يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

تحليل استقلاب الخلايا الجذعية للدم

6.6K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/60234

⸱

نوفمبر 9, 2019

 ,  ,  ,  , 
1Nationwide Children's Hospital, 2The Ohio State University College of Medicine, 3The Ohio State University Comprehensive Cancer Center

في هذه المقالة

ملخص

الخلايا الجذعية المكونة للدم (HSPCs) الانتقال من حاله هادئه إلى حاله التمايز بسبب اللدونة الايضيه اثناء تشكيل الدم. هنا ، نقدم طريقه الأمثل لقياس التنفس الميتوكوندريا وتحلل من HSPCs.

الملخص

الخلايا الجذعية المكونة للدم (HSPCs) لديها اللدونة الايضيه المتميزة ، والتي تسمح لهم بالانتقال من حالتهم الهادئة إلى حاله التمايز للحفاظ علي متطلبات تشكيل الدم. ومع ذلك ، كان من الصعب تحليل الوضع الأيضي (التنفس الميتوكوندريا وتحلل) من HSPCs بسبب اعدادهم المحدودة وعدم وجود بروتوكولات الأمثل لغير ملتصقة ، HSPCs الهشة. هنا ، ونحن نقدم مجموعه من واضحة ، خطوه بخطوه تعليمات لقياس التنفس الأيضي (معدل استهلاك الأكسجين. OCR) وتحلل الخلايا (معدل تحمض خارج الخلية ؛ ECAR) من murine نخاع العظم سلالهnegSca1 +c-كيت + (lsk) hspcs. يوفر هذا البروتوكول كميه أكبر من HSK من نخاع العظم murine ، ويحسن من صلاحيه HSPCs اثناء الحضانة ، ويسهل تحليلات تدفق خارج الخلية من HSPCs غير ملتصقة ، ويوفر بروتوكولات الحقن الأمثل (التركيز والوقت) للادويه التي تستهدف الاكسده ومسارات غليكولتيك. هذا الأسلوب يتيح التنبؤ بالحالة الايضيه وصحة HSPCs اثناء نمو الدم والامراض.

المقدمة

منذ عمر معظم خلايا الدم الناضجة قصيرة ، والتوازن من الدم يعتمد علي التجديد الذاتي والتمايز من السكان الذين عاشوا لفتره طويلة ولكنها نادره من الخلايا الجذعية للدم (HSPCs)1. HSPCs هي هادئه ، ولكنها سريعة للانتشار والخضوع التمايز علي التحفيز للحفاظ علي متطلبات نظام الدم. كما كل الدولة الخلوية HSPC يتطلب الطلب حيوية فريدة من نوعها ، والتغيرات الايضيه هي المحركات الرئيسية للقرارات مصير HSPC. ولذلك ، فان فقدان اللدونة الايضيه ، عن طريق تغيير التوازن بين السكون ، والتجديد الذاتي ، والتمايز من HSPCs ، وغالبا ما يؤدي إلى الاضطرابات التكاثرية myelo أو اللمفاوية. معا, فهم التنظيم الأيضي للتنمية hspc أمر بالغ الاهميه للكشف عن أليات الكامنة وراء الأورام الخبيثة الدموية2,3,4,5.

توليد التنفس المتقدريه وتحلل الجلوكوز تولد ATP لدفع ردود الفعل داخل الخلايا وإنتاج كتل البناء اللازمة لتوليف جزيء. منذ HSPCs لديها كتله الميتوكوندريا منخفضه مقارنه بالخلايا المتمايزة6 وانها تحافظ علي الهدوء في منافذ نخاع العظم نقص الأكسجين ، hspcs تعتمد في المقام الأول علي تحلل الجلوكوز. تنشيط HSPCs يعزز الأيض الميتوكوندريا التي تؤدي إلى فقدان الهدوء ودخولها اللاحقة في دوره الخلية. هذه اللدونة الايضيه من hspcs يسمح للحفاظ علي تجمع hspc في جميع انحاء البالغين الحياة6،7،8،9،10،11،12. ولذلك ، فمن الاهميه بمكان التحقيق في أنشطتها الايضيه ، مثل معدل استهلاك الأكسجين (OCR ؛ مؤشر فوسفولات الاكسده) ومعدل تحمض خارج الخلية (ECAR ؛ مؤشر تحلل الجلوكوز) لتحليل تنشيط HSPC والحالة الصحية. ويمكن قياس كل من OCR و ECAR في وقت واحد ، في الزمن الحقيقي ، وذلك باستخدام محلل تدفق خارج الخلية. ومع ذلك ، يتطلب الأسلوب الحالي اعداد كبيره من الخلايا وهو الأمثل للخلايا الملتصقة13. منذ HSPCs لا يمكن عزل بكميات كبيره من الفئران14، تتطلب الفرز للحصول علي السكان النقي ، هي الخلايا غير ملتصقة15، ولا يمكن ان يكون مثقفا بين عشيه وضحيها دون تجنب التمايز16، فقد كان من الصعب قياس OCR و ecar من hspcs. هنا ، ونحن نقدم مجموعه من واضحة ، خطوه بخطوه تعليمات لمرافقه الدروس المستندة إلى الفيديو علي كيفيه قياس التنفس الأيضي وتحلل من بضعة آلاف murine نخاع العظم النسبnegSca1 +c-كيت + (lsk) hspcs.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

تمت الموافقة علي هذا البروتوكول من قبل اللجنة الوطنية لرعاية واستخدام الماشية في مستشفيات الأطفال (IACUC).

ملاحظه: ويرد وصف البروتوكول بالترتيب الزمني الذي يمتد لمده يومين. استخدام الكواشف الطازجة كما هو موضح في البروتوكول أدناه.

1. اعداد الكواشف في اليوم السابق لفحص

  1. هيدرات خرطوشه الاستشعار.
    1. احتضان 5 مل من معايره (جدول المواد) في غير CO2 37 درجه مئوية حاضنه بين عشيه وضحيها.
    2. فتح عده الفحص الجريان (جدول المواد) وفصل خرطوشه الاستشعار (الأخضر ؛ اعلي) من لوحه الاداه المساعدة (شفافة ؛ أسفل). بعد ذلك ، ضع خرطوشه الاستشعار راسا علي عقب والمتاخمة للوحه الاداه المساعدة.
    3. استخدام المياه المعقمة ، وملء الآبار من لوحه الاداه المساعدة (200 μL) والدوائر حول الآبار (400 μL).
    4. دمج خرطوشه الاستشعار في لوحه الاداه المساعدة مع التاكد من ان أجهزه الاستشعار مغطاه بالبالكامل بالماء. انقر فوق 3x لتجنب تشكيل فقاعات.
    5. وضع خرطوشه المغمورة في لوحه الاداه المساعدة في غير CO2 37 درجه مئوية حاضنه بين عشيه وضحيها. لمنع تبخر الماء ، تاكد من ترطيب الحاضنة بشكل صحيح. ضع الدورق المفتوح الذي يحتوي علي H2O كاحتياط إضافي بجانب لوحه الخرطوشة المساعدة ، خاصه إذا كنت تستخدم فرن عادي.
  2. جهزي لوحه الفحص
    1. تعقيم سطح مجلس الوزراء السلامة البيولوجية الفئة 2 باستخدام 70 ٪ الايثانول. افتح لوحه الفحص تحت غطاء المحرك.
    2. أضافه 40 μL من المتاحة تجاريا 0.01 ٪ (ث/ف) بولي-L-يسين (PLL) حل لكل بئر من لوحه الفحص تحت غطاء محرك السيارت.
    3. غطي لوحه الفحص بالغطاء المتوفر في الطقم. احتضان لوحه الفحص المغلقة في درجه حرارة الغرفة (RT) تحت غطاء محرك الساعة لمده 1 ساعة.
      ملاحظه: والهدف من الحضانة هو السماح PLL معطف سطح لوحه الفحص لتسهيل التصاق الخلايا المعلقة علي سطح لوحه الفحص.
    4. بعد 1 h الحضانة من لوحه الفحص ، وأزاله الحل الزائدة مع المعقم القائم علي فراغ والشفط والهواء الجاف البئر تحت غطاء محرك الطائرة.
      ملاحظه: يستغرق ~ 30 − 60 دقيقه لتجفيف الهواء الآبار من لوحه الفحص بعد أزاله PLL المفرط باستخدام الطامح.

2. يوم الفحص

  1. جهز الخرطوشة.
    1. ارفع خرطوشه المستشعر. وضعه راسا علي عقب في النسيج الثقافة هود وتجاهل المياه من لوحه الاداه المساعدة.
    2. ملء الآبار لوحه الاداه المساعدة مع 200 μL من معايره ما قبل الحرارة.
    3. ملء الغرف حول الآبار مع 400 μL من معايره.
    4. دمج خرطوشه الاستشعار في لوحه الاداه المساعدة ، والتاكد من ان أجهزه الاستشعار مغطاه تماما من قبل معايره. انقر فوق 3x لتجنب تشكيل فقاعات.
    5. تتوازن خرطوشه الاستشعار المغمورة في لوحه المرافق في غير CO2 37 درجه مئوية حاضنه لمده 45 − 60 دقيقه.
  2. حصاد النخاع العظم المشتقة من ال LSK HSPCs.
    1. لاستيعاب نسخ متماثلة البيولوجية كافيه ، خطه لاستخدام HSPCs المستمدة من ماوس واحد لكل بئر من لوحه الفحص.
      ملاحظه: يوفر هذا الأسلوب الحصاد نخاع العظم ~ 50000 − 80000 LSK HSPCs من كل ماوس. هذا البروتوكول لقياس تدفق خارج الخلية هو الأمثل ل ~ 70,000 LSK HSPCs لكل بئر من 96 جيدا لوحه.
    2. الفئران موت ببطء باستخدام CO2 جرعه زائده وخلع عنق الرحم, بعد الأساليب المعتمدة IACUC المحلية.
    3. تعقيم سطح أدوات تشريح ومقاعد البدلاء باستخدام الايثانول 70 ٪.
    4. لكل الماوس ، قبل ملء طبق بيتري واحد مع 1x الفوسفات-مخزنه المالحة (تلفزيوني) التي تحتوي علي 2 ٪ الحرارة الجنين البقري المنشط المصل (ار) في RT.
      ملاحظه: لا تستخدم برامج تلفزيونيه المبردة مسبقا لأنها سوف تخلق كتل في الخطوات التالية.
    5. رذاذ 70 ٪ الايثانول (v/v) علي الماوس رحيم بأكمله. عزل جميع العظام ، بما في ذلك الأطراف العلوية والسفلية ، عظام الورك ، القص ، القفص الصدري ، والعمود الفقري ، من الماوس17،18. سحب المادة البيضاء من الحبل الشوكي للماوس لأنها يمكن ان تلوث خلايا LSK. وضع جميع العظام في 1x التلفزيونية (+ 2 ٪) ، كما يتم جمعها ، في طبق بيتري حتى مزيد من الاستخدام.
    6. عكس أنبوب مخروطي 50 mL (جديد في كل مره) واستخدامه إلى العظام تريلوريات المغمورة في 1x التلفزيونية (+ 2 ٪) في طبق بيتري.
    7. باستخدام ماصه المصلية 10 مل ، ماصه صعودا وهبوطا (~ 10x) لطرد بشكل موحد من الخلايا من العظام ، وبعد سحق العظام.
    8. وضع مصفاه الخلية 40 μm علي أنبوب مخروطي 50 mL. قبل الرطب سطح المصفاة عن طريق تمرير 1 مل من 1x تلفزيوني (+ 2 ٪ من الصواريخ).
    9. حصاد الخلية المشتقة من نخاع العظم التعليق من الخطوة 2.2.7 وتمريرها من خلال سطح ما قبل الرطب من مصفاه الخلية لأزاله الحطام العظام.
    10. كرر الخطوات 2.2.6 من خلال 2.2.9 حتى تصبح جميع مواد العظام بيضاء كعلامة ان معظم خلايا نخاع العظم يتم جمعها في أنبوب مخروطي 50 mL.
      ملاحظه: وغالبا ما يستغرق 2 50 مل أنابيب مخروطيه الشكل لكل ماوس لجمع كل الخلايا المشتقة من نخاع العظم.
    11. الطرد المركزي الأنابيب المخروطية 50 mL التي تحتوي علي خلايا نخاع العظم المشتقة لمده 5 دقائق في 500 x g و RT.
    12. أزاله الفائقة. أعاده تعليق الخلايا المشتقة من نخاع العظم (الجمع بين محتويات كل من أنابيب 50 mL) في 5 مل من 1x تلفزيوني (+ 2 ٪) كحجم النهائي والحفاظ علي الخلايا في RT.
  3. حصاد خلايا نخاع العظم الأحادي النواة.
    1. أضافه 5 مل من الكثافة المتدرج المتوسطة (اي ، Ficoll) إلى أنبوب مخروطي 15 مل. ثم أضافه ببطء 5 مل من تعليق خليه نخاع العظم. تاكد من بقاء الخلايا كطبقه فوق متوسط تدرج الكثافة.
    2. الطرد المركزي لمده 30 دقيقه في 500 x g و RT. لا تستخدم الفرامل في جهاز الطرد المركزي. تاكد من ان الطرد المركزي هو في ادني تسارع ممكن (علي سبيل المثال ، 1 تسارع و 0 التباطؤ).
    3. حصاد الواجهة الوسطي للخلايا أحاديه النوى (اللون الأبيض) بعد طرد إلى أنبوب مخروطي 15 مل جديد.
    4. اغسل الخلايا ، التي تحصد من متوسط التدرج الكثافة ، مع 5 مل من 1x تلفزيوني (+ 2 ٪). الطرد المركزي لمده 5 دقائق في 500 x g و 4 ° c. أزاله الفائقة.
    5. كرر الخطوة 2-3.
    6. أعاده تعليق محتويات الخلية من الأنبوب في 300 μL من 1x التلفزيونية (+ 2 ٪). Aliquot 10 μL من تعليق الخلية للتحكم غير ملون أو أحاديه اللون في أنبوب FACS.
  4. حصاد LSK HSPCs من خلايا نخاع العظم الأحادي النواة.
    1. جعل كوكتيل من البيوتين-الأجسام المضادة عن طريق خلط 3 μL لكل عينه من الأجسام المضادة التالية: Gr1 ، Cd8a ، Cd5 ، B220 ، Ter119. أضف 15 μL من خليط البيوتين-الأجسام المضادة إلى 300 μL من خلايا نخاع العظم أحاديه النواة.
      ملاحظه: ويستخدم كل الأجسام المضادة في 1:100 التخفيف.
    2. احتضان الخلايا مع كوكتيل البيوتين-الأجسام المضادة لمده 30 دقيقه في 4 درجه مئوية مع الانفعالات لتجنب تكتل الخلايا في الجزء السفلي من الأنبوب.
    3. أضافه 10 مل من قبل المبردة 1x تلفزيوني (+ 2 ٪) إلى خلايا مختلطة مع كوكتيل البيوتين-الأجسام المضادة.
    4. الطرد المركزي أنبوب لمده 5 دقائق في 500 x g و 4 ° c. تجاهل ماده طافي وأعاده التعليق علي بيليه الخلية في 400 μl من 1x تلفزيوني (+ 2 ٪). Aliquot 10 μL ل العقديات-التحكم في لون واحد.
    5. لفتره وجيزة دوامه الخرز المضادة البيوتين (جدول المواد) قبل الاستخدام. أضافه 80 μL من الخرز المجهري لكل عينه خليه (من 400 μL). تخلط جيدا واحتضان لمده 20 دقيقه اضافيه في 4 درجه مئوية ، مع الانفعالات.
    6. أضافه 10 مل من قبل المبردة 1x التلفزيونية (+ 2 ٪) إلى الخلايا. الطرد المركزي أنبوب لمده 5 دقائق في 500 x g و 4 ° c.
    7. تجاهل ماده طافي وأعاده التعليق علي بيليه الخلية في 1 مل من 1x تلفزيوني (+ 2 ٪). يخزن عند درجه حرارة 4 درجات مئوية اثناء اعداد وحده الفصل المغناطيسي.
    8. ضع عمود (جدول المواد) في المجال المغناطيسي لفاصل الفرز المغناطيسي للخلايا المساعدة (mac) عند درجه حرارة 4 درجات مئوية. اعداد عمود للفصل المغناطيسي عن طريق الشطف مع 3 مل من 1x التلفزيونية (+ 2 ٪) تحت تدفق الجاذبية في 4 درجه مئوية.
    9. أضافه تعليق الخلية من الخطوة 2.4.7 إلى عمود ما قبل الرطب في 4 درجه مئوية. السماح للخلايا لتمرير من خلال العمود في 4 درجه مئوية وجمع النفايات السائلة في أنبوب مخروطي 15 مل.
      ملاحظه: يمثل الجزء الذي به خلايا غير مسماه في هذه النفايات الخلايا السالبة السلالة المخصبة.
    10. غسل العمود مع 3 مل من 1x التلفزيونية (+ 2 ٪) في 4 درجه مئوية. كرر 3x. جمع التدفق من خلال والاحتفاظ بها في 4 درجه مئوية. عد الخلايا القابلة للحياة التي لا يمكن التملص منها بواسطة الاستبعاد الأزرق التريبين باستخدام مقياس الكريات الدموية.
    11. الطرد المركزي 15 مل أنبوب مخروطي الذي يحتوي علي تدفق من خلال لمده 5 دقائق في 500 x g و 4 ° c. تجاهل الخارقة. أعاده التعليق الخلايا في 0.5 mL من 1x تلفزيوني (+ 2% الإرسال) ونقل المحتويات إلى أنبوب FACS.
    12. أضف 24 μL من كوكتيل الأجسام المضادة LSK إلىكل 10 خلايا . يحتوي كوكتيل الأجسام المضادة علي تركيز متساو من الأجسام المضادة 450-العقديات ، والأجسام المضادة CY7 Sca1 ، والأجسام المضادة APC-c-Kit.
    13. احتضان ل 1 ح في 4 درجه مئوية مع الانفعالات تحت الظلام (مغطاه إحباط القصدير).
    14. أضافه 3 مل من 1x التلفزيونية (+ 2% المنفذة) إلى أنبوب FACS. الطرد المركزي لمده 5 دقائق في 500 x g و 4 ° c. تجاهل الخارقة.
    15. أعاده تعليق الخلايا الموسومة بالأجسام المضادة في 1 مل من 1x تلفزيوني (+ 2% المنفذة). أضافه 1 μL من 1 ملغ/مل بروبيديوم يوديد لتعليق الخلية فقط قبل الفرز.
    16. تصفيه محتويات أنبوب FACS باستخدام مصفاه 40 μm الحق قبل فرز الخلايا LSK.
    17. جمع خلايا LSK ، عبر FACS الفرز ، في أنبوب 1.5 mL التي تحتوي علي 0.5 mL من وسائل الاعلام كامله تستكمل مع 2 مم الجلوتامين ، 3 ملغ/مل الجلوكوز ، 1 مم pyruvate ، 1x الجلطات (TPO) ، 1x عامل الخلايا الجذعية(الصندوق الدائم) ، 0.5 x البنسلين/العقديات (P/S) ، pH 7.4

3. التنفس الميتوكوندريا واختبارات تحلل من LSK HSPCs

  1. LSK البذر في لوحه الفحص
    1. الخلايا الطاردة المركزية LSK من الخطوة 2.4.17 لمده 5 دقائق في 500 x g و RT. تجاهل supernatant.
    2. أعاده تعليق الخلايا في الوسائط الكاملة إلى التركيز النهائي ما لا يقل عن 70,000 خليه/40 μL.
    3. البذور محتويات وسائل الاعلام 40 μL (التي تحتوي علي 70,000 الخلايا) في لوحه المغلفة PLL 8-حسنا من الخطوة 2. ترك كل الآبار الزاوية فارغه.
    4. الطرد المركزي لمده 1 دقيقه في 450 x g و RT. لا تقم بتطبيق الفرامل. تاكد من ان الخلايا المرفقة إلى أسفل جيدا باستخدام المجهر المقلوب.
    5. أضافه 135 μL من وسائل الاعلام الكاملة إلى الخلايا في كل بئر لحجم النهائي من 175 μL. أضافه 175 μL من وسائل الاعلام الكاملة إلى زوايا 2 من لوحه والفراغات.
    6. احتضان الخلايا في الحاضنة غير المشتركة2 ل 2 ح في 37 درجه مئوية.
    7. اعداد برنامج لأضافه الادويه إلى كل بئر من لوحه بئر في محلل باستخدام مقياس الموصوفة في الجدول 2 (اختبار الإجهاد الميتوكوندريا) والجدول 3 (اختبار الإجهاد تحلل).
      ملاحظه: بينما يتم احتضان الخلايا ، بدوره علي الصك وتاكد من انه في 37 درجه مئوية.
  2. اختبار الإجهاد المتقدريه
    1. اعداد حلول الأسهم 45 μM من اوليغميسين ، 50 μM السيانيد كاربونريل 4-(تريفلونوميثوكسي) فينيلهيدرازون (FCCP) و 25 μM الأسهم حلول rotenone/انتيميسين ا. لاعداد 45 μM الحل الأسهم اوليغميسين ، حل محتويات الحقيبة المتاحة تجاريا في 280 μL من وسائل الاعلام الكاملة. لاعداد 50 μM FCCP حل الأسهم ، وأذابه محتويات الحقيبة المتاحة تجاريا في 288 μL من وسائل الاعلام الكاملة. لاعداد 25 μM rotenone/انتيمايسين A الحل الأسهم ، وأذابه محتويات الحقيبة المتاحة تجاريا في 216 μL من وسائل الاعلام الكاملة.
    2. خذ خرطوشه الاستشعار في لوحه الاداه المساعدة من الحاضنة وتحميل الموانئ (A ، B ، و C) بحيث يكون لكل بئر التركيز النهائي من 2 μM اوليغميسين ، 1.5 μM FCCP ، و 0.5 μM من rotenone/انتيمايسين A حسب الحاجة ، بعد مقاييس التخفيف الموصوفة في الجدول 4 (لمعدل استهلاك الأكسجين).
    3. أزاله الغطاء من خرطوشه الاستشعار تجميعها في لوحه الاداه المساعدة ووضعه علي علبه الاداات. بدء المعايرة التي سوف يستغرق 20 دقيقه.
    4. بعد المعايرة ، وأزاله لوحه الاداه المساعدة واستبدالها مع لوحه الفحص التي تحتوي علي خلايا LSK ، والتي يتم التزام بها الآن إلى أسفل البئر.
    5. اضغط علي " متابعه " لبدء تشغيل البرنامج الموضح في الجدول 2. بعد الانتهاء من البرنامج ، واسترداد البيانات وتحليلها باستخدام برنامج "سطح المكتب الموجه".
      ملاحظه: يمكن رسم البيانات التي تم إنشاؤها من اختبارات التدفق خارج الخلية باستخدام مؤامرة نقطه من برنامج "سطح المكتب الموجه" أو تصديرها إلى برنامج إحصائيات علي شبكه الإنترنت.
  3. اختبار الإجهاد جليكولسيس
    1. أعاده تشكيل الجلوكوز في 300 μL (100 mM) ، اوليغميسين في 288 μL (50 μM) ، 2-د الجلوكوز (2-DG) في 300 μL (500 mM) من وسائل الاعلام الكاملة من الحقيبة المتاحة تجاريا.
    2. ماصه بلطف صعودا وهبوطا (~ 10x) لأذابه المركبات. الدوامة 2-DG لمده 1 دقيقه تقريبا لضمان حل السليم في وسائل الاعلام.
    3. أزاله خرطوشه الاستشعار من الحاضنة. تحميل المنافذ من A إلى C التالية مقاييس التخفيف الموصوفة في الجدول 5 للحصول علي تركيز نهائي من الجلوكوز 10 ملم ، 2 μM اوليغميسين ، و 50 mm 2-DG.
    4. كرر الخطوات 3-2-3 و 3-2.
    5. اضغط علي " متابعه " لبدء تشغيل البرنامج الموضح في الجدول 3. بعد الانتهاء من البرنامج ، واسترداد البيانات وتحليلها باستخدام برنامج "سطح المكتب الموجه".

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

طريقه استخراج لدينا يسمح لنا لحصاد ما يصل إلى ~ 80,000 LSK HSPCs لكل ماوس. وقد تحسنت صلاحيه واعداد خلايا LSK مع طريقتنا ، لأننا: (1) نخاع العظم مجتمعه من الأطراف العلوية والسفلية ، عظام الورك ، القص ، القفص الصدري ، والعمود الفقري ، (2) تجنب استخدام الخلية الحمراء تحلل العازلة التي من شانها زيادة الخلية الموت والتكتل ، (3 استخدام الفصل المتوسط الكثافة للخلايا أحاديه النواة ، و (4) تجنب استخدام العازلة قبل المبردة التي من شانها ان تسبب فقدان خلايا الفائدة في كتل.

علي الرغم من ان تحليل تدفق خارج...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

هنا ، ونحن نظهر العزلة من الحد الأقصى لكميه نقيه وقابله للحياة murine LSK HSPCs السكان ، فضلا عن قياس تحللها والتنفس الميتوكوندريا مع محلل تدفق خارج الخلية. وعلي وجه التحديد ، يتغلب البروتوكول علي المسائل التقنية التالية لاستخدام النظام الخاص ب LSK HSPCs: ط) التردد المنخفض LSK HSPCs في نخاع العظم murine14، ii) انخفاض النشاط الأيضي القاعدي من Lsk hspcs26، III) هشاشة lsk hspcs27، والرابع) عدم التزام lsk hspcs إلى السفن الثقافية15

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

وليس لدي المؤلفين ما يفصحون عنه.

شكر وتقدير

ويدعم هذا العمل جزئيا الدعم التمويلي المقدم من المعاهد الوطنية للصحة (HL131645 ، CA016058) ، ومؤسسه سانت بالدريك ، ومؤسسه بيلوفونيا.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
0.01٪ (ث / حجم) محلول بولي L-lysineSigmaP8920يستخدم لمرفق LSK
40 & micro ؛ مصفاة الخلايا mفيشر Scientific22-363-547تستخدم لترشيح الخلايا بعد تكسير العظام
المضادة للبيوتين MicroBeadsMiltenyi130-090-485تستخدم لفصل الخط
البيوتين الفئران المضادة للفأر CD45R / B220 استنساخ RA3-6B2BD Biosciences553086تستخدم لفصل الخط
البيوتين الفئران المضادة للفأر CD5 استنساخ 53-7.3BD Biosciences553019المستخدمة في Lin- فصل
البيوتين الفئران المضادة للفأر CD8a استنساخ 53-6.7BD Biosciences553029يستخدم لفصل الخط
البيوتين الفئران المضادة للفأر Ly-6G و Ly-6C استنساخ RB6-8C5BD Biosciences553125المستخدمة في فصل الخط
البيوتين الفئران المضادة للفأر TER-119 / خلايا الكريات الحمراء استنساخ TER-119BD Biosciences553672المستخدمة في فصل
الخط CD117 (c-Kit) الجسم المضاد أحادي النسيلة (2B8) ، APCeBioscience17-1171-83تستخدم لفرز LSK
Falcon 15 مل أنابيب الطرد المركزي المخروطيةFalcon-Fischer Scientific14-959-53Aالمستخدمة في عزل الخلايا
Falcon 50 مل أنابيب الطرد المركزي المخروطيةFalcon-Fischer Scientific14-432-22تستخدم في عزل الخلايا
Falcon أنابيب البولي بروبلين المستديرةFalcon-Fischer Scientific14-959-11Aالمستخدمة ل فرز LSK
مصل الأبقار الجنينيNeuromicsFBS001-HIالمستخدم في FACS buffer
Histopaque-1083Sigma10831يستخدم لفصل التدرج الفيكول
L-glutamine 100xFisher Scientific25-030-081يستخدم لوسائط الفحص
LS العمودMiltenyi130-042-401يستخدم لفصل Lin
- فصل Ly-6A / E (Sca-1) أحادي النسيلة الجسم المضاد (D7) ، PE-Cyanine7eBioscience25-5981-82يستخدم لفرز LSK
عامل الخلايا الجذعية للفئران (SCF)PeproTech250-03-100UGيستخدم لوسائط الفحص
الفئران ثرومبوبويتين (TPO)PeproTech315-14-100UGالمستخدم في وسائط الفحص
PBS 1٪Fisher ScientificSH3002802المستخدم في FACS العازلة
Penicillin-Streptomycin ( 10,000 وحدة / مل)15140122فيشر العلميالمستخدمة في وسائط الفحص
بروبيديوم يوديدفيشرالعلمية P1304MPالمستخدمة لفرز LSK
فرس البحر XFp لثقافة الخلايا الصفيحة الصغيرةAgilent Technologies103025-100المستخدمة في بذر LSK
بيروفات الصوديوم (100 مل)11360070ThermoFisherالمستخدمة في وسائط الفحص
Streptavidin eFluor 450 مترافقeBioscience48-4317-82يستخدم لفرز LSK
XF CaliberrantAgilent Technologies100840-000تستخدم لموازنة الخرطوشة
وسائط XFAgilent Technologies103575-100تستخدم لوسائط الفحص
XFp مجموعة اختبار إجهاد تحلل السكرAgilent Technologies103017100أدوية لاختبار إجهاد تحلل السكر
XFp الميتوكوندريا طقم اختبار الإجهادأدوية 103010100 Agilent Technologiesلاختبار إجهاد الميتوكوندريا
خرطوشة مستشعر XFpAgilent Technologies103022-100تستخدم لاختبار تحلل السكر وإجهاد الميتوكوندريا
القاع

المراجع

  1. Dharampuriya, P. R., et al. Tracking the origin, development, and differentiation of hematopoietic stem cells. Current Opinion in Cell Biology. 49, 108-115 (2017).
  2. Wilkinson, A. C., Yamazaki, S. The hematopoietic stem cell diet. International Journal of Hematology. 107, 634-641 (2018).
  3. Kohli, L., Passegue, E. Surviving change: the metabolic journey of hematopoietic stem cells. Trends in Cell Biology. 24, 479-487 (2014).
  4. Abdel-Wahab, O., Levine, R. L. Metabolism and the leukemic stem cell. The Journal of Experimental Medicine. 207, 677-680 (2010).
  5. Papa, L., Djedaini, M., Hoffman, R. Mitochondrial Role in Stemness and Differentiation of Hematopoietic Stem Cells. Stem Cells International. 2019, 4067162(2019).
  6. Vannini, N., et al. Specification of haematopoietic stem cell fate via modulation of mitochondrial activity. Nature Communication. 7, 13125(2016).
  7. Anso, E., et al. The mitochondrial respiratory chain is essential for haematopoietic stem cell function. Nature Cell Biology. 19, 614-625 (2017).
  8. Wanet, A., Arnould, T., Najimi, M., Renard, P. Connecting Mitochondria, Metabolism, and Stem Cell Fate. Stem Cells and Development. 24, 1957-1971 (2015).
  9. Maryanovich, M., et al. An MTCH2 pathway repressing mitochondria metabolism regulates haematopoietic stem cell fate. Nature Communication. 6, 7901(2015).
  10. Suda, T., Takubo, K., Semenza, G. L. Metabolic regulation of hematopoietic stem cells in the hypoxic niche. Cell Stem Cell. 9, 298-310 (2011).
  11. Zhang, C. C., Sadek, H. A. Hypoxia and metabolic properties of hematopoietic stem cells. Antioxidants & Redox Signaling. 20, 1891-1901 (2014).
  12. Snoeck, H. W. Mitochondrial regulation of hematopoietic stem cells. Current Opinion in Cell Biology. 49, 91-98 (2017).
  13. Wu, M., et al. Multiparameter metabolic analysis reveals a close link between attenuated mitochondrial bioenergetic function and enhanced glycolysis dependency in human tumor cells. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 292, 125-136 (2007).
  14. Chen, J., et al. Enrichment of hematopoietic stem cells with SLAM and LSK markers for the detection of hematopoietic stem cell function in normal and Trp53 null mice. Experimental Hematology. 36, 1236-1243 (2008).
  15. Jung, Y., et al. Hematopoietic stem cells regulate mesenchymal stromal cell induction into osteoblasts thereby participating in the formation of the stem cell niche. Stem Cells. 26, 2042-2051 (2008).
  16. Masuda, S., Li, M., Izpisua Belmonte, J. C. Niche-less maintenance of HSCs by 2i. Cell Research. 23, 458-459 (2013).
  17. Anderson, H., et al. Hematopoietic stem cells develop in the absence of endothelial cadherin 5 expression. Blood. 126, 2811-2820 (2015).
  18. Lo Celso, C., Scadden, D. Isolation and transplantation of hematopoietic stem cells (HSCs). Journal of Visualized Experiment. (157), (2007).
  19. Van Wyngene, L., Vandewalle, J., Libert, C. Reprogramming of basic metabolic pathways in microbial sepsis: therapeutic targets at last. EMBO Molecular Medicine. 10, (2018).
  20. Olson, K. A., Schell, J. C., Rutter, J. Pyruvate and Metabolic Flexibility: Illuminating a Path Toward Selective Cancer Therapies. Trends in Biochemical Sciences. 41, 219-230 (2016).
  21. Halestrap, A. P., Wilson, M. C. The monocarboxylate transporter family--role and regulation. IUBMB Life. 64, 109-119 (2012).
  22. Kim, A. Mitochondria in Cancer Energy Metabolism: Culprits or Bystanders. Toxicological Research. 31, 323-330 (2015).
  23. Fosslien, E. Mitochondrial medicine--molecular pathology of defective oxidative phosphorylation. Annals of Clinical & Laboratory Science. 31 (1), 25-67 (2001).
  24. Wick, A. N., Nakada, H. I., Wolfe, J. B. Localization of the primary metabolic block produced by 2-deoxyglucose. The Journal of Biological Chemistry. 224 (2), 963-969 (1957).
  25. Linnett, P. E., Beechey, R. B. Inhibitors of the ATP synthetase systems. Methods in Enzymology. 55, 472-518 (1979).
  26. Rimmele, P., et al. Mitochondrial metabolism in hematopoietic stem cells requires functional FOXO3. EMBO Reports. 16, 1164-1176 (2015).
  27. Riviere, I., Dunbar, C. E., Sadelain, M. Hematopoietic stem cell engineering at a crossroads. Blood. 119, 1107-1116 (2012).
  28. Ito, K., Suda, T. Metabolic requirements for the maintenance of self-renewing stem cells. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (4), 243-256 (2014).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

الخلايا الجذعية والسلفية المكونة للدمتحليل التنفس الأيضيقياس تحلل السكرتحليل التدفق خارج الخليةعزل نخاع العظمفرز الخلايا مغناطيسياًقياس التدفق الخلويمعدل استهلاك الأكسجينمعدل التحمض خارج الخليةآبار مطلية بـ PLL
تحليل استقلاب الخلايا الجذعية للدم
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.