز DC عن طريق قياس التدفق الخلوي.
    8. جمع نضجت BM-DCs: استخدام رافعي الخلايا لكشط بهدوء DCs من أطباق بيتري. جمع كل تعليق الخلية في أنابيب مخروطية 50 مل. الطرد المركزي في 800 × ز، لمدة 5 دقيقة عند 4 درجة مئوية. تجاهل السوبرناستانت. غسل الكريات الخلية 3x مع 50 مل من الجليد الباردة PBS. حفظ حوالي 2 × 106 BM-DCs لتحليل النمط الظاهري المناعي عن طريق قياس التدفق الخلوي.
  2. إجراء زرع مشترك للخلايا التشجرات من BMT (DC-cotransplanting BMT).
    ملاحظة: استخدم FVB (H2kq)الفئران كمتبرعين للخلايا التائية وخلايا BM. تشعيع B6 Ly5.1 الفئران المتلقيب بجرعة 1100 cGy (جرعتين، 3 ساعة الفاصل الزمني). انظر التفاصيل في الخطوة 1.1.
    1. عزل BM من الفخذ والطيبي من الفئران المانحة FVB. راجع التفاصيل في الخطوات 1.2.3−1.2.10.
      ملاحظة: استخدام إجمالي نخاع العظم المعزول بدلاً من TCD-BM في هذا النموذج.
    2. تنقية الخلايا التائية من الطحال والغدد الليمفاوية للفئران المانحة FVB. انظر التفاصيل في الخطوات 1.3.1-1.3.13.
    3. حقن BM (5 × 106/ الماوس) ، والخلايا التائية (0.5 × 106/ الماوس) مع BM -DCs (2 × 106/ الماوس) في اليوم 0 من الدورة التجريبية.
    4. في اليوم 3 بعد زرع, فحص إعادة تشكيل DC المانحة عن طريق تدفق الخلايا.
      1. جمع الدم من عيون المتلقين.
      2. تطفل CD45.1/Ly5.1 B6 الفئران بنسبة 3٪ استنشاق الإيأوفلوران. تحقق من عمق التخدير بسبب عدم الاستجابة لقرصة إصبع القدم.
      3. ضع أنبوب ماصة زجاجي معقم في العلبة المنسّمة للعين الموجهة بزاوية 30-45 درجة من مستوى الأنف. تطبيق الضغط أثناء تدوير الأنبوب بلطف.
      4. إسقاط الدم في 10 ميكرولتر الهيبارين التي تحتوي على أنابيب مركزية دقيقة 1.5 مل. نقل 50 ميكرولتر من الدم إلى 5 أنابيب تدفق الزجاج مل.
      5. إضافة 2 مل من المخزن المؤقت ACK التليس. احتضان في 37 درجة مئوية في حمام مائي لمدة 45 دقيقة. إضافة 2 مل من FACS تلطيخ العازلة. جهاز طرد مركزي عند 800 × ز لمدة 5 دقيقة عند 4 درجات مئوية. تجاهل السوبرناستانت.
      6. إعادة تعليق كريات الخلية مع 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت FACS التي تحتوي على الأجسام المضادة تلطيخ التدفق المناسب (العيش / الموت الأصفر، α-H-2Kب،α-CD45.1، α-CD45.2، α-CD11c، وα-MHCII). احتضان لمدة 15 دقيقة في 4 درجة مئوية في الظلام. غسل 2x مع 1 مل FACS المخزن المؤقت. إعادة تعليق الكريات الخلية في 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت FACS وإجراء التحليل عن طريق قياس التدفق الخلوي.

3. نماذج GVHD / GVL من BMT

  1. أداء التعريفي GVHD / GVL.
    1. ثقافة لوسيفيراز نقل A20 B سرطان الغدد الليمفاوية الخلية في وسائل الإعلام ثقافة RPMI.
    2. تشعيع BALB / ج في الخلفية WT أو Ly5.1 المتلقي في 700 cGy (جرعة واحدة). انظر التفاصيل في الخطوة 1.1.
    3. عزل TCD-BM من عظم الفخذ والطيبي من B6. Ly5.1 الفئران المانحة. راجع التفاصيل في الخطوات 1.2.1−1.2.10.
    4. تنقية الخلايا التائية من الطحال والغدد الليمفاوية من الفئران المانحة C57BL/6. راجع التفاصيل في الخطوات 1.3.1−1.3.15.
    5. غسل A20 الليمفاوية 2x مع 25 مل من برنامج تلفزيوني. إعادة تعليق الكريات الخلية في 10 مل من الجليد الباردة PBS. اتخاذ aliquot تعليق الخلية (10 ميكرولتر) وحساب الخلايا باستخدام 1٪ trypan الأزرق ومقياس الهيوكتومتر. ضبط تركيز الخلية إلى 20،000 خلية / مل.
    6. حقن TCD-BM (5 × 106/ الماوس) مع أو بدون الخلايا التائية (0.75 × 106/ الماوس) وسرطان الغدد الليمفاوية A20 (5000 خلية / فأرة).
    7. متابعة بقاء المتلقي، والعلامات السريرية GVHD، وفقدان وزن الجسم خلال الدورة التجريبية. انظر التفاصيل في الخطوة 1.5.
  2. إجراء التصوير الحيوي.
    1. مراقبة نمو الورم في المتلقي المزروعة عن طريق حقن الفئران المتلقي مع 4 ملغ من D-لوسيفيرين. احتضان لمدة 5 دقيقة لضمان يتفاعل لوسيفيرين مع لوسيفيراز.
    2. قم بتنويم الفأرة باستخدام 3٪ من الإيزوفلوران في غرفة صور الإضاءة الحيوية وصورة المستلمين لمدة 5 دقيقة في الحقل D ووقت التعرض لمدة 1 دقيقة.
    3. تحليل البيانات باستخدام برنامج تحليل الصور. تغيير مقياس الصور الملونة الزائفة للحصول على أفضل النتائج.
      ملاحظة: يجب أن تكون كافة الصور على نفس المقياس عبر التجارب.
    4. استخدم برنامج تحليل الصور لتحديد المناطق ذات الأهمية وتحديد كثافة الإشارة عن طريق حساب التدفق (الفوتوات/الفوتوات) المنبعثة من كل منطقة من المناطق ذات الاهتمام.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

نموذج MHC غير المتطابقة الرئيسية B6 (H2k b)-BALB/C (H2kd)يتوافق بشكل وثيق مع تطور GVHD بعد الزرعb(الشكل 2). حدثت جميع العلامات السريرية الست GVHD التي وضعها كوك وآخرون16 في المتلقين المزروعين بخلايا WT-B6 T ولكن ليس في المستلمين المزروعين بـ BM وحده (الخطوة 1.5) ، والتي مثلت المجموعة السلبية GVHD. هناك مرحلتين في تطوير GVHD في هذا النموذج. أولاً، ذروة الشدة هي حوالي 11 يوماً بعد الزرع، يليها انخفاض في الدرجات السر...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

استخدام الخلايا الجذعية لتناسب فرد معين هو نهج فعال لعلاج السرطانات المتقدمة والمقاومة18. المستحضرات الصيدلانية جزيء صغير، ومع ذلك، ظلت لفترة طويلة التركيز الرئيسي لعلاج السرطان شخصية. من ناحية أخرى ، في العلاج الخلوي يمكن أن تؤثر العديد من التفاعلات بين المانح والمضيف بشكل حاسم على نتائج العلاج ، مثل تطوير GVHD بعد BMT1.

نماذج الماوس MHC غير متطابقة الرئيسية من BMT هي أداة قيمة في فهم بيولوجيا GVHD واختبار فعالية الأدوية في علاجها. من بينها، C57...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

وليس لدى أصحاب البلاغ أي تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

ويدعم هذه الدراسة من جامعة وسط فلوريدا كلية الطب بدء المنحة (لHN), جامعة بيتسبرغ المركز الطبي هيلمان مركز السرطان بدء منحة (إلى HL), الولايات المتحدة المعاهد القومية للصحة منحة #1P20CA210300-01 ووزارة الصحة الفيتنامية منحة #4694/ QD-BYT (إلى PTH). نشكر الدكتور شيوي تشونغ يو في جامعة كارولينا الجنوبية الطبية لتوفير المواد اللازمة للدراسة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
0.5 متر EDTA درجة الحموضة 8.0 100 ملفيشر ساينتفيكBP2482100MACS عازلة
10X PBSفيشر ScientificBP3994MACS عازلة
A20 سرطان الغدد الليمفاوية للخلايا البائيةجامعة سنترال فلوريداتجربةGVL
ACC1 fl / flJackson Lab30954تجربة GVL
ACC1 fl / fl CD4creجامعة سنترال فلوريداتجربة GVL
المضادة للبيوتين MicroBeadsMiltenyi Biotec130-090-485تخصيب الخلايا التائية
المضادة للإنسان / الفأر CD45R (B220)Thermo Fisher Scientific13-0452-85تخصيب الخلايا التائية
المضادة للفأر B220 FITCThermo Fisher Scientific10452-85تحليل قياس التدفق الخلوي
مضاد للفأر CD11c- AF700ثيرمو فيشر علمي117319تحليل قياس التدفق الخلوي
المضاد للفأر CD25 PEثيرمو فيشر العلمي12-0251-82تلطيخ التدفق
المضاد للفأر CD4 البيوتينالحراري فيشر العلمي13-0041-86تخصيب الخلايا التائية
المضادة للفأر CD4 eFluor & reg ؛ 450 (المحيط الهادئ الأزرق & reg ؛ استبدال)ثيرمو فيشر العلمي48-0042-82تلطيخ التدفق
المضاد للفأر CD45.1 PEThermo Fisher Scientific12-0900-83تحليل قياس التدفق الخلوي
مضاد للفأر CD8a APCThermo Fisher Scientific17-0081-83تحليل قياس التدفق
مضاد للفأر H-2Kb PerCP-Fluor 710Thermo Fisher Scientific46-5958-82تحليل قياس التدفق
مضاد للفأر معقد التوافق النسيجي الكبير من الفئة الثانية الجسم المضاد APCThermo Fisher Scientific17-5320-82تحليل قياس التدفق الخلوي
مكافحة الفأر TER-119 البيوتينالحرارية فيشر العلمية13-5921-85تخصيب الخلايا التائية
المضادة ل Thy1.2Bio ExcelBE0066BM الجيل
B6 fB-/- < / sup> الفئرانجامعة سنترال فلوريدافي المنزلالمستلمين
B6. Ly5.1 (CD45.1+< / sup>) الفئرانتشارلز ريفر564المتبرع
BALB / c الفئرانتشارلز ريفر028متلقي الزرع
C57BL / 6 الفئرانتشارلز ريفر027المتبرعون / المستلمون
CD11bثيرمو فيشر العلمي13-0112-85تخصيب الخلايا التائية
CD25-البيوتينثيرمو فيشر العلمي13-0251-82إثراء الخلايا التائية
CD45RThermo Fisher Scientific13-0452-82تخصيب الخلايا التائية
CD49b الجسم المضاد أحادي النسيلة (DX5) - البيوتينالحراري فيشر العلمي13-5971-82تخصيب الخلايا التائية
40 ميكرومترتحضير الخلية22363547
مصفاة الخلية 70 ميكرومترتحضير خلية
22363548 الحراريةD-LuciferinGoldbioLUCK-1Gتصوير الحية
مصل الأبقار الجنينية (FBS)Atlanta Bilogicals R & نظام DD17051الخلوي لثقافة
فيشر العلمي352008تحليل قياس التدفق الخلوي
FVB / NCrlنهر تشارلز207المتبرعون
بولي الساكاريد الدهني (LPS)Millipore SigmaL4391-1MGDC ناضجة
LS العمودMitenyi Biotec130-042-401تحضير الخلية
MidiMACSMiltenyi Biotec130-042-302تخصيب الخلايا التائية
حاضنة نيو برونزويك جالاكسي 170REppendorfGalaxy 170 RCell Culture
Penicilin + ستربتومايسينبنسلين / ستربتومايسين (10,000 وحدة البنسلين / 10,000 مجم / مل البكتيريا)GIBCO15140Media
RPMI 1640Thermo Fisher Scienctific11875-093Media
TER119Thermo Fisher علمي13-5921-82تخصيب الخلايا التائية
Xenogen IVIS-200Perkin ElmerXenogen IVIS-200التصوير الحي للحيوانات
X-RAD 320 المشعع البيولوجيالدقيق X-RAYX-RAD 320تشعيع الجسم الكلي
في المنزل الخلوي الخلوي مصفاة خلية الحرارية أنابيب قياس التدفق الخلية

المراجع

  1. Shlomchik, W. D. Graft-versus-host disease. Nature Reviews Immunology. 7, 340-352 (2007).
  2. Appelbaum, F. R. Haematopoietic cell transplantation as immunotherapy. Nature. 411, 385-389 (2001).
  3. Blazar, B. R., Murphy, W. J., Abedi, M. Advances in graft-versus-host disease biology and therapy. Nature Reviews Immunology. 12, 443-458 (2012).
  4. Pasquini, M. C., Wang, Z., Horowitz, M. M., Gale, R. P. 2010 report from the Center for International Blood and Marrow Transplant Research (CIBMTR): current uses and outcomes of hematopoietic cell transplants for blood and bone marrow disorders. Clinical Transplantation. , 87-105 (2010).
  5. Schroeder, M. A., DiPersio, J. F. Mouse models of graft-versus-host disease: advances and limitations. Disease Model & Mechanism. 4, 318-333 (2011).
  6. Graves, S. S., Parker, M. H., Storb, R. Animal Models for Preclinical Development of Allogeneic Hematopoietic Cell Transplantation. ILAR Journal. , ily006(2018).
  7. Sprent, J., Schaefer, M., Korngold, R. Role of T cell subsets in lethal graft-versus-host disease (GVHD) directed to class I versus class II H-2 differences. II. Protective effects of L3T4+ cells in anti-class II GVHD. Journal of Immunology. 144, 2946-2954 (1990).
  8. Rolink, A. G., Radaszkiewicz, T., Pals, S. T., van der Meer, W. G., Gleichmann, E. Allosuppressor and allohelper T cells in acute and chronic graft-vs-host disease. I. Alloreactive suppressor cells rather than killer T cells appear to be the decisive effector cells in lethal graft-vs.-host disease. The Journal of Experimental Medicine. 155, 1501-1522 (1982).
  9. Lu, Y., Waller, E. K. Dichotomous role of interferon-gamma in allogeneic bone marrow transplant. Biology of Blood and Marrow Transplantation. 15, 1347-1353 (2009).
  10. Abdollahi, A., et al. Inhibition of platelet-derived growth factor signaling attenuates pulmonary fibrosis. The Journal of Experimental Medicine. 201, 925-935 (2005).
  11. Banchereau, J., Steinman, R. M. Dendritic cells and the control of immunity. Nature. 392, 245-252 (1998).
  12. Stenger, E. O., Turnquist, H. R., Mapara, M. Y., Thomson, A. W. Dendritic cells and regulation of graft-versus-host disease and graft-versus-leukemia. Blood. 119, 5088-5103 (2012).
  13. Ullmann, A. J., et al. Posaconazole or fluconazole for prophylaxis in severe graft-versus-host disease. New England Journal of Medicine. 356, 335-347 (2007).
  14. Dittel, B. N. Depletion of specific cell populations by complement depletion. Journal of Visualized Experiments. , (2010).
  15. Nguyen, H. D., et al. Metabolic reprogramming of alloantigen-activated T cells after hematopoietic cell transplantation. Journal of Clinical Investigation. 126, 1337-1352 (2016).
  16. Cooke, K. R., et al. An experimental model of idiopathic pneumonia syndrome after bone marrow transplantation: I. The roles of minor H antigens and endotoxin. Blood. 88, 3230-3239 (1996).
  17. Nguyen, H., et al. Complement C3a and C5a receptors promote GVHD by suppressing mitophagy in recipient dendritic cells. Journal of Clinical Investigation Insight. 3, (2018).
  18. McNutt, M. Cancer immunotherapy. Science. 342, 1417(2013).
  19. Negrin, R. S., Contag, C. H. In vivo imaging using bioluminescence: a tool for probing graft-versus-host disease. Nature Reviews in Immunology. 6, 484-490 (2006).
  20. Roy, D. C., Perreault, C. Major vs minor histocompatibility antigens. Blood. 129, 664-666 (2017).
  21. Gendelman, M., et al. Host conditioning is a primary determinant in modulating the effect of IL-7 on murine graft-versus-host disease. Journal of Immunology. 172, 3328-3336 (2004).
  22. Li, J., et al. HY-Specific Induced Regulatory T Cells Display High Specificity and Efficacy in the Prevention of Acute Graft-versus-Host Disease. Journal of Immunology. 195, 717-725 (2015).
  23. Zeiser, R., et al. Early CD30 signaling is critical for adoptively transferred CD4+CD25+ regulatory T cells in prevention of acute graft-versus-host disease. Blood. 109, 2225-2233 (2007).
  24. Sadeghi, B., et al. GVHD after chemotherapy conditioning in allogeneic transplanted mice. Bone Marrow Transplant. 42, 807-818 (2008).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

B A20
منصة زرع نخاع العظم للتحقيق في دور الخلايا التطبيب في مرض الكسب غير المشروع مقابل المضيف
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.