مقالة منهجية

خليه واحده الطموح الصغير كاستراتيجية بديله لفرز الخلايا المنشطة الفلورية لفصل خليط الفيروسات العملاقة

DOI:

10.3791/60148

⸱

أكتوبر 27, 2019

 ,  ,  ,  ,  , 
1Institut Hospitalo-Universitaire (IHU) - Méditerranée Infection, 2Microbes, Evolution, Phylogeny and Infection (MEΦI), Aix-Marseille Université UM63, Institut de Recherche pour le Développement IRD 198, Assistance Publique - Hôpitaux de Marseille (AP-HM)

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا ، ونحن وصف خليه واحده الطموح الصغير طريقه للفصل بين الأميبا المصابة. [أين وردر تو] فصلت [سوببوبولايشن] فيروسية في [ فرماميبا] [فرميفورليس ] يعدي ب [فوستوفيروس] وحميات عملاقه مجهوله, طور نحن البروتوكول مفصل أدناه ويبرهن قدرته ان يفصل اثنان [لوو-فري] رواية فيروسات عملاقه.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

خلال عمليه الثقافة المشتركة الأميبا ، قد يتم عزل أكثر من فيروس واحد في بئر واحده. نحن في السابق حل هذه المسالة عن طريق تخفيف نقطه النهاية و/أو الفرز الخلية المنشطة (FACS) تطبيقها علي السكان الفيروسية. ومع ذلك ، عندما يكون للفيروسات في الخليط خصائص مورفولوجيك مماثله واحده من الفيروسات تتكاثر ببطء ، يتم اكتشاف وجود اثنين من الفيروسات في مرحله التجمع الجينوم والفيروسات لا يمكن فصلها لمزيد من التوصيف. ولحل هذه المشكلة ، قمنا بوضع اجراء أحادي الطموح للخلية يسمح بفصل واستنساخ فيروسات متشابهة للغاية. في هذا العمل ، نقدم كيف سمحت لنا هذه الاستراتيجية البديلة لفصل السكان الفرعيين الفيروسية الصغيرة من كلانديستينوفيروس ST1 والفيروسات المغتصبة LCD7 ، والفيروسات العملاقة التي تنمو ببطء ولا تؤدي إلى تحلل الأميبا بالمقارنة مع التحللي وسريع النمو فوستوفيروس. وتم تقييم الرقابة علي النقاء بواسطة تضخيم جيني محدد ، وأنتجت فيروسات لمزيد من التوصيف.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الفيروسات الحمضية النووية الكبيرة النواة (NCLDV) متنوعة للغاية ، والتي تحددها أربع عائلات تصيب نواه النوى1. ووصفت الفيروسات الاولي مع الجينوم أعلاه 300 وكانت Phydcodnaviridae, بما في ذلك الفيروس بيرساريا شلوريلا باراسينيوم 1 PBCV12. العزلة والوصف الأول من Mimivirus ، وأظهرت ان حجم الفيروسات تضاعف من حيث حجم الجسيمات (450 نانومتر) وطول الجينوم (1.2 Mb)3. ومنذ ذلك الحين ، تم وصف العديد من الفيروسات العملاقة ، وعاده ما تكون معزولة باستخدام اجراء الأميبا الثقافة المشتركة. يمكن عزل العديد من الفيروسات العملاقة مع المتحولات المختلفة والمحتويات الوراثية من Acanthamoeba sp. الخلايا ، بما في ذلك مرسيليا ، الفيروسات Pandoraviruses ، الفيروسات ، الفيروسات ، الحمى الطفيلية ، الفيروسات ، ومؤخرا فيروس الورم النخاعي4،5،6،7،8،9،10،11،12، 13،14،15،16،17. في الوقت نفسه ، فان عزله vermamoeba vermamoeba يسمح العزلة ووصف الفيروسات العملاقة faustovirus ، kaumoebavirus ، و اورففيروس18،19،20. تم عزل الفيروسات العملاقة الأخرى مع الأطباء المضيفين ، مثل كافتيريا roenbergensis21، aureococcus أنوفاجيفيرينس22، تشريسوتشرومولينا اريك23، والقفطان بودو 24-الآن وكانت جميع هذه العزلات نتيجة لعدد متزايد من الفرق العاملة في العزل وإدخال تحديثات استراتيجية الانتاجيه العالية25،26،27،28، مثل تحسين نظام الثقافة المشتركة مع استخدام التدفق الخلوي.

في 2016 ، استخدمنا استراتيجية ربط الثقافة المشتركة وتدفق الخلوية لعزل الفيروسات العملاقة27. وقد وضعت هذه الاستراتيجية لزيادة عدد العينات الملقحة ، ولتنويع الأطباء الداعمين المستخدمين كدعامات للخلايا ، وللكشف بسرعة عن تحلل دعم الخلايا. تم تحديث النظام عن طريق أضافه خطوه اضافيه لتجنب تحديد البيولوجيا الجزيئية الاوليه والكشف السريع عن السكان الفيروسية غير معروف كما هو الحال في Pacmanvirus29. اقتران تدفق الخلوي لفرز الخلايا يسمح للفصل بين خليط من Mimivirus و Cedratvirus A1130. ومع ذلك ، واجهنا في وقت لاحق قيود الانفصال والكشف عن هذه السكان الفرعية الفيروسية عن طريق تدفق الخلوي. بعد التسلسل ، عندما جمعنا الجينوم من Faustovirus ST125 و FAUSTOVIRUS LCD7 (البيانات غير المنشورة) ، وجدنا بشكل مدهش في كل تجميع اثنين من الجينوم التكميلي لفيروسين جديدين لم يتم تحديدهما في قواعد بيانات الجينوم العام. ومع ذلك ، فان لا تدفق الخلوي ولا انتقال المجهر الكتروني (TEM) أظهرت ان الأميبا كانت مصابه بفيروسين مختلفين ، كلانديستينوفيروس ST1 و مغتصب الفيروسات LCD7. قمنا بتصميم أنظمه PCR محدده لتضخيم فوستوفيروس ، والفيروسات المغتصبة ، وعلامات كلانديستينوفيروس علي التوالي علي أساس الجينوم الخاصة بهم. كان هدفنا ان يكون النظام القائم علي PCR التي تمكن التحقق من نقاء الفيروسات التي يتم فصلها. ومع ذلك ، فشل التخفيف نقطه النهاية والتدفق الخلوي للفصل بينهما. وكانت عزله هذه المجموعة الفيروسية الوحيدة صعبه لأنه لم يتم وصف العناصر المورفولوجية والمستنسخة لكلانديستينوفيروس والسكان المغتصبين. اكتشفنا واحد فقط من السكان الفيروسية من خلال تدفق الخلوية بسبب تداخل السكان اثنين (اختبار بعد الانفصال الفعلي). حاولنا فصلهم باستخدام واحد الجسيمات الفرز علي لوحات 96-حسنا ، ولكن لم نلاحظ اي اثار خلوي ، واكتشفنا لا كلانديستينوفيروس ولا مغتصب الفيروسات بواسطة PCR التضخيم. وأخيرا ، لم يكن سوي مزيج من تخفيف نقطه النهاية تليها الأميبا الصغيرة الطموح الذي مكن الفصل بين هذين الفيروسات العملاقة منخفضه الوفرة من فوستوفيروس. هذا الأسلوب للفصل هو الكائن من هذه المقالة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. الأميبا الثقافة

  1. استخدام فيرماميبا vermamoeba (سلاله CDC19) كدعم الخلية.
  2. أضافه 30 مل من البروتياز-peptone-استخراج الخميرة-الجلوكوز المتوسطة (PYG) (الجدول 1) و 3 مل من الأميبا في تركيز 1 × 106 خلايا/مل في 75 سم2 خليه ثقافة قارورة.
  3. الحفاظ علي الثقافة عند 28 درجه مئوية.
  4. بعد 48 h ، كميه الأميبا باستخدام الشرائح العد.
  5. لشطف ، حصاد الخلايا في تركيز 1 × 106 خلايا/مل وبيليه الأميبا بواسطة طرد في 720 x g ل 10 دقيقه أزاله ماده طافي وأعاده تعليق بيليه في الحجم المناسب من الجوع المتوسطة للحصول علي 1 × 106 الخلايا/مل (الجدول 1).

2. انتشار فيروس الأسهم في اموباي

ملاحظه: قبل التخفيف ، من المهم ان ثقافة عينه الأسهم للحصول علي ما يكفي من الثقافة الطازجة ، ثم المضي قدما في الترشيح.

  1. استخدام 1 × 106 من الثقافة الأميبا في المجاعة المتوسطة.
  2. تطعيم خليط من الفيروسات الصادرة من الحل الأسهم (فوستوفيروس/مغتصب الفيروس LCD7 أو Faustovirus/كلانديستينوفيروس ST1) بعد عمليه الثقافة المشتركة علي دعم الخلية في تعدد العدوى (موي) من 0.01.
    ملاحظه: ومن المهم لوزارة الداخلية الحد من وفره السكان الفيروسيين الرئيسيين وعدد الخلايا المصابة.
  3. احتضان في 30 درجه مئوية حتى اثار خلوي (CPE) والمستحثة ، مثل التقريب الأميبا أو تحلل ، ما يقرب من 10 إلى 14 ساعة بعد الاصابه.
  4. جمع وسائل الاعلام والترشيح من خلال فلتر 5 μm لأزاله الحطام الخلوي.

3. نهاية نقطه التخفيف

  1. تنفيذ التخفيف التسلسلي (10-1 إلى 10-11) من العينة الفيروسية في المجاعة المتوسطة (الجدول 1).
  2. تطعيم 2 مل من 1 × 106 vermamoeba vermamoeba الواردة في كل طبق بتري مع 100 μl من الخليط الداخل.
  3. وضع اطباق بيتري في كيس من البلاستيك القابلة للإغلاق في 30 درجه مئوية.
  4. بدء مراقبه اطباق بيتري مع المجهر البصري المقلوب في 6 ح بعد الاصابه والتحقق من الشكل الخلية كل 4 إلى 8 ح.
  5. في ظهور تاثير خلوي تتميز الخلايا التقريب ، تبدا عمليه الصغيرة الخلية الطموح.

4. خليه واحده الطموح الصغير

  1. اعداد المضيف.
    ملاحظه:     يتم اجراء هذا الاعداد للإفراج عن خلايا واحده مصابه إلى دعم خليه جديده.
    1. علاج الأميبا في الثقافة مع عامل مضادات الميكروبات التي تحتوي علي 10 ميكروغرام/مل من فانكوميسين ، 10 ميكروغرام/مل من imipenem ، 20 ميكروغرام/مل من ciprofloxacin ، 20 ميكروغرام/مل من الدوكسيسيكلين ، و 20 ميكروغرام/مل من voriconazole. يستخدم هذا الخليط لتجنب التلوث البكتيري والفطري.
      ملاحظه: يتم الاجراء علي مقعد خارج محطه السلامة الميكروبيولوجية. أضافه 2 مل من اموباي تتركز في 1 × 106 خلايا/مل كل في 15 اطباق بيتري. للانضمام الأميبا ، احتضان الثقافة في 30 درجه مئوية لمده 30 دقيقه.
  2. حدد طبق بيتري المستخدم لتحقيق الطموح المتناهي الصغر من تخفيف الحد وفقا للمعايير التالية: 1) عدم وجود اي تلوث مرئي من قبل العوامل الفطرية والبكتيرية ، 2) دليل علي تاثير الأميبا من اموباي بسبب الفيروسات ، و 3) بريليسيس والتقريب المرحلة من اموباي (لتجنب الطموح من الجزيئات الفيروسية).
  3. اعداد محطه عمل بالمواد التالية (انظر الشكل 1ا ، ب):
    الجزئي ، والذي يسمح لتحديد المواقع ميكروشعري ؛
    دليل جهاز ضغط التحكم ، وتستخدم ليستنشق والإفراج عن الخلايا في ميكروشعري.
    المجهر المقلوب;
    التوصيل والتشغيل وحدات المحرك;
    كاميرا
    وحده الكمبيوتر لتصور التلاعب والتقاط الصور.
  4. اختيار ميكروشعري (انظر الشكل 1ج).
    ملاحظه: حجم الخلايا ، وتشوه والتصاق اغشيها علي الأسطح ، والحركية الخلوية يمكن ان تؤثر علي التقدم السلس للتطلع الصغرى. يمكن اختيار قطر الشعيرات المجهرية بدقه وتكييفها مع أنواع خلايا محدده اعتمادا علي احجامها وطرق الطموح. وقد استخدم ميكروشعري من القطر الداخلي 20 ميكرومتر ليستنشق الأميبا التقريب (قطر ~ 10 μm). وهذا يسمح بالحفاظ علي موقف داخلي وسهوله الإفراج عن الخلية.
  5. جبل النظام.
    1. إصلاح زاوية التشغيل للنظام تجتاح علي وحده بمحرك في 45 درجه.
    2. اجراء تثبيت مزدوج ، أولا علي نظام تجتاح ، ومن ثم علي ميكروشعري.
    3. التركيز علي الخلايا بعد تشغيل بضع قطرات من النفط من خلال ميكروشعري.
      ملاحظه: يتم توفير النفط المعدنية مع التوافق البيولوجي من قبل الجهاز.
    4. إكمال المتزايدة التالية توصيات الشركة المصنعة.
  6. استنساخ الخلايا (انظر الشكل 2ا ، ب).
    ملاحظه:     هذا الاجراء مشابه لواحده التي وصفها Fröhlich و كونيغ31.
    1. ضع طبق بيتري الذي يحتوي علي 2 مل من اموباي المصابة تحت المجهر.
    2. التركيز أولا علي الخلايا ، ومن ثم علي ميكروشعري مغمورة في الثقافة.
    3. اختيار خليه واحده مدوره وجلب ميكروشعري أقرب إلى الجزئي.
    4. ممارسه الطموح الناعم مع التحكم في الضغط اليدوي علي الخلية ، مع الأخذ بها داخل ميكروشعري. أزاله خليه واحده من العينة الاولي والإفراج في دعم الخلوية ، ثم احتضان عليه في 30 درجه مئوية.
    5. اجراء الملاحظات اليومية مع المجهر البصري المقلوب لمراقبه ظهور الخلايا ورصد ظهور تاثير السيتواثيك.

5. فحص PCR

ملاحظه: وبعد الخطوة 4 ، يعد الفحص المنهجي من قبل PCR أمرا حاسما لتاكيد الانفصال. في كل من الفيروسات المغتصبة/Faustovirus و كلانديستينوفيروس/Faustovirus ، تم تصميم وتطبيق التمهيدي محدده ونظم التحقيق باستخدام التمهيدي الانفجار علي الإنترنت32 (الجدول 2).

  1. استخراج الحمض النووي من جزء من عينات الثقافة الايجابيه (اي ، حيث لوحظ تاثير خلوي) ، وذلك باستخدام نظام استخراج الألى وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
  2. استخدام الإشعال مصممه بشكل مناسب.
    ملاحظه: هنا قمنا بتصميم الإشعال لتضخيم الجينات الاساسيه المشروحة كما RpB2 (فوستوفيروس) ، LCD7 البروتين كابسيد الرئيسية (المغتصبة) والبروتين كابسيد طفيفه (كلانديستينوفيروس)
  3. اجراء PCR القياسية باستخدام ثيرموسيكلير.
    1. تنفيذ 20 μL PCR ردود الفعل مع 50 μM من كل التمهيدي (الجدول 2) ، 1X ماستر ميكس ، و RNase المياه الحرة.
    2. قم بتنشيط الحمض النووي الريبي لمده 5 دقائق عند 95 درجه مئوية ، ثم اتبع مع 45 دوره من 10 ليالي التشبع في 95 درجه مئوية ، والصلب من الإشعال لمده 30 ثانيه في 58 درجه مئوية ، والتمديد ل 30 ثانيه في 72 درجه مئوية.
  4. تشغيل المنتجات PCR علي هلام 1.5 ٪ اجنشا ، وصمه عار مع هلام الحمض النووي وصمه عار (جدول المواد) ، وتصور مع الاشعه فوق البنفسجية.

6. إنتاج وتنقيه الفيروسات

  1. وضع بقية الثقافة طبق بيتري مره أخرى في قارورة صغيره.
  2. لإنتاج الفيروس ، واعداد 15 قوارير من 145 سم2، التي تحتوي علي 40 مل من vermamoeba فيرميفورليس في المجاعة المتوسطة و 5 مل من الفيروس معزولة نقلت بالفعل من طبق بيتري إلى قوارير صغيره.
  3. علاج بنفس المضادات الحيوية والخليط المضاد للفطريات المستخدم في الخطوة 4.1.
  4. احتضان في 30 درجه مئوية. راقب كل يوم مع المجهر البصري المقلوب.
  5. بعد العدوى الكاملة ، تجمع جميع قوارير. استخدام فلتر 0.45 μm للقضاء علي الحطام.
  6. Ultracentrifuge جميع supernatants في 50,000 x g ل 45 دقيقه.
  7. بعد طرد ، وأزاله ماده طافي من كل أنبوب عن طريق الطموح وأعاده تعليق بيليه في 1 مل من الفوسفات المالحة المخزنة مؤقتا (تلفزيوني).
  8. تنقيه الفيروس المنتجة باستخدام السكروز 25 ٪ (27.5 ز السكروز في 100 mL من تلفزيوني ، تعقيمها عن طريق الترشيح).
  9. الطرد المركزي 8 مل من السكروز و 2 مل من تعليق الفيروسية في 80,000 x g لمده 30 دقيقه. أعاده تعليق بيليه الفيروسية في 1 مل من تلفزيوني. خزنه في-80 درجه مئوية.

7. السلبية تلطيخ وانتقال المجهر الكترون

ملاحظه: وقد نشر بو خليل وآخرون هذاالبروتوكول فيالسابق.

  1. إيداع 5 μl من ماده طافي تحلل علي الشبكة التي خرجت توهج. يترك لمده 20 دقيقه تقريبا في درجه حرارة الغرفة.
    ملاحظه: وتوهج التفريغ يسمح لنا للحصول علي شبكه هيدروفيله عن طريق تطبيق البلازما.
  2. تجفيف الشبكة بعناية وإيداع قطره صغيره من 1 ٪ موليبدات الأمونيوم علي ذلك ل 10 ليالي. اترك الشبكة لتجف لمده 5 دقائق.
  3. المضي قدما إلى ملاحظات المجهر الكتروني في 200 كيلو.

8-توصيف الكلانديستينوفيروس ST1 والفيروس المغتصب LCD7

  1. توصيف السكان النقيين من كلانديستينوفيروس ST1 والفيروسات المغتصبة LCD7 باستخدام التسلسل الجينوم ، والتجمع الجينوم ، وتحليلات المعلوماتية الحيوية ، ودراسة دورتها المستنسخة كما فعلنا للفيروسات أخرى10،20، 29-الآن

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الشفط الدقيق للخلايا الواحدة هو عمليه المعالجة الجزئية الأمثل في هذه المخطوطة (الشكل 1). تمكن هذه التقنية من التقاط الأميبا المدورة المصابة (الشكل 2ا) وإطلاقها في لوحه جديده تحتوي علي اميباي غير مصاب (الشكل 2). وهو نموذج وظيفي التي تنطبق علي نظام الثقافة المشتركة ونجحت في عزل الفيروسات العملاقة غير الليتيك. وقد استخدم هذا النهج لأول مره في مجال الفيروسات العملاقة وجعل من الممكن لعزل اثنين من الفيروسات العملاقة منخفض...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وتتوقف مده معالجه الاستنشاق الدقيق للخلية الواحدة وأداءها الجيد علي المشغل. تتطلب الخطوات المختلفة للتجربة الدقة. يجب ان يكون استخدام مكونات المعالجة التفصيلية لمحطه العمل تحت السيطرة المستمرة من خلال مراقبه عمليه الطموح المتناهي الصغر وإطلاق الخلية. والمتابعة بالرصد المجهري ضرورية للقبض علي الزنزانة ونقلها. يمكن للمشغل من ذوي الخبرة ان ياخذ 1 إلى 2 ساعة لعزل 10 خلايا وأعاده نقلها واحدا تلو الآخر اعتمادا علي وفره الفيروسات التي سيتم عزلها. يمكن ان يختلف عدد التلاعبات. ونحن ننصح بداية مع 10 التلاعب. بحكم التعريف ، ونحن لا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

جميع الكتاب ليس لديهم شيء للكشف عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويود المؤلفان ان يشكرا كلا من جان بيير باودوين واوليفييه مباريك علي مشورتهما وكلير اندرياني لمساعدتها في التصحيحات والتعديلات الانكليزيه. وكان هذا العمل مدعوما بمنحه من الدولة الفرنسية التي تديرها وكاله البحوث الوطنية في اطار برنامج "إينفيستيسيمينتس d'avenir (الاستثمارات من أجل المستقبل)" مع الاشاره ANR-10-اياهو-03 (عدوي البحر المتوسط) وبواسطة ريوجيون بروفانس الألب كوت دازور والتمويل الأوروبي FEDER PRIMI.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
Agarose StandardEuromedexUnkownStandard PCR
AmpliTaq Gold 360 Master MixApplied Biosystems4398876PCR
CellTram 4r OilEppendorf5196000030التحكم في الخلايا أثناء عملية الشفط المجهري
قوارير زراعة خلايا كورنينج 150 سم 2< / sup>Sigma-aldrichCLS430825
قوارير زراعة خلايا كورنينج 25 سم 2< / sup>Sigma-aldrichCLS430639 Culture
قوارير زراعة خلايا Corning 75 سم 2< / sup>Sigma-aldrichCLS430641Culture
DFC 425C كاميراLEICAUnkownالمراقبة / المراقبة
الكسوف TE2000-S مجهر مقلوبنيكونالمألوفة
EZ1 المتقدمة XLQuiagen9001874استخراج الحمض النووي
الشريحة الزجاجية 10 مع شبكات العدKova International87144Eعدد الخلايا
Mastercycler nexusEppendorf6331000017قياسي PCR
الشعيرات الدموية الدقيقة 20 & mEppendorf5175 107.004الشفط الدقيق وإطلاق الخلايا
Micromanipulator InjectMan NI2Eppendorf631-0210المواقع الشعرية
خالية من Nuclease المياهThermoFischerAM9920قياسي PCR
Optima XPN أجهزة الطرد المركزي الفائقBECKMAN COULTERA94469تنقية الفيروسات
طبق بتري 35 ممIbidi81158ثقافة / مراقبة
مرشحات حقنة معقمة 5 & micro ؛ مSigma-aldrichSLSV025LSالترشيح
SYBR الأخضر النوع الأولInvitrogenمجسات جزيئية فلورية غير معروفة / قياس التدفق
الخلوي SYBR SafeInvitrogenS33102PCR القياسي ؛ صبغة هلام الحمض النووي
Tecnai G20FEIالمجهريةغير المقدرة
النوع 70 Ti دوار التيتانيوم بزاويةثابتة BECKMAN COULTER337922تنقية الفيروسات
أنبوب فائق الوضوح ، 25 × 89 مم < سوب > 2 < / سوب>بيكمان كولترتنقية الفيروسات344058
Culture المراقبة / المراقبة غير تحديد الدقيقة من

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Iyer, L. M., Aravind, L., Koonin, E. V. Common Origin of Four Diverse Families of Large Eukaryotic DNA Viruses. Journal of Virology. 75 (23), 11720-11734 (2001).
  2. Li, Y., et al. Analysis of 74 kb of DNA located at the right end of the 330-kb chlorella virus PBCV-1 genome. Virology. 237 (2), 360-377 (1997).
  3. Scola, B. L. A Giant Virus in Amoebae. Science. 299 (5615), 2033(2003).
  4. Philippe, N., et al. Pandoraviruses: amoeba viruses with genomes up to 2.5 Mb reaching that of parasitic eukaryotes. Science. 341 (6143), 281-286 (2013).
  5. Antwerpen, M. H., et al. Whole-genome sequencing of a pandoravirus isolated from keratitis-inducing acanthamoeba. Genome Announcements. 3 (2), 00136-00215 (2015).
  6. Legendre, M., et al. Thirty-thousand-year-old distant relative of giant icosahedral DNA viruses with a pandoravirus morphology. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (11), 4274-4279 (2014).
  7. Legendre, M., et al. In-depth study of Mollivirus sibericum, a new 30,000-y-old giant virus infecting Acanthamoeba. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (38), 5327-5335 (2015).
  8. Legendre, M., et al. Diversity and evolution of the emerging Pandoraviridae family. Nature Communications. 9 (1), 2285(2018).
  9. Aherfi, S., et al. A Large Open Pangenome and a Small Core Genome for Giant Pandoraviruses. Frontiers in Microbiology. 9, 166(2018).
  10. Andreani, J., et al. Cedratvirus, a Double-Cork Structured Giant Virus, is a Distant Relative of Pithoviruses. Viruses. 8 (11), 300(2016).
  11. Rodrigues, R. A. L., et al. Morphologic and genomic analyses of new isolates reveal a second lineage of cedratviruses. Journal of Virology. , 00372(2018).
  12. Bertelli, C., et al. Cedratvirus lausannensis- digging into Pithoviridaediversity. Environmental Microbiology. , (2017).
  13. Levasseur, A., et al. Comparison of a modern and fossil Pithovirus reveals its genetic conservation and evolution. Genome Biology and Evolution. , (2016).
  14. Dornas, F. P., et al. A Brazilian Marseillevirus Is the Founding Member of a Lineage in Family Marseilleviridae. Viruses. 8 (3), 76(2016).
  15. Yoshikawa, G., Blanc-Mathieu, R., et al. Medusavirus, a novel large DNA virus discovered from hot spring water. Journal of Virology. , (2019).
  16. Legendre, M., et al. Pandoravirus Celtis Illustrates the Microevolution Processes at Work in the Giant Pandoraviridae Genomes. Frontiers in Microbiology. 10, 430(2019).
  17. Abrahão, J., et al. Tailed giant Tupanvirus possesses the most complete translational apparatus of the known virosphere. Nature Communications. 9 (1), 749(2018).
  18. Reteno, D. G., et al. Faustovirus, an asfarvirus-related new lineage of giant viruses infecting amoebae. Journal of Virology. 89 (13), 6585-6594 (2015).
  19. Bajrai, L., et al. Kaumoebavirus, a New Virus That Clusters with Faustoviruses and Asfarviridae. Viruses. 8 (12), 278(2016).
  20. Andreani, J., et al. Orpheovirus IHUMI-LCC2: A New Virus among the Giant Viruses. Frontiers in Microbiology. 8, 779(2018).
  21. Fischer, M. G., Allen, M. J., Wilson, W. H., Suttle, C. A. Giant virus with a remarkable complement of genes infects marine zooplankton. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (45), 19508-19513 (2010).
  22. Moniruzzaman, M., et al. Genome of brown tide virus (AaV), the little giant of the Megaviridae, elucidates NCLDV genome expansion and host-virus coevolution. Virology. 466-467, 60-70 (2014).
  23. Gallot-Lavallée, L., Blanc, G., Claverie, J. -M. Comparative genomics of Chrysochromulina Ericina Virus (CeV) and other microalgae-infecting large DNA viruses highlight their intricate evolutionary relationship with the established Mimiviridae family. Journal of Virology. , (2017).
  24. Deeg, C. M., Chow, C. -E. T., Suttle, C. A. The kinetoplastid-infecting Bodo saltans virus (BsV), a window into the most abundant giant viruses in the sea. eLife. 7, 235(2018).
  25. Boughalmi, M., et al. High-throughput isolation of giant viruses of the Mimiviridae and Marseilleviridae families in the Tunisian environment. Environmental Microbiology. 15 (7), 2000-2007 (2013).
  26. Khalil, J. Y. B., et al. High-Throughput Isolation of Giant Viruses in Liquid Medium Using Automated Flow Cytometry and Fluorescence Staining. Frontiers in Microbiology. 7 (120), 26(2016).
  27. Bou Khalil, J. Y., Andreani, J., Raoult, D., La Scola, B. A Rapid Strategy for the Isolation of New Faustoviruses from Environmental Samples Using Vermamoeba vermiformis. Journal of Visualized Experiments : JoVE. (112), e54104(2016).
  28. Khalil, J. Y. B., Andreani, J., La Scola, B. Updating strategies for isolating and discovering giant viruses. Current Opinion in Microbiology. 31, 80-87 (2016).
  29. Andreani, J., et al. Pacmanvirus, a new giant icosahedral virus at the crossroads between Asfarviridae and Faustoviruses. Journal of Virology. , (2017).
  30. Khalil, J. Y. B., et al. Flow Cytometry Sorting to Separate Viable Giant Viruses from Amoeba Co-culture Supernatants. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 6, 17722(2017).
  31. Fröhlich, J., König, H. New techniques for isolation of single prokaryotic cells. FEMS Microbiology Reviews. 24 (5), 567-572 (2000).
  32. Ye, J., et al. Primer-BLAST: A tool to design target-specific primers for polymerase chain reaction. BMC Bioinformatics. 13 (1), 134(2012).
  33. Kimura, Y., Yanagimachi, R. Intracytoplasmic sperm injection in the mouse. Biology of Reproduction. 52 (4), 709-720 (1995).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

PCR Vermamoeba vermiformis Faustovirus

مقالات ذات صلة