تم تطوير طريقه السحق المبردة لمعالجه الكفوف murine باستخدام مطحنه النيتروجين السائل التجميد لتحسين الغلة وجوده الحمض الريبي النيبالي أو البروتين المستخرج من الانسجه وتمكين تحليل الملامح الجزيئية المرتبطة التهابات الاستجابات.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
بروتوكول تجميد السحق لمعالجه الكفوف الماوس لتقييم المسارات الجزيئية للالتهابات الانسجه في الكولاجين المستحثة نموذج التهاب المفاصل
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
تنميط التغيرات الجزيئية في الانسجه المحلية أمر حاسم لفهم اليه (ق) عمل المرشحين العلاجية في الجسم الحي. في مجال البحوث التهاب المفاصل ، وتركز العديد من الدراسات علي المفاصل الملتهبة التي تتكون من خليط معقد من العظام والغضاريف والعضلات والخلايا اللحمية والخلايا المناعية. هنا ، انشانا طريقه ميكانيكيه موثوقه وقويه لتعطيل الكفوف الماوس ملتهبة في عينات المسحوق متجانسة في بيئة تسيطر عليها الديتريوم. وتمت معالجه البروتينات والحمض الريبي النيبالي لتمكين نقاط النهاية البروتينية والمتحولة والتوصيف الجزيئي لمسارات الامراض ذات الصلة في الانسجه المحلية.
المقدمة
التهاب المفاصل الروماتويدي (RA) هو مرض التهابي مزمن الجهازية مع التهاب الغدة الدرقية المتماثل المستمر في المفاصل ومشاركه مفصليه اضافيه من أجهزه مثل الجلد والقلب والرئتين ، والعينين1. علي الرغم من ان المظاهر الجهازية للاستجابة المناعية واضحة في المرضي البشريين ، واحده من السمات المميزة للامراض RA هو تسلل الخلايا المناعية في الانسجه الزليلي وانتشار الخلايا الليفية الزليلي2.
علي غرار RA الإنسان ، الكولاجين الماوس المستحثة التهاب المفاصل (CIA) نموذج يثير التهاب الانسجه القوية مع الاستجابات المناعية النشطة في الانسجه الزليلي والمقصورات الجهازية. الحساسية من سلالات الماوس مختلفه لارتباطات نموذج وكال....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
وقد أجريت جميع التجارب الحيوانية وفقا لسياسات اللجنة المؤسسية للعناية بالماشية واستخدامها التابعة لشركه Janssen R & D.
1. المبردة تجميد مطحنه القائم علي طريقه الطحن
- عند إنهاء دراسة وكاله المخابرات الخاصة ، والفئران التضحية مع 1.5 ٪ ايزوفلوراني تليها خلع عنق الرحم.
- في يوم معالجه الانسجه ، قبل البرد جميع الصكوك (ملاعق ، قوارير طحن ، الخ) علي الجليد الجاف لمده لا تقل عن 10 دقيقه. ارتداء قفازات الحرارية لتجنب تجميد الضرر.
- قطع الكفوف الخلفية مع مقص في خط الفراء كما هو مبين في الشكل 1ا.
- نقل كل مخلب في واحد 1.5 mL أنبوب الطرد المركزي الصغير ، والمفاجئة تجميد في ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
هنا ، ونحن نظهر ممثل التصور الصورة هلام من الجيش النيبالي الريبي المستخرجة من الكفوف الاماميه من الفئران CIA في الشكل 2ا. RRNA 28S و rRNA 18S الفرقة تشير إلى جميع العينات لديها كميه كافيه من الحمض الريبي النيبالي سليمه. المقبل ، ونحن تظهر مؤامرة مبعثر ممثل من مجموع تركيزات البروتين علي أساس تحليل BCA البروتين في الشكل 2ب. مجموع تركيزات البروتين من الفئران الساذجة ، والفئران CIA أو الفئران CIA تحت.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
علي الرغم من ان هناك مبرر علمي قوي لتقييم المسارات الجزيئية في الانسجه الزليلي ، وركزت العديد من التقارير علي التنميط المناعي للنموذج murine CIA علي الدم المحيطي ، في حين ان البروتين وبيانات تحليل RNA من الكفوف الملتهبة محدوده نوعا ما. هناك العديد من الأسباب المحتملة لهذا التحيز: المفاصل الكاحل murine ليست أكبر من ~ 2 سم; المناطق المتضررة تتكون من الجلد والعظام والانسجه الضامة التي غالبا ما تكون صعبه التجانس باستخدام الأساليب التقليدية مثل المطاحن الانسجه ، مدقه وهاون ، وتعطيل حبه السيليكا ، تريلوريشن أو الهضم الانزيمي. .......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
المؤلفين BJ ، SH ، ML ، RM ، ML ، إلى والخدمات المالية هي موظفي Janssen البحوث & شركه التنمية وهي المساهمين في الشركة الام ، جونسون & جونسون ، وشركه.
شكر وتقدير
ويود المؤلفون ان يشكروا اديث جانسين علي المراجعة النقدية لمخطوطه نافين راو وجنيفر تاون لدعمهما لنشر هذه المخطوطة.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| حبة 5 مم من الفولاذ المقاوم للصدأ | Qiagen | 69989 | |
| بيتا ميركابتو إيثانول | سيجما | M6250 | عامل تقليل العينة الذي يثبط إنزيمات RNASE مجموعة |
| المحلل الحيوي | Agilent | 5067-1511 | طقم تأهيل الحمض النووي الريبي |
| b-mercaptoethanol | Sigma | M6250 | |
| ثقافة الخلية الصف Water | Corning | 25-055-CI | |
| حل مخزون تحلل الخلايا | المائية إشارات الخلية | 9803 | |
| أنبوب Eppendorf | أنابيب Eppendorf | 22363204 | Microfuge |
| صندوق الطرد المركزي أنبوب Eppendorf | Nalgene | 5055 | Box لعقد أنابيب eppendorf في ترتيب الأنبوب |
| الأفقي Everlast 247 متغير السرعة Rocker | Benchmark Scientific | BR5000 | |
| مطحنة الفريزر | Spex Sample Prep | 6875 | الفريزر / المطحنة لمعالجة الكفوف إلى مسحوق مطحوق |
| طحن قارورة | Spex عينة الإعدادية | 6801 | قارورة بولي كربونات لمعالجة الكفوف إلى مسحوق مسحوق |
| مسحوق بيرس BCA kit | بيرس | 23225 | كيت لإجمالي كمية البروتين |
| كوكتيل مثبطات البروتياز 1 | مثبطات | ||
| البروتياز 539131 كالبيوكيممجموعة البروتين BCA | بيرس | 23225 | |
| مجموعة Quantigene | Thermofisher | QP1013 | bDNA طقم تحليل المبرد |
| الطرد المركزي الدقيق | Eppendorf | 5417R | الطرد المركزي |
| RLT Buffer | Qiagen | 79216 | مخزن استخراج الحمض النووي الريبي |
| RNeasy مجموعة صغيرة | Qiagen | 74104 | بما في ذلك عمود RNeasy و RLT Buffer و RW1 Buffer |
| شاكر | المعيار العلمي | BR5000 | هزيل / شاكر |
| ملعقة | VWR | 10806-412 | ملعقة لنقل مسحوق |
| حبة الفولاذ المقاوم | Qiagen | 69989 | حبة للخلط أثناء استخراج البروتين |
| أنبوب المستخرج | Spex عينة الإعدادية | 6884 | مستخرج لإزالة الجزء العلوي من قارورة |
| الطحن Vortexer | VWR | 10153-838 | خلط العينة |
المراجع
- Firestein, G. S. Immunologic mechanisms in the pathogenesis of rheumatoid arthritis. Journal of Clinical Rheumatology. 11, S39-S44 (2005).
- McInnes, I. B., Schett, G. The pathogenesis of rheumatoid arthritis. New England Journal of Medicine. 365
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
