بروتوكول تجميد السحق لمعالجه الكفوف الماوس لتقييم المسارات الجزيئية للالتهابات الانسجه في الكولاجين المستحثة نموذج التهاب المفاصل

Summary

تم تطوير طريقه السحق المبردة لمعالجه الكفوف murine باستخدام مطحنه النيتروجين السائل التجميد لتحسين الغلة وجوده الحمض الريبي النيبالي أو البروتين المستخرج من الانسجه وتمكين تحليل الملامح الجزيئية المرتبطة التهابات الاستجابات.

Abstract

تنميط التغيرات الجزيئية في الانسجه المحلية أمر حاسم لفهم اليه (ق) عمل المرشحين العلاجية في الجسم الحي. في مجال البحوث التهاب المفاصل ، وتركز العديد من الدراسات علي المفاصل الملتهبة التي تتكون من خليط معقد من العظام والغضاريف والعضلات والخلايا اللحمية والخلايا المناعية. هنا ، انشانا طريقه ميكانيكيه موثوقه وقويه لتعطيل الكفوف الماوس ملتهبة في عينات المسحوق متجانسة في بيئة تسيطر عليها الديتريوم. وتمت معالجه البروتينات والحمض الريبي النيبالي لتمكين نقاط النهاية البروتينية والمتحولة والتوصيف الجزيئي لمسارات الامراض ذات الصلة في الانسجه المحلية.

Introduction

التهاب المفاصل الروماتويدي (RA) هو مرض التهابي مزمن الجهازية مع التهاب الغدة الدرقية المتماثل المستمر في المفاصل ومشاركه مفصليه اضافيه من أجهزه مثل الجلد والقلب والرئتين ، والعينين¹. علي الرغم من ان المظاهر الجهازية للاستجابة المناعية واضحة في المرضي البشريين ، واحده من السمات المميزة للامراض RA هو تسلل الخلايا المناعية في الانسجه الزليلي وانتشار الخلايا الليفية الزليلي².

علي غرار RA الإنسان ، الكولاجين الماوس المستحثة التهاب المفاصل (CIA) نموذج يثير التهاب الانسجه القوية مع الاستجابات المناعية النشطة في الانسجه الزليلي والمقصورات الجهازية. الحساسية من سلالات الماوس مختلفه لارتباطات نموذج وكاله المخابرات الخاصة إلى مجمع التوافق الرئيسية (mhc) النمط والخلية المحددة antigen T و B التفاعلات الخلية^3,4. الاضافه إلى ذلك ، فان العديد من المسارات المسببة للامراض في RA الإنسان ، بما في ذلك إنتاج الأجسام المضادة ، وترسب معقده المناعي ، وتنشيط الخلايا النخاعية ، ومظاهر متعددة المفصليات وتشكيل بانيوس مع تسلل المناعي الزليلي ، هي أيضا واضحة في هذا النموذج ^5,6. وقد استخدم المحققون هذا النموذج الراسخ CIA للتحقيق في اثار العلاجات السايسيسين المضادة للالتهابات⁷. وقد تم العثور علي العديد من البيولوجية المعتمدة للامراض المناعية الذاتية أو التهابيه ، مثل المضادة لل tnfα والمضادة لل-6 ، ان تكون فعاله في نموذج^8،9وكاله المخابرات العامة.

التنميط التفاعلات من الجهاز المناعي في الانسجه الزليلي أمر حاسم لتوضيح أليات الجزيئية المرتبطة بالتسبب في RA. في البيئة السريرية البشرية ، والممارسة الشائعة هي اجراء الخزعات الزليلي الابره تحت اشراف التصوير بالموجات فوق الصوتية. في الإعدادات الاكلينيكيه ، يجعل الهيكل الأصغر للمفاصل الmurine إجراءات الخزعة أكثر صعوبة ان لم يكن مستحيلا. في الاونه الاخيره ، أظهرنا استخدام نموذج murine CIA لتقييم مجموعات من الادويه للتاثير علي نقاط النهاية المتباينة وحل المرض في نهج التوافقية¹⁰. وقد استخدمت طريقه الطحن المبردة طاحونة القائم علي مطحنه لمعالجه الكفوف murine الملتهبة في مساحيق ناعمه متجانسة والعمليات التي أنشئت المصب لاستخراج الحمض الريبي النيبالي والبروتينات. هذه الطريقة تحمي الحمض الريبي النيبالي والبروتين من العمليات الانزيميه والكيميائية degrative وتمكننا من تطبيق أساليب تحليليه متعددة لمصدر عينه متجانس واحد.

Protocol

وقد أجريت جميع التجارب الحيوانية وفقا لسياسات اللجنة المؤسسية للعناية بالماشية واستخدامها التابعة لشركه Janssen R & D.

1. المبردة تجميد مطحنه القائم علي طريقه الطحن

1. عند إنهاء دراسة وكاله المخابرات الخاصة ، والفئران التضحية مع 1.5 ٪ ايزوفلوراني تليها خلع عنق الرحم.
2. في يوم معالجه الانسجه ، قبل البرد جميع الصكوك (ملاعق ، قوارير طحن ، الخ) علي الجليد الجاف لمده لا تقل عن 10 دقيقه. ارتداء قفازات الحرارية لتجنب تجميد الضرر.
3. قطع الكفوف الخلفية مع مقص في خط الفراء كما هو مبين في الشكل 1ا.
4. نقل كل مخلب في واحد 1.5 mL أنبوب الطرد المركزي الصغير ، والمفاجئة تجميد في النيتروجين السائل علي الفور ، وتخزين الكفوف المجمدة في-80 درجه مئوية. لا تبقي العينات المجمدة لأكثر من أسبوع واحد.
5. ملء مطحنه الفريزر مع النيتروجين السائل كما هو مبين في الشكل 1ب والسماح لها تتوازن لمده 10 دقيقه علي الأقل.
6. حافظ علي العينة غير المجهزة علي الثلج الجاف وتجنب دورات التجمد والذوبان.
7. نقل واحده مخلب الخلفية إلى ما قبل المبردة البولي الكبير طحن قارورة مع المكونات الصلب السفلي ، وادراج الفاعل الصلب قبل المبردة وإغلاق قارورة طحن البولي مع المكونات الصلب قبل المبردة الأعلى (الشكل 1ج).
8. نقل قوارير كبيره البولي طحن مع عينات في مطحنه الفريزر قبل مملوءة بالسائل وإغلاق الغطاء مع المشبك المطاطي وجدت في المقدمة من الصك.
9. اسمحوا عينات بارده في النيتروجين السائل لمده 1 دقيقه.
10. تعيين مطحنه الفريزر إلى برنامج 1 دقيقه مع 10 دورات في الثانية الواحدة واضغط علي زر البداية. انتظر مطحنه الفريزر لإكمال دوره.
    ملاحظه: الجهاز يجعل صوت الطبول كما يتحرك الاندفاع الصلب ذهابا وإيابا. استخدم مقابس الاذن لتجنب فقدان السمع.
11. فتح غطاء مطحنه التجميد ، وإخراج قارورة كبيره البولي طحن ووضعها في مستخرج كما هو مبين في الشكل 1د. أزاله المكونات الصلب العلوي من خلال وضع الضغط الهبوطي علي مقبض اسود حتى المكونات الصلب الشرائح من أنبوب البولي.
12. انقل قارورة البولي كربونات الكبيرة المفتوحة إلى الثلج الجاف. أزاله الفاعل الصلب مع ملقط قبل المبردة.
13. نقل مسحوق المجمدة إلى ما قبل المبردة 50 mL أنبوب مخروطي.
14. الوزن 30-50 ملغ من مسحوق المجمدة في tared المجمدة 1.5 mL أنبوب ميكروالطرد المركزي لاستخراج RNA و 100-200 ملغ من مسحوق المجمدة لاستخراج البروتين.
    ملاحظه: يجب ان تبدو مسحوق المجمدة مثل الرمال البيضاء أو الخفيفة الوردي الناعم كما هو مبين في الشكل 1ه.
15. تخزين عينات المسحوق في-80 درجه مئوية والمضي قدما إلى الحمض الريبي النيبالي والعزلة البروتين في غضون 24 ساعة.

2. استخراج RNA

1. أضافه 10 μL من β-mercaptoethanol (β-ME) لكل 1 مل من العازلة RLT.
2. حساب حجم العازلة RLT المقابلة لنسبه 23.3 mL/mg من الانسجه وأضافه الحجم المناسب من العازلة RLT مع β-ME إلى أنبوب مع مسحوق المجمدة. تم تحديد هذه النسبة تجريبيا لتكون مثاليه لكفوف الفار.
3. دوامه العينة في 3,000 RPM لمده 10 ليالي.
4. اخلطي جيدا بواسطة الأنابيب لاعلي ولأسفل 10 مرات بقوة مع 1 مل pipettor.
5. دوامه العينة مره أخرى في 3,000 RPM لمده 20 ثانيه.
6. الطرد المركزي أنبوب في 13,000 x g لمده 2 دقيقه.
7. نقل 700 μL من supernatants إلى أنبوب جديد وأضافه 700 μL من الايثانول 70 ٪.
   ملاحظه: إذا كان < 700 μL في الأنبوب ، فمن المقبول المضي قدما ، لا يزال أضافه حجم مكافئ من 70 ٪ الايثانول.
8. تحميل 700 μL من العينة علي عمود تنقيه RNA.
9. الطرد المركزي أنبوب في ≥ 10,000 x g لمده 30 ثانيه.
10. تجاهل التدفق وتحميل الجزء المتبقي من العينة إلى العمود RNeasy.
11. الطرد المركزي أنبوب في ≥ 10,000 x g لمده 30 ثانيه.
12. تجاهل تدفق من خلال وغسل العمود عن طريق أضافه 700 μL من المخزن المؤقت RW1 مع طرد من ≥ 10,000 x g ل 30 s. إذا كان أداء الخيار الهضم DNASE ، 350 μL من RW1 يضاف قبل العلاج DNASE.  ويضاف 350 μL اضافيه من RW1 بعد العلاج DNASE.
13. اختياري) تنفيذ خطوه الهضم DNase اتباع تعليمات الشركة المصنعة.
14. غسل الأنبوب مرتين عن طريق أضافه 500 μL من المخزن المؤقت RPE تليها طرد في ≥ 10,000 x g ل 30 s. تجاهل تدفق من خلال كل مره.
15. تجفيف العمود بواسطة طرد في ≥ 10,000 x g لمده 2 دقيقه.
16. Elute RNA عن طريق أضافه 50 μL المياه مع طرد في ≥ 10,000 x g لمده 2 دقيقه جمع تدفق من خلال ونقل إلى أنبوب 1.5 mL جديده.
17. تحديد كميه الحمض الريبي النيبالي باستخدام طريقه الباحث الاختيار وتخزين في-80 درجه مئوية قبل مزيد من التحليل.

3. استخراج البروتين

1. تمييع 10x الخلية تحلل حل الأسهم في 1x الخلية تحلل حل الأسهم باستخدام المياه الصف ثقافة الخلية.
2. أعاده تشكيل مجموعه مثبطات البروتياز كوكتيل انا مع 1 مل من الماء لجعل المخزون مثبطات الانزيم البروتيني 100x.
3. أضافه 100 μL من مثبطات الانزيم البروتيني إلى 9.9 مل من 1x خليه تحلل لجعل 1x حل الأسهم النهائية.
4. أضافه 4 μL من الجليد الباردة 1x خليه تحلل العازلة لكل مسحوق الانسجه ملغ (علي سبيل المثال ، 800 μL من تحلل العازلة إلى 200 ملغ من مسحوق الانسجه).
5. أضافه واحده 5 مم الفولاذ المقاوم للصدا حبه إلى أنبوب.
6. دوامه الأنبوب في 3,000 دوره في الدقيقة ل 60 s. نقل الأنبوب إلى الجليد الرطب والاستمرار في العينة القادمة.
7. وضع جميع أنابيب عينه في مربع ويهز مربع الطرد المركزي علي الروك في 1,000 RPM ، 4 درجه مئوية لمده 1 ساعة.
   ملاحظه: قد يجد الباحثون ان وضع مربع العمودي يمكن ان تسهل خلط أفضل مع حبه.
8. الطرد المركزي أنابيب في 10,000 x g و 4 درجه مئوية لمده 15 دقيقه.
9. نقل supernatants إلى أنبوب جديد وتجنب طبقه الدهون في الأعلى.
10. تحديد تركيز البروتين الكلي. 10 إلى 30 اضعاف المخففات من محلله البروتين مثاليه لاختبار bca.
11. Aliquot العينة إلى 1.5 mL أنابيب الطرد المركزي الصغير وتخزين في-80 درجه مئوية قبل مزيد من التحليل.

Results

هنا ، ونحن نظهر ممثل التصور الصورة هلام من الجيش النيبالي الريبي المستخرجة من الكفوف الاماميه من الفئران CIA في الشكل 2ا. RRNA 28S و rRNA 18S الفرقة تشير إلى جميع العينات لديها كميه كافيه من الحمض الريبي النيبالي سليمه. المقبل ، ونحن تظهر مؤامرة مبعثر ممثل من مجموع تركيزات البروتين علي أساس تحليل BCA البروتين في الشكل 2ب. مجموع تركيزات البروتين من الفئران الساذجة ، والفئران CIA أو الفئران CIA تحت...

Discussion

علي الرغم من ان هناك مبرر علمي قوي لتقييم المسارات الجزيئية في الانسجه الزليلي ، وركزت العديد من التقارير علي التنميط المناعي للنموذج murine CIA علي الدم المحيطي ، في حين ان البروتين وبيانات تحليل RNA من الكفوف الملتهبة محدوده نوعا ما. هناك العديد من الأسباب المحتملة لهذا التحيز: المفاصل الكاحل murine ليست أكبر من ~ 2 سم; المناطق المتضررة تتكون من الجلد والعظام والانسجه الضامة التي غالبا ما تكون صعبه التجانس باستخدام الأساليب التقليدية مثل المطاحن الانسجه ، مدقه وهاون ، وتعطيل حبه السيليكا ، تريلوريشن أو الهضم الانزيمي. ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
حبة 5 مم من الفولاذ المقاوم للصدأ	Qiagen	69989
بيتا ميركابتو إيثانول	سيجما	M6250	عامل تقليل العينة الذي يثبط إنزيمات RNASE مجموعة
المحلل الحيوي	Agilent	5067-1511	طقم تأهيل الحمض النووي الريبي
b-mercaptoethanol	Sigma	M6250
ثقافة الخلية الصف Water	Corning	25-055-CI
حل مخزون تحلل الخلايا	المائية إشارات الخلية	9803
أنبوب Eppendorf	أنابيب Eppendorf	22363204	Microfuge
صندوق الطرد المركزي أنبوب Eppendorf	Nalgene	5055	Box لعقد أنابيب eppendorf في ترتيب الأنبوب
الأفقي Everlast 247 متغير السرعة Rocker	Benchmark Scientific	BR5000
مطحنة الفريزر	Spex Sample Prep	6875	الفريزر / المطحنة لمعالجة الكفوف إلى مسحوق مطحوق
طحن قارورة	Spex عينة الإعدادية	6801	قارورة بولي كربونات لمعالجة الكفوف إلى مسحوق مسحوق
مسحوق بيرس BCA kit	بيرس	23225	كيت لإجمالي كمية البروتين
كوكتيل مثبطات البروتياز 1	مثبطات
البروتياز 539131 كالبيوكيممجموعة البروتين BCA	بيرس	23225
مجموعة Quantigene	Thermofisher	QP1013	bDNA طقم تحليل المبرد
الطرد المركزي الدقيق	Eppendorf	5417R	الطرد المركزي
RLT Buffer	Qiagen	79216	مخزن استخراج الحمض النووي الريبي
RNeasy مجموعة صغيرة	Qiagen	74104	بما في ذلك عمود RNeasy و RLT Buffer و RW1 Buffer
شاكر	المعيار العلمي	BR5000	هزيل / شاكر
ملعقة	VWR	10806-412	ملعقة لنقل مسحوق
حبة الفولاذ المقاوم	Qiagen	69989	حبة للخلط أثناء استخراج البروتين
أنبوب المستخرج	Spex عينة الإعدادية	6884	مستخرج لإزالة الجزء العلوي من قارورة
الطحن Vortexer	VWR	10153-838	خلط العينة