مقالة منهجية

إنشاء الثقافات المشتركة القائمة علي خليه واحده بطريقه قطعيه مع رقاقه ميكروفلويدريك

DOI:

10.3791/60202

⸱

سبتمبر 27, 2019

 ,  ,  , 
1Institute of Biomedical Engineering and Nanomedicine, National Health Research Institutes, 2Ph.D. Program in Tissue Engineering and Regenerative Medicine, National Chung Hsing University, 3National Institute of Cancer Research, National Health Research Institutes

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يصف هذا التقرير أسلوبا قائما علي الرقاقات الصغيرة لاعداد تجربه ثقافة خليه واحده يمكن فيها تحقيق الاقتران العالي الكفاءة والتحليل المجهري للخلايا المفردة المتعددة.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد استخدمت اختبارات الثقافة المشتركة للخلايا علي نطاق واسع لدراسة تفاعلات خلايا الخلايا بين أنواع الخلايا المختلفة لفهم بيولوجيا الامراض بما في ذلك السرطان بشكل أفضل. ومع ذلك ، فانه من الصعب توضيح اليه المعقدة للتفاعلات بين الخلايا في سكان الخلايا غير المتجانسة بشكل كبير باستخدام نظم الثقافة المشتركة التقليدية لان عدم تجانس الخلايا الفرعية تحجبه القيم المتوسطة ؛ يمكن استخدام أنظمه الثقافة المشتركة التقليدية فقط لوصف اشاره السكان ، ولكنها غير قادره علي تتبع سلوك الخلايا الفردية. وعلاوة علي ذلك ، فان الأساليب التجريبية أحاديه الخلية التقليدية لها كفاءه منخفضه في التلاعب بالخلايا بسبب توزيع بواسون. الاجهزه المجهرية هي التكنولوجيا الناشئة للدراسات خليه واحده لأنها يمكن التلاعب بدقه خلايا واحده في الانتاجيه العالية ويمكن ان تقلل من استهلاك العينات والكاشف. هنا ، ونحن وصف مفهوم وتطبيق رقاقه ميكروفلويدريك لمتعددة خليه واحده الثقافات المشتركة. رقاقه يمكن التقاط بكفاءة أنواع متعددة من خلايا واحده في غرفه الثقافة (~ 46 ٪) ولديها مساحة ثقافيه كافيه مفيده لدراسة سلوك الخلايا (علي سبيل المثال ، الهجرة ، والانتشار ، وما إلى ذلك) تحت التفاعل خليه خليه علي مستوي خليه واحده. تم استخدام خلايا البطانة اللمفاوية وسرطان الخلايا الحرشفية عن طريق الفم لاجراء تجربه الثقافة المشتركة أحاديه الخلية علي منصة ميكروفلويديك لدراسات تفاعليه متعددة الخلايا الحية.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وهناك حاجه للتقاط الكفاءة للأنواع المختلفة من الخلايا المفردة وتوفير مساحة ثقافيه كافيه لتجارب الاستزراع المشترك للخلايا الواحدة لأنواع متعددة من الخلايا المفردة1. الحد من التخفيف هو الأسلوب الأكثر استخداما لاعداد الخلايا المفردة لمثل هذه التجارب ، وذلك بسبب انخفاض تكلفه المعدات المطلوبة. ومع ذلك ، نظرا لمحدوديه توزيع بواسون ، فان الحد الأقصى لاحتمال اكتساب الخلايا المفردة هو فقط 37% ، مما يجعل العملية التجريبية شاقه وتستغرق وقتا طويلا2. في المقابل ، يمكن استخدام الفرز الخلية المنشطة مضان (FACS) التغلب علي الحد من التوزيع Poisson لاعداد عاليه كفاءه خلايا واحده3. ومع ذلك ، فقد لا يمكن لبعض المختبرات الوصول اليها بسبب تكلفه الاجهزه المكلفة وتكاليف الصيانة. تم تطوير الاجهزه المجهرية مؤخرا لتراكب الخلية الواحدة4، واقتران الخلية المفردة5، وتطبيقات ثقافة الخلية المفردة. هذه الاجهزه هي مفيده استنادا إلى قدرتها علي التلاعب بدقه خلايا واحده6، وأداء التجارب عاليه الانتاجيه ، أو تقليل العينة والاستهلاك كاشف. ومع ذلك ، فان اجراء تجارب الثقافة المشتركة أحاديه الخلية مع أنواع الخلايا المتعددة مع الاجهزه ميكروفلويديك الحالية لا تزال صعبه بسبب الحد من poisson توزيع1،7،8، أو عدم قدره الاجهزه للتقاط أكثر من نوعين من خلايا واحده4،5،6،9،10.

فعلي سبيل المثال ، ابلغ يون وآخرون عن جهاز ميكروفلوريك لدراسة التفاعل بين الخلايا الخلوية11. يستخدم هذا الجهاز أسلوب احتماليه لاقران الخلايا في غرفه واحده. ومع ذلك ، فانه يمكن فقط تحقيق الاقتران بين نوعين مختلفين من الخلايا بسبب القيود الهندسية في بنيه الجهاز. واظهر تقرير آخر من لي وآخرون طريقه قطعيه للتقاط واقران الخلايا المفردة12. يزيد هذا الجهاز من كفاءه الاقران بواسطة الطريقة القطعية ولكنه محدود بوقت التشغيل المطول المطلوب لاقران الخلايا. وعلي وجه التحديد ، يمكن اجراء عمليه التقاط الخلية الثانية فقط بعد إرفاق الخلية الملتقطة الاولي بالسطح بعد 24 ساعة. وابلغ جاو وآخرون عن وجود جهاز ميكروفلويدريك يستند إلى القطرات للتقاط نوعين من الخلية الواحدة13. يمكننا العثور علي ان الجهاز ميكروفلويديك القائم علي الحبريه لا يزال يقتصر علي توزيع poisson ويمكن استخدامها فقط علي الخلايا غير المرفقة ، وانه ليس من الممكن لتغيير الحل الثقافة اثناء عمليه الزراعة.

في السابق ، قمنا بتطوير "رقاقه الإغلاق الهيدروديناميكية" التي تستخدم قوي هيدروديناميكية حتمية للتقاط أنواع متعددة من خليه واحده في غرفه الثقافة ويمكن ان تؤدي في وقت لاحق تجربه الخلية المشتركة في الثقافة لتحليل سلوك ترحيل الخلية الفردية ضمن تفاعلات خليه الخلية14. وتتالف رقاقه الإغلاق الهيدروديناميكية من مجموعات من الوحدات التي تحتوي كل منها علي قناه ملتوية بتمريره ، وموقع للتقاط الصور ، وغرفه للثقافة. باستخدام الفرق في مقاومه التدفق بين القناة التي يمر بها اعوج وغرفه الثقافة ، وإجراءات التشغيل المصممة خصيصا ، يمكن التقاط أنواع مختلفه من الخلايا المفردة بشكل متكرر في غرفه الثقافة. ومن الجدير بالملاحظة ان المساحة الوافرة للغرفة الثقافية لا يمكن ان تمنع الخلية من ان يتم مسحها اثناء التقاط الخلايا فحسب ، بل توفر أيضا مساحة كافيه للخلايا للانتشار والتكاثر والهجرة ، مما يسمح بمراقبه التفاعلات الحية أحاديه الخلية. في هذه المقالة ، ونحن نركز علي إنتاج هذا الجهاز وخطوات بروتوكول مفصله.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. تصنيع قالب رقاقه عن طريق الطباعة الحجرية الناعمة

ملاحظه: تتوفر بيانات نمط القناع في المنشور السابق14.

  1. ديهيدرات رقاقه السيليكون 4 بوصه في فرن 120 درجه مئوية لمده 15 دقيقه.
  2. تدور معطف 4 ز من سو-8 2 الصور السلبية مقاومه علي رقاقه السيليكون 4 بوصه في 1,000 rpm لمده 30 ثانيه لإنشاء طبقه سميكه 5 μm (طبقه #1).
  3. لينه خبز طبقه #1 علي 65 درجه مئوية موقد لمده 1 دقيقه ومن ثم نقل طبقه #1 إلى 95 درجه مئوية موقد لمده 3 دقائق.
  4. طبقه بارده #1 إلى درجه حرارة الغرفة ، وضعه علي حامل القناع التلقائي النصف الألى ، ومحاذاة مع طبقه #1 الكروم مطلي ضوئي (طبقه موقع التقاط).
  5. فضح طبقه #1 مع ضوء الاشعه فوق البنفسجية 365 nm في جرعه من 150 mJ/سم2.
  6. أزاله طبقه #1 من المصفف وبعد خبز علي 65 درجه مئوية موقد ل 1 دقيقه. نقل طبقه #1 إلى 95 درجه مئوية موقد لمده دقيقه واحده.
  7. طبقه بارده #1 درجه حرارة الغرفة. تزج في محلول خلات الأثير البروبيلين غليكول مونوايثيل لغسل بعيدا الضوئية غير المرتبطة لمده 2 دقيقه. تجف برفق مع غاز النيتروجين للكشف عن طبقه #1 محاذاة علامة.
  8. تغطيه طبقه #1 محاذاة علامة بواسطة شريط لاصق ، وتدور معطف 4 ز من 8 10 الصور السلبية المقاومة للضوء علي طبقه #1 في 1,230 دوره في الدقيقة ل 30 ثانيه لإنشاء طبقه سميكه 25 μm #2.
  9. أزاله الشريط ، طبقه خبز لينه #2 علي اللوحة الساخنة 65 درجه مئوية لمده 3 دقائق ، ومن ثم نقل طبقه #2 إلى اللوحة الساخنة 95 درجه مئوية لمده 7 دقائق.
  10. طبقه بارده #2 درجه حرارة الغرفة ، وضع طبقه #2 علي حامل القناع شبه التلقائي ، ومحاذاة طبقه #2 الكروم مطلي ضوئي (تجاوز طبقه القناة) إلى طبقه #1 محاذاة العلامة.
  11. فضح طبقه #2 مع ضوء الاشعه فوق البنفسجية 365 nm في جرعه من 200 mJ/سم2.
  12. أزاله طبقه #2 من المصفف وبعد خبز علي 65 درجه مئوية موقد لمده دقيقه واحده ونقل طبقه #2 إلى اللوحة الساخنة 95 درجه مئوية لمده 3 دقائق.
  13. طبقه بارده #2 درجه حرارة الغرفة ، وتغطيه طبقه #1 محاذاة علامة بواسطة شريط لاصق. تدور معطف 4 ز من 8 2050 الصور السلبية المقاومة للضوء علي طبقه #2 في 1,630 دوره في الدقيقة لمده 30 ثانيه لخلق طبقه سميكه 100 μm #3.
  14. أزاله الشريط ، طبقه خبز لينه #3 علي اللوحة الساخنة 65 درجه مئوية لمده 5 دقائق ، ومن ثم نقل طبقه #3 إلى اللوحة الساخنة 95 درجه مئوية لمده 20 دقيقه.
  15. طبقه بارده #3 درجه حرارة الغرفة ، وضع طبقه #3 علي حامل القناع شبه التلقائي ، ومحاذاة طبقه #3 الكروم مطلي ضوئي (طبقه غرفه الثقافة) إلى طبقه #1 محاذاة العلامة.
  16. فضح طبقه #3 مع ضوء الاشعه فوق البنفسجية 365 nm في جرعه من 240 mJ/سم2.
  17. أزاله طبقه #3 من المصفف وبعد خبز علي 65 درجه مئوية موقد لمده 5 دقائق. نقل طبقه #3 إلى اللوحة الساخنة 95 درجه مئوية لمده 10 دقيقه.
  18. طبقه بارده #3 درجه حرارة الغرفة. تزج في محلول خلات الأثير البروبيلين غليكول مونوايثيل لغسلها بعيدا الضوئية غير المرتبطة لمده 10 دقيقه ، وتجف برفق مع غاز النيتروجين.

2. PDMS اعداد الجهاز للتقاط خليه واحده متعددة

  1. وضع العفن رقاقه والصحن وزنها تحتوي علي 100 μL من ثلاثي كلورو سيليكات في المجفف (فقط للسلنه) وتطبيق فراغ (-85 kPa) لمده 15 دقيقه.
    ملاحظه: Silanize سطح رقاقه مع ثلاثي كلورو سيليكات لخلق خصائص سطح مسعور قبل PDMS castingso انه يمكن بسهوله ان مقشر قباله العفن PDMS رقاقه.
  2. وقف الفراغ ، ومن ثم silanize العفن رقاقه في المجفف (فقط للسينه) في 37 درجه مئوية لمده 1 ساعة علي الأقل.
  3. مزيج PDMS قاعده وعامل معالجه PDMS في نسبه 10:1. صب ما مجموعه 20 غرام من PDMS مختلطة علي قالب رقاقه في صحن 15 سم.
  4. وضع الطبق 15 سم في المجفف وتطبيق فراغ (-85 kPa) لمده 1.5 دقيقه. ثم قم بازاله الطبق الذي طوله 15 سم من المجفف. يحفظ لمده 20 دقيقه في درجه حرارة الغرفة. وأخيرا ، أزاله فقاعات الهواء المتبقية في PDMS مع غاز النيتروجين.
  5. وضع الطبق 15 سم في فرن في 65 درجه مئوية ل 2-4 h لعلاج PDMS.
  6. أزاله النسخة المتماثلة PDMS من العفن رقاقه ، ومن ثم لكمه مدخل مم 1.5 ومنفذ 0.5 مم علي PDMS باستخدام 1.5 مم القطر الداخلي والداخلي القطر 0.5 مم (الشكل 1ج).
  7. تنظيف النسخة المتماثلة PDMS وسطح الشريحة مع الشريط القابل للازاله ومن ثم علاج السطح مع البلازما الأكسجين (100 W ل 14 s).
  8. محاذاة النسخ المتماثلة PDMS يدويا مع الشريحة وجعلها في اتصال مع بعضها البعض.
  9. ضع الشريحة PDMS في فرن 65 درجه مئوية لمده يوم واحد.
    ملاحظه: يتم تحقيق الترابط الدائم بين الشريحة والنسخة المتماثلة PDMS لتشكيل الجهاز.
  10. تزج الجهاز PDMS في وعاء مملوء بالفوسفات المالحة مخزنه ووضعها في المجفف. ثم تطبيق فراغ (-85 kPa) لمده 15 دقيقه لأزاله فقاعات الهواء.
  11. وضع الجهاز PDMS في الخلية الثقافة هود وتعقيم الجهاز مع ضوء الاشعه فوق البنفسجية (الطول الموجي الخفيفة: 254 nm) لمده 30 دقيقه.
  12. استبدال المخزن المؤقت للجهاز PDMS مع متوسطه (DMEM-F12 القاعدية التي تحتوي علي 1 ٪ المضادات الحيوية و 10 ٪ الجنين البقري المصل) واحتضان الجهاز PDMS في 4 درجه مئوية لمده 1 يوم. وهذا يمنع الخلايا من الانضمام إلى سطح PDMS.

3-اعداد تعليق الخلية الواحدة

ملاحظه: أنواع الخلايا تشمل الخلايا اللمفاوية الليمفاوية البشرية (LECs) ، الإنسان OSCC TW 2.6 الخلايا التعبير عن WNT5B الخاصة شرانا (WNT5B sh4) ومكافحه ناقلات (pLKO-GFP) التي تم الحصول عليها من دراستنا السابقة15. يرجى الرجوع إلى المنشور السابق للحصول علي خطوات مفصله للزراعة.

  1. قم بازاله الوسط الثقافي عندما تحقق الخلايا التقاء 70-80%. ثم يغسل برفق الخلايا مع 5 مل من المعقمة تلفزيوني ثلاث مرات.
  2. أضف 1 مل من المتوسطة التي تحتوي علي صبغه فلورسنت 1 μM إلى WNT5B sh4 وخلايا pLKO-GFP (استخدم MV2 المتوسطة ل LECs) ثم احتضان الخلايا لمده 30 دقيقه في درجه حرارة الغرفة.
    ملاحظه: كانت ملطخه lecs مع الأخضر تشلوروميثيلفلوريسسين دياسيتات (cmfda) صبغ ، وكانت ملطخه الخلايا WNT5B sh4 مع الأزرق 7-الامينيه-4-كلوموثيلكومارين (cmac) صبغ والخلايا plko-gfp ملطخه الأحمر ديل الفلورسنت صبغ.
  3. يغسل برفق الخلايا مع 5 مل من المعقمة تلفزيوني ثلاث مرات.
  4. أزاله تلفزيوني وأضافه 2 مل من 0.25 ٪ تريبسين-أدتا (0.05 ٪ تريبسين-أدتا ل LECs).
  5. احتضان الخلايا لمده 4 دقائق في درجه حرارة الغرفة ثم اضغط برفق علي طبق ثقافة الانسجه لتعزيز انفصال الخلايا.
  6. أضافه 4 مل من DMEM-F12 المتوسطة لتفريق WNT5B sh4 و pLKO-GFP الخلايا (ل LECs استخدام 3 مل من MV2 المتوسطة و 1 مل من الحل المحايد التريبسين). ثم نقل الخلايا إلى أنبوب 15 مل ، وأجهزه الطرد المركزي في 300 x g لمده 3 دقائق.
  7. أزاله supernatant ، وأعاده التعليق بيليه الخلية في 1 مل من المتوسطة DMEM-F12 بلطف. عد عدد الخلايا الحية في مقياس الكريات الدموية باستخدام طريقه الاستبعاد الأزرق القياسية تريبان16. اعداد 1 مل من تعليق الخلية في 3 × 105 خلايا/مل تركيز في dmem-F12 المتوسطة ، ومن ثم الحفاظ علي الخلايا علي الجليد لمنع تراكم الخلايا.
    ملاحظه: من أجل تحسين كفاءه التقاط أحاديه الخلية ، يلزم اعداد دقيق لتعليق الخلية الواحدة مع فصلها جيدا.

4. متعددة خليه واحده التقاط والثلاثي ثقافة خليه واحده

  1. توصيل أنبوب بولي-تيترافلوروثيني (PTFE) بين مخرج الجهاز ومضخة حقنه. أزاله المتوسطة وأضافه 1 μL من تعليق الخلية في تركيز 3 × 105 خلايا/مل في مدخل الجهاز pdms.
  2. تحميل تعليق الخلية في الجهاز بواسطة مضخة حقنه بمعدل تدفق 0.3 μL/min (الشكل 2ا). تدفق الاتجاه هو من مدخل إلى منفذ.
    ملاحظه: تحميل مباشره بعد أضافه تعليق الخلية في مدخل لمنع ترسب الخلايا.
  3. أضافه 1 μL من DMEM-F12 المتوسطة في مدخل الجهاز PDMS بعد الخطوة 4.2. تحميل المتوسطة DMEM-F12 في الجهاز بواسطة مضخة حقنه بمعدل تدفق 0.3 μL/min (الشكل 2ب). تدفق الاتجاه كان يتدفق من مدخل إلى منفذ.
  4. تحميل 0.3 μL من DMEM-F12 المتوسطة في الجهاز بواسطة مضخة حقنه بمعدل تدفق من 10 μL/min (الشكل 2ج). تدفق الاتجاه كان يتدفق من منفذ إلى مدخل.
  5. كرر الخطوات 4.1 إلى 4.4 لتحميل أنواع الخلايا الأخرى في الجهاز.
  6. بعد الانتهاء من التقاط الخلية ، استخدم المجهر مع عدسه 4x لصوره كل غرفه الثقافة.
    ملاحظه: تم استخدام الانبعاثات الفلورية من الخلايا لتحديد وحساب عدد الخلايا الفردية في كل غرفه الثقافة.
  7. أزاله أنبوب PTFE وختم مدخل ومنفذ مع بولي tape لإنشاء نظام ثقافة مغلقه.
  8. نقل الجهاز PDMS إلى صحن ثقافة 10 سم وأضافه 10 مل من العقيمة تلفزيوني حول الجهاز PDMS لتجنب تبخر المتوسطة من الجهاز.
  9. نقل طبق الثقافة إلى حاضنه (37 درجه مئوية ، 5 ٪ CO2 و 95 ٪ الرطوبة) للثقافة خليه واحده ثلاثية.
  10. مجهريا مراقبه وتصوير نمو الخلايا كل 12 ساعة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يحتوي الجهاز علي بنيه ثلاثية الطبقات كما هو مبين في صوره المقطع العرضي لجهاز PDMS قطع (الشكل 1ا). الطبقة الاولي تحتوي علي موقع التقاط (6.0 μm في العرض و 4.6 μm في الارتفاع) الذي يربط بين غرفه الثقافة والقناة التي يمر بها. يؤدي الاختلاف في مقاومه التدفق بين الغرفة الثقافية والقناة التي تمر بتمريره إلى تدفق الخلايا إلى موضع التقاط وملء مدخل المسار الصغير. بعد التقاط خليه في موقف التقاط ، يتم زيادة مقاومه تدفق المسار الصغير ، مما تسبب في الخلية ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يلعب ال [اينترخلوي] تفاعلات من خلايا مختلفه في الورم [ميكروبيئه] دور مهمة في التقدم من الورم17. ومن أجل فهم اليه تفاعلات الخلايا الخلوية ، تستخدم نظم الثقافة المشتركة كطريقه تحليليه مشتركه. ومع ذلك ، فان أنواع الخلايا المتعددة وتباين الخلايا نفسها قد أدت إلى تعقيدات تجريبية وصعوبات تحليليه.

وتسمح الرقاقة المتحركة الهيدروديناميكية بتحميل متعدد الخلايا الواحدة في غرفه الثقافة بطريقه قطعيه ، دون ان تكون مقيده بقيود توزيع بواسون في طريقه التخفيف ومنصة microwell. من خلال توف...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويعلن صاحبا البلاغ انهما لا يملكان مصالح مالية متنافسة.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وكان هذا العمل مدعوما بمنحه من وزاره العلوم والتكنولوجيا (105-2628-400-001-MY2) ، وبرنامج الدكتوراه في هندسه الانسجه والطب التجديدي ، وجامعه تشونغ شينج الوطنية ، ومعاهد البحوث الصحية الوطنية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
3M متقدم البولي أوليفين التشخيص الشريط الطبي Microfluidic3M شركة9795R
المضادات الحيويةBiowestL0014-100الجلوتامين البنسلين الستربتومايسين
برنامج AutoCADAutodeskAutoCAD LT 2011الجزء رقم 057C1-74A111-1001
CellTracke Blue CMAC DyeInvitrogenC2110
CellTracker Green CMFDA Dyeفرن تقليدي InvitrogenC7025
شركة YEONG-SHINovp45
مجففBel-Art ProductsF42020-0000مجفف فراغ موفر للمساحة 190 مم قاعدة بيضاء
DiIC12 (3) صبغة غشاء الخليةBD Biosciences354218تستخدم كمتتبع للخلايا
DMEM-F12 متوسطGibco11320-082
نمو الخلايا البطانية متوسط MV 2PromoCellC-22022
مصل الأبقار الجنيني HycloneThermoSH30071.03HI
هاميلتون 700 سلسلة حقنة زجاجية (0.1 مل)هاميلتون80630100 & micro; L ، موديل 710 RN SYR ، NDL صغير قابل للإزالة ، 22 ثانية ga ، 2 بوصة ، نمط نقطة 2
Harris Uni-Core puncherTed Pella Inc.15075مع 1.5 مم بقطر
داخلي Harris Uni-CoreTed Pella Inc.15071ذات قطر داخلي 0.5 مم
شركةYS-300S
Msak محاذاةDeya Optronic CO.A1K-5-MDA
بلازما الأكسجيننوردسون مارسAP-300
منظف البلازمانوردسونAP-300نظام معالجة البلازما
متعدد ميثيل سيلوكسان (PDMS)داو كورنينجسيلجارد 184
بولي رباعي فلورو إيثيلين (PTFE)إيفر شارب تكنولوجيTFT-23Tالقطر الداخلي ، 0.51 مم ؛ القطر الخارجي ، 0.82 مم
شريط قابل للإزالة3M شركةسكوتش شريط قابل للإزالة 811
رقاقة السيليكونEltech corperationSPE0039
Spin coaterSynrex Co.، Ltd.SC-HMI 2 "~ 6"
مجهر مجسمLeica MicrosystemsLeica E24
SU-8 10 سلبي مقاومللضوء MicroChemY131259
SU-8 2 مقاوم للضوءسلبي MicroChemY131240
SU-8 2050 مقاوم للضوءالسلبي MicroChemY111072
SU-8 مطورالكيماوياتالكبرىGP5002-000000-72GCمضخة حقنة أسيتات أحادي ميثيل الأثير البروبيلين
هارفارد703007
TrichlorosilaneGelest، IncSIT8174.0Tridecafluoro-1،1،2،2-tetrahydrooctyl. الخطره. تآكل الجهاز التنفسي ، يتفاعل بعنف مع الماء.
محلول محايد التربسينجيبكوR-002-100
مع صفيحة تسخين مجموعة شركات جلايكول جهاز

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Goers, L., Freemont, P., Polizzi, K. M. Co-culture systems and technologies: taking synthetic biology to the next level. Journal of the Royal Society, Interface. 11 (96), 20140065(2014).
  2. Collins, D. J., Neild, A., deMello, A., Liu, A. Q., Ai, Y. The Poisson distribution and beyond: methods for microfluidic droplet production and single cell encapsulation. Lab on a Chip. 15 (17), 3439-3459 (2015).
  3. Leong, K. G., Wang, B. E., Johnson, L., Gao, W. Q. Generation of a prostate from a single adult stem cell. Nature. 456, 804(2008).
  4. Roman, G. T., Chen, Y., Viberg, P., Culbertson, A. H., Culbertson, C. T. Single-cell manipulation and analysis using microfluidic devices. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 387 (1), 9-12 (2007).
  5. Frimat, J. P., et al. A microfluidic array with cellular valving for single cell co-culture. Lab on a Chip. 11 (2), 231-237 (2011).
  6. Rettig, J. R., Folch, A. Large-Scale Single-Cell Trapping And Imaging Using Microwell Arrays. Analytical Chemistry. 77 (17), 5628-5634 (2005).
  7. Gracz, A. D., et al. A high-throughput platform for stem cell niche co-cultures and downstream gene expression analysis. Nature Cell Biology. 17 (3), 340(2015).
  8. Tumarkin, E., et al. High-throughput combinatorial cell co-culture using microfluidics. Integrative Biology. 3 (6), 653-662 (2011).
  9. Hong, S., Pan, Q., Lee, L. P. Single-cell level co-culture platform for intercellular communication. Integrative Biology. 4 (4), 374-380 (2012).
  10. Chung, M. T., Núñez, D., Cai, D., Kurabayashi, K. Deterministic droplet-based co-encapsulation and pairing of microparticles via active sorting and downstream merging. Lab on a Chip. 17 (21), 3664-3671 (2017).
  11. Chen, Y. C., et al. Paired single cell co-culture microenvironments isolated by two-phase flow with continuous nutrient renewal. Lab on a Chip. 14 (16), 2941-2947 (2014).
  12. Hong, S., Lee, L. P., Pan, Q. Single-cell level co-culture platform for intercellular communication. Integrative Biology. 4 (4), 374-380 (2012).
  13. Segaliny, A. I., et al. Functional TCR T cell screening using single-cell droplet microfluidics. Lab on a Chip. 18 (24), 3733-3749 (2018).
  14. He, C. K., Chen, Y. W., Wang, S. H., Hsu, C. H. Hydrodynamic shuttling for deterministic high-efficiency multiple single-cell capture in a microfluidic chip. Lab on a Chip. 19 (8), 1370-1377 (2019).
  15. Wang, S. H., et al. Tumour cell-derived WNT5B modulates in vitro lymphangiogenesis via induction of partial endothelial-mesenchymal transition of lymphatic endothelial cells. Oncogene. 36, 1503(2016).
  16. Strober, W. Trypan Blue Exclusion Test of Cell Viability. Current Protocols in Immunology. 111 (1), A3.B.1-A3.B.3 (2015).
  17. Kim, J. B., Stein, R., O'hare, M. J. Three-dimensional in vitro tissue culture models of breast cancer-a review. Breast Cancer Research and Treatment. 85 (3), 281-291 (2004).
  18. Shin, Y., et al. Microfluidic assay for simultaneous culture of multiple cell types on surfaces or within hydrogels. Nature Protocols. 7 (7), 1247-1259 (2012).
  19. Wu, M. H., Huang, S. B., Lee, G. B. Microfluidic cell culture systems for drug research. Lab on a Chip. 10 (8), 939-956 (2010).
  20. Hong, J. W., Song, S., Shin, J. H. A novel microfluidic co-culture system for investigation of bacterial cancer targeting. Lab on a Chip. 13 (15), 3033-3040 (2013).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Single Cell Co CultureCell Capture EfficiencyPDMS DeviceLymphatic Endothelial CellsOral Squamous Cell CarcinomaSyringe Pump LoadingCell Suspension PreparationTriple Single CultureDynamic Live Imaging

مقالات ذات صلة