تم تطوير طريقه السحق المبردة لمعالجه الكفوف murine باستخدام مطحنه النيتروجين السائل التجميد لتحسين الغلة وجوده الحمض الريبي النيبالي أو البروتين المستخرج من الانسجه وتمكين تحليل الملامح الجزيئية المرتبطة التهابات الاستجابات.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
بروتوكول تجميد السحق لمعالجه الكفوف الماوس لتقييم المسارات الجزيئية للالتهابات الانسجه في الكولاجين المستحثة نموذج التهاب المفاصل
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
تنميط التغيرات الجزيئية في الانسجه المحلية أمر حاسم لفهم اليه (ق) عمل المرشحين العلاجية في الجسم الحي. في مجال البحوث التهاب المفاصل ، وتركز العديد من الدراسات علي المفاصل الملتهبة التي تتكون من خليط معقد من العظام والغضاريف والعضلات والخلايا اللحمية والخلايا المناعية. هنا ، انشانا طريقه ميكانيكيه موثوقه وقويه لتعطيل الكفوف الماوس ملتهبة في عينات المسحوق متجانسة في بيئة تسيطر عليها الديتريوم. وتمت معالجه البروتينات والحمض الريبي النيبالي لتمكين نقاط النهاية البروتينية والمتحولة والتوصيف الجزيئي لمسارات الامراض ذات الصلة في الانسجه المحلية.
المقدمة
التهاب المفاصل الروماتويدي (RA) هو مرض التهابي مزمن الجهازية مع التهاب الغدة الدرقية المتماثل المستمر في المفاصل ومشاركه مفصليه اضافيه من أجهزه مثل الجلد والقلب والرئتين ، والعينين1. علي الرغم من ان المظاهر الجهازية للاستجابة المناعية واضحة في المرضي البشريين ، واحده من السمات المميزة للامراض RA هو تسلل الخلايا المناعية في الانسجه الزليلي وانتشار الخلايا الليفية الزليلي2.
علي غرار RA الإنسان ، الكولاجين الماوس المستحثة التهاب المفاصل (CIA) نموذج يثير التهاب الانسجه القوية مع الاستجابات المناعية النشطة في الانسجه الزليلي والمقصورات الجهازية. الحساسية من سلالات الماوس مختلفه لارتباطات نموذج وكاله المخابرات الخاصة إلى مجمع التوافق الرئيسية (mhc) النمط والخلية المحددة antigen T و B التفاعلات الخلية3,4. الاضافه إلى ذلك ، فان العديد من المسارات المسببة للامراض في RA الإنسان ، بما في ذلك إنتاج الأجسام المضادة ، وترسب معقده المناعي ، وتنشيط الخلايا النخاعية ، ومظاهر متعددة المفصليات وتشكيل بانيوس مع تسلل المناعي الزليلي ، هي أيضا واضحة في هذا النموذج 5,6. وقد استخدم المحققون هذا النموذج الراسخ CIA للتحقيق في اثار العلاجات السايسيسين المضادة للالتهابات7. وقد تم العثور علي العديد من البيولوجية المعتمدة للامراض المناعية الذاتية أو التهابيه ، مثل المضادة لل tnfα والمضادة لل-6 ، ان تكون فعاله في نموذج8،9وكاله المخابرات العامة.
التنميط التفاعلات من الجهاز المناعي في الانسجه الزليلي أمر حاسم لتوضيح أليات الجزيئية المرتبطة بالتسبب في RA. في البيئة السريرية البشرية ، والممارسة الشائعة هي اجراء الخزعات الزليلي الابره تحت اشراف التصوير بالموجات فوق الصوتية. في الإعدادات الاكلينيكيه ، يجعل الهيكل الأصغر للمفاصل الmurine إجراءات الخزعة أكثر صعوبة ان لم يكن مستحيلا. في الاونه الاخيره ، أظهرنا استخدام نموذج murine CIA لتقييم مجموعات من الادويه للتاثير علي نقاط النهاية المتباينة وحل المرض في نهج التوافقية10. وقد استخدمت طريقه الطحن المبردة طاحونة القائم علي مطحنه لمعالجه الكفوف murine الملتهبة في مساحيق ناعمه متجانسة والعمليات التي أنشئت المصب لاستخراج الحمض الريبي النيبالي والبروتينات. هذه الطريقة تحمي الحمض الريبي النيبالي والبروتين من العمليات الانزيميه والكيميائية degrative وتمكننا من تطبيق أساليب تحليليه متعددة لمصدر عينه متجانس واحد.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
وقد أجريت جميع التجارب الحيوانية وفقا لسياسات اللجنة المؤسسية للعناية بالماشية واستخدامها التابعة لشركه Janssen R & D.
1. المبردة تجميد مطحنه القائم علي طريقه الطحن
- عند إنهاء دراسة وكاله المخابرات الخاصة ، والفئران التضحية مع 1.5 ٪ ايزوفلوراني تليها خلع عنق الرحم.
- في يوم معالجه الانسجه ، قبل البرد جميع الصكوك (ملاعق ، قوارير طحن ، الخ) علي الجليد الجاف لمده لا تقل عن 10 دقيقه. ارتداء قفازات الحرارية لتجنب تجميد الضرر.
- قطع الكفوف الخلفية مع مقص في خط الفراء كما هو مبين في الشكل 1ا.
- نقل كل مخلب في واحد 1.5 mL أنبوب الطرد المركزي الصغير ، والمفاجئة تجميد في النيتروجين السائل علي الفور ، وتخزين الكفوف المجمدة في-80 درجه مئوية. لا تبقي العينات المجمدة لأكثر من أسبوع واحد.
- ملء مطحنه الفريزر مع النيتروجين السائل كما هو مبين في الشكل 1ب والسماح لها تتوازن لمده 10 دقيقه علي الأقل.
- حافظ علي العينة غير المجهزة علي الثلج الجاف وتجنب دورات التجمد والذوبان.
- نقل واحده مخلب الخلفية إلى ما قبل المبردة البولي الكبير طحن قارورة مع المكونات الصلب السفلي ، وادراج الفاعل الصلب قبل المبردة وإغلاق قارورة طحن البولي مع المكونات الصلب قبل المبردة الأعلى (الشكل 1ج).
- نقل قوارير كبيره البولي طحن مع عينات في مطحنه الفريزر قبل مملوءة بالسائل وإغلاق الغطاء مع المشبك المطاطي وجدت في المقدمة من الصك.
- اسمحوا عينات بارده في النيتروجين السائل لمده 1 دقيقه.
- تعيين مطحنه الفريزر إلى برنامج 1 دقيقه مع 10 دورات في الثانية الواحدة واضغط علي زر البداية. انتظر مطحنه الفريزر لإكمال دوره.
ملاحظه: الجهاز يجعل صوت الطبول كما يتحرك الاندفاع الصلب ذهابا وإيابا. استخدم مقابس الاذن لتجنب فقدان السمع. - فتح غطاء مطحنه التجميد ، وإخراج قارورة كبيره البولي طحن ووضعها في مستخرج كما هو مبين في الشكل 1د. أزاله المكونات الصلب العلوي من خلال وضع الضغط الهبوطي علي مقبض اسود حتى المكونات الصلب الشرائح من أنبوب البولي.
- انقل قارورة البولي كربونات الكبيرة المفتوحة إلى الثلج الجاف. أزاله الفاعل الصلب مع ملقط قبل المبردة.
- نقل مسحوق المجمدة إلى ما قبل المبردة 50 mL أنبوب مخروطي.
- الوزن 30-50 ملغ من مسحوق المجمدة في tared المجمدة 1.5 mL أنبوب ميكروالطرد المركزي لاستخراج RNA و 100-200 ملغ من مسحوق المجمدة لاستخراج البروتين.
ملاحظه: يجب ان تبدو مسحوق المجمدة مثل الرمال البيضاء أو الخفيفة الوردي الناعم كما هو مبين في الشكل 1ه. - تخزين عينات المسحوق في-80 درجه مئوية والمضي قدما إلى الحمض الريبي النيبالي والعزلة البروتين في غضون 24 ساعة.
2. استخراج RNA
- أضافه 10 μL من β-mercaptoethanol (β-ME) لكل 1 مل من العازلة RLT.
- حساب حجم العازلة RLT المقابلة لنسبه 23.3 mL/mg من الانسجه وأضافه الحجم المناسب من العازلة RLT مع β-ME إلى أنبوب مع مسحوق المجمدة. تم تحديد هذه النسبة تجريبيا لتكون مثاليه لكفوف الفار.
- دوامه العينة في 3,000 RPM لمده 10 ليالي.
- اخلطي جيدا بواسطة الأنابيب لاعلي ولأسفل 10 مرات بقوة مع 1 مل pipettor.
- دوامه العينة مره أخرى في 3,000 RPM لمده 20 ثانيه.
- الطرد المركزي أنبوب في 13,000 x g لمده 2 دقيقه.
- نقل 700 μL من supernatants إلى أنبوب جديد وأضافه 700 μL من الايثانول 70 ٪.
ملاحظه: إذا كان < 700 μL في الأنبوب ، فمن المقبول المضي قدما ، لا يزال أضافه حجم مكافئ من 70 ٪ الايثانول. - تحميل 700 μL من العينة علي عمود تنقيه RNA.
- الطرد المركزي أنبوب في ≥ 10,000 x g لمده 30 ثانيه.
- تجاهل التدفق وتحميل الجزء المتبقي من العينة إلى العمود RNeasy.
- الطرد المركزي أنبوب في ≥ 10,000 x g لمده 30 ثانيه.
- تجاهل تدفق من خلال وغسل العمود عن طريق أضافه 700 μL من المخزن المؤقت RW1 مع طرد من ≥ 10,000 x g ل 30 s. إذا كان أداء الخيار الهضم DNASE ، 350 μL من RW1 يضاف قبل العلاج DNASE. ويضاف 350 μL اضافيه من RW1 بعد العلاج DNASE.
- اختياري) تنفيذ خطوه الهضم DNase اتباع تعليمات الشركة المصنعة.
- غسل الأنبوب مرتين عن طريق أضافه 500 μL من المخزن المؤقت RPE تليها طرد في ≥ 10,000 x g ل 30 s. تجاهل تدفق من خلال كل مره.
- تجفيف العمود بواسطة طرد في ≥ 10,000 x g لمده 2 دقيقه.
- Elute RNA عن طريق أضافه 50 μL المياه مع طرد في ≥ 10,000 x g لمده 2 دقيقه جمع تدفق من خلال ونقل إلى أنبوب 1.5 mL جديده.
- تحديد كميه الحمض الريبي النيبالي باستخدام طريقه الباحث الاختيار وتخزين في-80 درجه مئوية قبل مزيد من التحليل.
3. استخراج البروتين
- تمييع 10x الخلية تحلل حل الأسهم في 1x الخلية تحلل حل الأسهم باستخدام المياه الصف ثقافة الخلية.
- أعاده تشكيل مجموعه مثبطات البروتياز كوكتيل انا مع 1 مل من الماء لجعل المخزون مثبطات الانزيم البروتيني 100x.
- أضافه 100 μL من مثبطات الانزيم البروتيني إلى 9.9 مل من 1x خليه تحلل لجعل 1x حل الأسهم النهائية.
- أضافه 4 μL من الجليد الباردة 1x خليه تحلل العازلة لكل مسحوق الانسجه ملغ (علي سبيل المثال ، 800 μL من تحلل العازلة إلى 200 ملغ من مسحوق الانسجه).
- أضافه واحده 5 مم الفولاذ المقاوم للصدا حبه إلى أنبوب.
- دوامه الأنبوب في 3,000 دوره في الدقيقة ل 60 s. نقل الأنبوب إلى الجليد الرطب والاستمرار في العينة القادمة.
- وضع جميع أنابيب عينه في مربع ويهز مربع الطرد المركزي علي الروك في 1,000 RPM ، 4 درجه مئوية لمده 1 ساعة.
ملاحظه: قد يجد الباحثون ان وضع مربع العمودي يمكن ان تسهل خلط أفضل مع حبه. - الطرد المركزي أنابيب في 10,000 x g و 4 درجه مئوية لمده 15 دقيقه.
- نقل supernatants إلى أنبوب جديد وتجنب طبقه الدهون في الأعلى.
- تحديد تركيز البروتين الكلي. 10 إلى 30 اضعاف المخففات من محلله البروتين مثاليه لاختبار bca.
- Aliquot العينة إلى 1.5 mL أنابيب الطرد المركزي الصغير وتخزين في-80 درجه مئوية قبل مزيد من التحليل.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
هنا ، ونحن نظهر ممثل التصور الصورة هلام من الجيش النيبالي الريبي المستخرجة من الكفوف الاماميه من الفئران CIA في الشكل 2ا. RRNA 28S و rRNA 18S الفرقة تشير إلى جميع العينات لديها كميه كافيه من الحمض الريبي النيبالي سليمه. المقبل ، ونحن تظهر مؤامرة مبعثر ممثل من مجموع تركيزات البروتين علي أساس تحليل BCA البروتين في الشكل 2ب. مجموع تركيزات البروتين من الفئران الساذجة ، والفئران CIA أو الفئران CIA تحت...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
علي الرغم من ان هناك مبرر علمي قوي لتقييم المسارات الجزيئية في الانسجه الزليلي ، وركزت العديد من التقارير علي التنميط المناعي للنموذج murine CIA علي الدم المحيطي ، في حين ان البروتين وبيانات تحليل RNA من الكفوف الملتهبة محدوده نوعا ما. هناك العديد من الأسباب المحتملة لهذا التحيز: المفاصل الكاحل murine ليست أكبر من ~ 2 سم; المناطق المتضررة تتكون من الجلد والعظام والانسجه الضامة التي غالبا ما تكون صعبه التجانس باستخدام الأساليب التقليدية مثل المطاحن الانسجه ، مدقه وهاون ، وتعطيل حبه السيليكا ، تريلوريشن أو الهضم الانزيمي. ...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
المؤلفين BJ ، SH ، ML ، RM ، ML ، إلى والخدمات المالية هي موظفي Janssen البحوث & شركه التنمية وهي المساهمين في الشركة الام ، جونسون & جونسون ، وشركه.
شكر وتقدير
ويود المؤلفون ان يشكروا اديث جانسين علي المراجعة النقدية لمخطوطه نافين راو وجنيفر تاون لدعمهما لنشر هذه المخطوطة.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| حبة 5 مم من الفولاذ المقاوم للصدأ | Qiagen | 69989 | |
| بيتا ميركابتو إيثانول | سيجما | M6250 | عامل تقليل العينة الذي يثبط إنزيمات RNASE مجموعة |
| المحلل الحيوي | Agilent | 5067-1511 | طقم تأهيل الحمض النووي الريبي |
| b-mercaptoethanol | Sigma | M6250 | |
| ثقافة الخلية الصف Water | Corning | 25-055-CI | |
| حل مخزون تحلل الخلايا | المائية إشارات الخلية | 9803 | |
| أنبوب Eppendorf | أنابيب Eppendorf | 22363204 | Microfuge |
| صندوق الطرد المركزي أنبوب Eppendorf | Nalgene | 5055 | Box لعقد أنابيب eppendorf في ترتيب الأنبوب |
| الأفقي Everlast 247 متغير السرعة Rocker | Benchmark Scientific | BR5000 | |
| مطحنة الفريزر | Spex Sample Prep | 6875 | الفريزر / المطحنة لمعالجة الكفوف إلى مسحوق مطحوق |
| طحن قارورة | Spex عينة الإعدادية | 6801 | قارورة بولي كربونات لمعالجة الكفوف إلى مسحوق مسحوق |
| مسحوق بيرس BCA kit | بيرس | 23225 | كيت لإجمالي كمية البروتين |
| كوكتيل مثبطات البروتياز 1 | مثبطات | ||
| البروتياز 539131 كالبيوكيممجموعة البروتين BCA | بيرس | 23225 | |
| مجموعة Quantigene | Thermofisher | QP1013 | bDNA طقم تحليل المبرد |
| الطرد المركزي الدقيق | Eppendorf | 5417R | الطرد المركزي |
| RLT Buffer | Qiagen | 79216 | مخزن استخراج الحمض النووي الريبي |
| RNeasy مجموعة صغيرة | Qiagen | 74104 | بما في ذلك عمود RNeasy و RLT Buffer و RW1 Buffer |
| شاكر | المعيار العلمي | BR5000 | هزيل / شاكر |
| ملعقة | VWR | 10806-412 | ملعقة لنقل مسحوق |
| حبة الفولاذ المقاوم | Qiagen | 69989 | حبة للخلط أثناء استخراج البروتين |
| أنبوب المستخرج | Spex عينة الإعدادية | 6884 | مستخرج لإزالة الجزء العلوي من قارورة |
| الطحن Vortexer | VWR | 10153-838 | خلط العينة |
المراجع
- Firestein, G. S. Immunologic mechanisms in the pathogenesis of rheumatoid arthritis. Journal of Clinical Rheumatology. 11, S39-S44 (2005).
- McInnes, I. B., Schett, G. The pathogenesis of rheumatoid arthritis. New England Journal of Medicine. 365, 2205-2219 (2011).
- Ahlqvist, E., Hultqvist, M., Holmdahl, R. The value of animal models in predicting genetic susceptibility to complex diseases such as rheumatoid arthritis. Arthritis Research and Therapy. 11, 226(2009).
- David, C. S., Taneja, V. Role of major histocompatibility complex genes in murine collagen-induced arthritis: a model for human rheumatoid arthritis. American Journal of the Medical Sciences. 327, 180-187 (2004).
- Tarkowski, A., Holmdahl, R., Klareskog, L. Rheumatoid factors in mice. Monographs in Allergy. 26, 214-229 (1989).
- Schurgers, E., Billiau, A., Matthys, P. Collagen-induced arthritis as an animal model for rheumatoid arthritis: focus on interferon-gamma. Journal of Interferon & Cytokine Research. 31, 917-926 (2011).
- Joosten, L. A., Helsen, M. M., van de Loo, F. A., van den Berg, W. B. Anticytokine treatment of established type II collagen-induced arthritis in DBA/1 mice. A comparative study using anti-TNF alpha anti-IL-1 alpha/beta, and IL-1Ra. Arthritis & Rheumatology. 39, 797-809 (1996).
- Asquith, D. L., Miller, A. M., McInnes, I. B., Liew, F. Y. Animal models of rheumatoid arthritis. European Journal of Immunology. 39, 2040-2044 (2009).
- Williams, R. O. Collagen-induced arthritis as a model for rheumatoid arthritis. Methods in Molecular Medicine. 98, 207-216 (2004).
- Shen, F., et al. Combined Blockade of TNF-alpha and IL-17A Alleviates Progression of Collagen-Induced Arthritis without Causing Serious Infections in Mice. Journal of Immunology. 202, 2017-2026 (2019).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
